CD4 + T细胞是浸润眼眶组织的最丰富的淋巴细胞。 在GO中，浸润眼外肌肉、泪腺和脂肪组织的免疫细胞主要是CD4+T细胞， 43 ,44 产生细胞因子和趋化因子，包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子和C-X-C基序配体。 45 ,46 我们用免疫荧光染色法对GO患者的眼眶组织进行检测，证实CD4+T细胞明显高于CD8+T细胞(P<0.0 5)。 P =4.5×10 −8 、学生的 t 测试，补充图。 1 ).
基于液滴的CD4的scRNA-seq + Go和GH患者的T细胞 为了进一步研究go中的CD4+T细胞，我们进行了基于液滴的scrna-seq检测。 47 患者外周血CD4+T细胞，包括治疗-天真GH患者(未接受治疗的新诊断GH患者) n =3)，治疗-天真的GO患者(未接受治疗的初诊GO患者)( n =6)，以及治疗撤药的Go患者( n =4)(补充表格 1 –2 )。在QC之后， 48 从85,265个细胞中获得了18,474个独特的转录本，从中可以检测到1172个基因(补充表) 3 ).
为了识别与GO进展相关的特定CD4+T细胞类型，我们合并了所有治疗数据--天真的Go( n =6)和GH( n =3)患者并进行了基于图形的聚类(图)。 1A )。T-SNE分析确定了22个聚类，其中大部分在多个患者之间共享(图1)。 1B 、补充图。 2 –4 )。根据标记基因在每个聚类和标准谱系标记中的表达， 49 ,50 我们鉴定了6种CD4+T细胞类型，主要代表中央记忆性CD4+T细胞(CT1)、调节性T细胞(CT2)、滤泡CD4+T细胞(CT3)、Th17细胞(CT4)、中间分化CTL(CT5)和终末效应CTL(CT6)。 16 ,51 (无花果) 1B，c ；补充图。 5 ；补充档案 1 )。其余细胞标记为未知细胞(4.48%)。16例独立患者CD4+T细胞流式细胞仪分析证实上述细胞类型及其相应频率。 52 (无花果) 1D 有关上述单元格类型的单元格标记和频率的详细信息，请参阅补充表 4 –6 ).
图1 Go特异性T细胞类型的鉴定：一种新的具有趋化和炎症特性的CD4+CTL亚型。 a 总体设计流程图。 b 应用图形聚类和t-SNE算法对6例GO和3例GH患者外周血中的59,795个CD4+T细胞进行聚类分析。用同一配色方案表示的簇被标记为推断的细胞类型。右下角以绿色和蓝色表示的簇被标记为疾病类型。 c 从单细胞分析的热图通过前10个基因的表达数据，每组差异表达的细胞分为细胞类型(以顶部的彩色条表示)。每种细胞类型的关键基因显示在右侧边缘。 d T-SNE图所示的59,795个CD4+T细胞端粒效应细胞毒性T细胞(CT6)典型谱系标记的表达水平。 e GSEA对Go和GH在CT6转录组中所指示的基因序列进行了分析。阳性富集评分与GO组呈正相关。归一化浓缩分数
GO特异性T细胞型：一种新的具有趋化和炎症性质的炎症性CD4+CTL亚型 虽然大多数细胞类型在GO和GH之间有很大的重叠，但CT6表现出疾病特异性亚型(图1)。 1B ，补充图。 7 )。CT5和CT6均属于CD4+CTL，CT6具有独特的基因图谱，包括KLRG 1、GZMB、PRF 1、GNLY、CX3CR1、FGFBP 2、CCl 4、CCL 5和IFNG，提示CT6具有新的趋化和炎症特性。 1E ，补充图。 5 )。因此，我们进行了CT6的GSEA，基因本体分析显示GO患者的细胞杀伤、白细胞趋化和炎症反应是最丰富的特征(图一)。 1F ，补充图。 8 ，补充档案 2 )。标记基因集进一步支持增加炎症反应的CT6在GO(补充图)。 9 )。因此，我们发现了一种新的CD4+CTL亚型，其特征是趋化性和炎症性。
免疫组化证实颗粒酶释放CD4 + GO眼眶组织中的CTL 在GO中，对炎症性CD4+CTL亚型中特异性转录本的更详细的共表达分析表明，细胞毒性标志基因之间存在高度的相关性(图一)。 2A )。13例独立患者(6例GH患者和7例GO患者)外周血单个核细胞(PBMC)进一步流式细胞仪分析证实，GO患者CD4+T细胞中FGFBP 2、GNLY、GZMB和PRF 1蛋白水平显著升高(P<0.0 5)。 P 分别=0.024、0.014、0.024和0.022，学生的 t 试验 2B ，补充图。 10 )。鉴于GZMB在GO患者外周血单个核细胞中的表达明显高于GH患者，我们进一步对GO和IP患者的眼眶组织进行了免疫荧光分析。我们证实GZMB在GO患者CD4+T细胞中的表达水平高于IP患者( P =0.00077，图1。 2C ，补充图。 11 )，提示这些细胞对GO具有高度的特异性，可能在GO的发病机制中起一定作用。
图2 Go特异性CD4+T细胞类型主要表现为细胞毒性、趋化性和炎症反应. a Pearson与CT6细胞毒性表达的相关性。Pearson相关图显示前100位CT6特异性转录本在GO中的共同表达。黑色实线显示一组转录本呈高度相关；这些转录本的列表显示在右边的文本框中，恒星突出显示具有细胞毒性功能的基因。 b 流式细胞术显示细胞毒性分子FGFBP 2、GNLY、GZMB和PRF 1在CD4+T细胞中的比例( n =7 in go；及 n =6(GH)。方框分别与正中和IQR相对应，并包括各个数据点。c 以GO患者和炎性假瘤(IP)眼眶组织为代表，采用荧光多重免疫组织化学方法，显示CD4和GZMB共表达。(1)全眶组织的低放大率图像。(2)GZMB占GZMB比例的10×放大率GZMB在GO患者CD4+T细胞中的比例高于IP患者。(三)量化GZMB在CD4+细胞中的比例 n =6个独立案件，包括代表性案件。误差条为均值±扫描电镜。数据点，每一个代表一个情况，用实心圆表示。(IV-VII)图像40×放大一条切片染色DAPI，CD4和GZMB，说明CD4和GZMB(小箭头)的共同表达。其他样品的信息见附图。 11 . d CT6在6例GO和3例GH患者中按炎症、趋化性和细胞毒性相关基因分级聚类。热图显示，每个基因的比例平均表达在每个病人的所有细胞上。 e Go和GH中CT6和CT4细胞间的选择性配体受体相互作用。黑色字体和灰色字体分别代表CT6和CT4的配体或受体。 P 值由圆圈大小表示。CT6和CT4中相互作用分子平均表达水平的平均值用颜色来表示。
新的炎症性CD4+CTL亚型是GO患者趋化因子和炎性细胞因子的主要来源。 除上述细胞毒性外，GO特异性CD4+CTL亚型表达较高水平的趋化和炎症分子，包括CCl 4、CCL 5、CXCL 8、CX3CR1、IL1B和IFNG(图1)。 二维空间 )。流式细胞术显示，GO特异性CD4+CTL中CX3CR1和IFNG的表达水平明显高于其他非特异性CD4+CTL(CT5)。 P =0.061和0.016；附图。 12 )。相互作用分析 52 结果表明，Go中的促炎性CD4+CTL和Th17细胞(CT4)分别表达趋化配体CCL 3、CCL 5和CCL 27及受体CCR 3和CCR 10。 2E )。免疫调节和细胞毒对也在GO中富集。 2E )。由于Th1样细胞因子被认为在维持眼眶炎症和重塑中起着至关重要的作用， 2 ,21 我们研究了Th1细胞的典型基因表达，揭示了Tbx 21、Eomes、IFNG和GZMB在GO特异性CD4+CTL中的独特表达。 13 )。我们的数据表明，GO特异性CD4+CTL亚型是围棋中启动和延续自身免疫炎症级联的趋化因子和促炎细胞因子的主要来源。
Go复发与新的炎症性CD4+CTL亚型中趋化分子和细胞毒性分子的增加有关。 由于细胞毒性、趋化性和炎症在GO进展中的潜在作用，我们观察了甲基强的松龙(MP)对4例GO患者治疗前后CD4+T细胞的scRNA-Seq对这三种途径的治疗作用(图)。 3A 、补充图。 14 –15 ，补充档案 3 )。我们观察到，MP治疗后，细胞毒性、趋化性和炎症相关基因的水平在炎症性CD4+CTL亚型中明显降低(如图所示)。 3B )。值得注意的是，4例GO患者中有1例(A04)对MP反应不佳，停药4个月后复发。我们分析了该患者的促炎症CD4+CTL亚型，发现MP戒断后趋化性和细胞毒性相关分子水平明显升高，尽管炎症相关分子有明显改善(图一)。 3B ).
图3 Go复发与治疗后炎性CD4+CTL趋化性和细胞毒性分子水平增高有关。 a 对4例GO患者治疗前后的50,082个CD4+T细胞应用基于图聚类和t-SNE算法。 n =8)。用同一配色方案表示的簇被标记为推断的细胞类型。治疗前和治疗后分别标记右上角绿色和蓝色的簇。 b 小提琴图显示了4例GO患者和1例复发GO患者(A04)治疗前后与CT6炎症、趋化性和细胞毒性有关的标记基因的单细胞表达模式。这些形状代表了基于基因表达的细胞的分布。
功能性CD4 + CTL包含在CD4中 + KLRG 1 + T细胞群 表面蛋白标记KLRG 1定位于CD8+T细胞和NK细胞， 53 ,54 CD4+CTL高表达。 1D P =0.0314，曼-惠特尼检验，图. 4A )。流式细胞术分析CD4+KLRG 1+T细胞也证实了用scRNA-Seq(辅助表)检测CD4+CTL的频率。 4 –5 ).
图4 CD4+KLRG 1+T细胞中含有功能CD4+CTL。 a 显示KLRG 1+CD4+T细胞比例(左) n n =10(HC)。与正中和极大值对应的绘图中心和方框，并包括各个数据点。典型的流式细胞仪图(中、右)CD4+KLRG 1+T细胞门控于CD4+T细胞，分别来自GO24和HC 13。数字表示每个矩形门中单元格的百分比。b CD45RA+(圆形)和CD45RO+(三角形)细胞分别在CD4+KLRG 1+(Green)和CD4+KLRG 1−(蓝色)T细胞中所占的百分比。 n =8 in go)。数据是平均值±SEMs和单个值。CD 45 RA+和CD45RO+细胞在CD+KLRG 1+和CD4+KLRG 1−T细胞中的代表性流式细胞术图(中、右侧)。数字表示每个矩形门中单元格的百分比。c 盒形图(左)显示CD4+KLRG 1+(绿色)和CD4+KLRG 1−(蓝色)T细胞中GZMB(上)和PRF 1(底部)的比值。 n =10英寸围棋)。分别与正中点和极值点对应的地块中心和方框的盒形图，包括单独的数据点。GZMB(上)和PRF 1(底部)分别在GO15和GO13的CD4+KLRG 1+(Green)和CD4+KLRG 1−(蓝色)T细胞中的代表直方图(右)。d 共聚焦显微镜检测CD4和GZMB共表达(小箭头)的典型例子：(1)Hoechst染色，(2)CD4，(Iii)GZMB，(Iv)合并GO患者CD4+KLRG 1+T细胞。标尺20μm。 e BAR图显示GO患者CD4+KLRG 1+T细胞(绿色)和CD4+幼稚T细胞(蓝色)ThPOK(上)和Runx 3(底部)的水平( n =13 in go；及 n =10(HC)。误差条显示扫描电镜。 f BAR图显示Go患者经空白(对照组，斜杠)和抗人CD3(填充)抗体治疗6h后CD4+KLRG 1+T细胞(Green)和CD4+KLRG 1−T细胞(蓝色)中CD107a的百分比。这些数据代表了至少三个生物复制体。
CD4+CTL已在分化的T细胞亚群中被发现，如效应记忆T细胞。 46 ,55 同样，我们的结果表明，GO患者CD4+KLRG 1+T细胞表现为CD45RO+记忆表型，而不是CD45RA+天真型(72.99%±3.393%，28.4%±3.566%)。 P < 0.0001, Student’s t 试验 4B )。与CD4+KLRG 1−T细胞相比，CD4+KLRG 1+T细胞的细胞毒分子GZMB和PRF 1表达显著增加(分别为0.365%(0.365%，0.2975%，0.885%)和41.2%(IQR：31.38%，53.95%)。 P < 0.0001; 0.465% (IQR: 0.062%, 1.298%) vs 27.4% (IQR: 18.45%, 58.05%) for PRF1, P =0.0022，曼-惠特尼检验，图. 4C )。其次，我们应用免疫荧光分析证实GZMB存在于CD4+KLRG 1+T细胞中(如图所示)。 4D )。流式细胞仪检测显示，GO患者CD4+KLRG 1+T细胞中CX3CR1、CCl 4、CCL 5等趋化分子水平及炎症分子IFNG水平均高于CD4+KLRG 1−T细胞(附图)。 16 ).
据报道，转录因子Runx 3的表达增加和ThPOK的缺失是CD4+CTL在小鼠体内的重新编程和成熟所必需的。 56 同样，我们的结果显示，GO患者CD4+KLRG 1+T细胞表达较低。 P =0.0088，学生的 t 测试)，但Runx 3的高表达( P =0.0151，学生的 t (比正常的HC CD4+T细胞(CD4+T细胞) 30 (用Miltenyi人纯CD4+T细胞分离试剂盒分离，获得的细胞中>90%为CD45RA+CCR 7+)。 4E ).
此外，为了验证CD4+KLRG 1+T细胞是否具有细胞毒性分子释放功能，进行了脱颗粒实验。溶酶体相关膜糖蛋白(CD107a)定位于溶酶体，经CD8+CTL颗粒分泌后在细胞表面表达。 57 ,58 在本研究中，CD4+KLRG 1+T细胞经抗人CD3抗体体外刺激后，细胞表面CD107a表达显著增加。 P < 0.0001, Student’s t 测试图。 4F )。总体而言，GO患者CD4+KLRG 1+T细胞为功能性CD4+CTL，GZMB和PRF 1表达(CT6独特)。
CD4 + KLRG 1 + Go中的CTL表现出明显的克隆扩张。 鉴于CD4+CTL主要是在抗原暴露后产生的，例如登革热病毒暴露， 59 P =0.014， P =0.0221，曼-惠特尼检验，图. 5A，b )。具体来说，在GO标本中，在CD4+KLRG 1+CTL中，如Go11(11.13%)和GO13(34.06%)，常出现V-J重组。 5C )。某些CD4+KLRG 1+T细胞克隆的扩增可能是自身抗原暴露的特异性免疫反应。据报道，CD4+CTL在患者之间是异质性的。 16 因此，我们分析了7个GO样本中CD4+KLRG 1+CTL和天真的CD4+T细胞TCR克隆型的重叠，只有3个克隆型在CD4+CTL之间共享，178个克隆型在纯CD4+T细胞中共享(图一)。 5D ).
图5 CD4+KLRG 1+CTL在GO中表现出明显的克隆扩增。晶须图显示TCR VJ多样性(a )和均匀度( b )由CD4+KLRG 1+CTL中的Shannon熵和Gini系数(绿色， n =7)和CD4+天真T细胞(蓝色， n 来自GO患者。用扫描电镜对数据进行了统计分析。c 在Go11和GO13样品中，用Circos图说明了TRBV和TRBJ基因片段的使用和V-J重组。TRBV和TRBJ基因从低到高按顺时针顺序排列。VJ复合用彩色曲线表示，其厚度代表TCR序列中它们的频率。 d 花点显示CD4+KLRG 1+CTL中TCR克隆型重叠(核心)和个体重叠(花瓣)的数量(上，n =7)和CD4+幼稚T细胞(底部， n 分别=6)。 E-g 分离的CD4+T细胞和丝裂霉素处理的非CD4+T细胞按1：3比例与空白对照组(灰色)、25μg/mL人TSHR 289蛋白(绿色或蓝色)、25μg/mL卵清蛋白(蓝色)或10μg/mL抗人CD3(绿色)共培养24h和48h。CD 25+CD 134+( e )，GZMB+( f )和CD107a+( g )CD4+KLRG 1+CTL的比值由条形图显示，以检测TSHR特异性反应。错误栏显示扫描电镜。所有数据代表至少三个生物复制。流式细胞术测定CD4+KLRG 1+CTL中CD107a+细胞比例，对照组共培养24h和48h，TSHR 289蛋白组和抗人CD3组。数字表示每个矩形中单元格的百分比。
TSHR作为GO的主要自身抗原来源于Go与GH、GO动物模型及疾病活性与抗TSHR抗体的相关性研究。 11 ,60 ,61 ,62 为探讨CD4+KLRG 1+CTL人群中是否存在TSHR特异性T细胞，用TSHR 289进行了MLR。与对照或不相关抗原卵清蛋白(OVA)刺激相比，TSHR 289刺激24h或48h后，CD4+KLRG 1+CTLs明显激活，CD 25+CD 134+细胞水平增高，提示CD4+KLRG 1+CTL明显激活。 63 ,64 (0.45%±0.16%vs 1.527%±0.02667%) P 24小时=0.0027，0.5267%±0.1167%，1.697%±0.08333%， P =0.0012，在48小时，如图所示。 5E )。TSHR 289刺激后，CD4+KLRG 1+CTL中GZMB的表达也增加，但与对照刺激相比，由于颗粒的潜在释放，GZMB的表达无显着性差异(图二)。 5F )。与正常对照组相比，TSHR 289组24 h CD107a表达明显增强(1.91%±0.2949%，0.735%±0.2303%)，差异有显着性(P<0.05)。 P 在48h分别为2.368%±0.194%和1.295±0.2451%。 P =0.0139，学生的 t 测试图。 5G )。综上所述，CD4+KLRG 1+CTL具有克隆性扩增，含有TSHR特异性T细胞，CD4+KLRG 1+CTL具有很大的促进GO进展的潜力。
