外周2型固有淋巴样细胞在毛细支气管炎发病中的作用

采用ELISA、液芯片技术和RT-PCR检测毛细支气管炎患儿2型固有淋巴细胞(ILC2s)相关细胞因子，并探讨其与毛细支气管炎的关系。我们从湘雅医院招募了26名毛细支气管炎患儿和20名健康婴儿作为对照。血清白细胞介素-5(IL-5)[41.99(21.11)vs 25.70(19.64)]，IL-9[27.04(37.51)vs 8.30(0.54)]，IL-13[184.05(132.81)vs 121.75(176.13)]，与对照组比较，毛细支气管炎患儿IL-33[83.70(46.69)vs 11.23(55.31)]和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)[31.42(5.41)vs 28.76(2.56)]显著升高(P<0.01)。P < 0.05), while the level of IgE had no significant difference between the two groups [19.05 (14.15) vs 14.85 (20.2), P>0.05]。IL-17RB(9.83±0.35vs9.19±0.58)，TSLP(16.98±2.12vs15.07±2.25)，维甲酸受体相关孤儿受体α(7.18±0.71 vs 5.46±1.09)和反式T细胞特异性转录因子3(4.86±0.66vs4.19±0.90)在毛细支气管炎患儿中的表达显著高于对照组(P<0.05)。P < 0.05), while there was no statistical significance for suppression of tumorigenicity 2 (5.59 ± 0.68 vs 5.41 ± 0.87, P>0.05)。提示ILC2s可能在毛细支气管炎的免疫病理中起着特殊作用。

毛细支气管炎是一种常见的由不同病毒引起的急性下呼吸道感染。相当多的12个月以下的婴儿至少有一次患毛细支气管炎，其中约2-3%需要住院。1,2。温赖特C3报道说，约有20%的儿童在出生后第一年就患上毛细支气管炎，同时毛细支气管炎的发病率逐年上升。在许多国家，这是导致儿童住院的最常见原因，其中3%至7%的儿童在住院期间需要机械辅助通气。4。因此，毛细支气管炎不仅严重危害儿童的身心健康，而且给家庭和社会带来沉重的负担。

目前，毛细支气管炎的发病机制尚不清楚，可能与遗传、病毒感染、免疫和环境因素有关。呼吸道合胞病毒(RSV)是毛细支气管炎病毒感染的主要病原，不仅可直接损伤气道粘膜上皮，还可作为致敏原诱导免疫应答。最近，Frassanito等人。5采用短期全血细胞内染色法研究呼吸道合胞病毒(RSV)感染患儿的T细胞反应，为今后的临床研究提供有说服力的方法。在免疫学方面，目前报道的与毛细支气管炎发病有关的因素包括：T助手1/T助手2(Th1/Th2)失衡。6、Th177、CD4+CD 25+调节性T细胞8、CD 40/CD40L9。毛细支气管炎的临床表现和病理改变与哮喘相似。一些研究表明，12至24个月内因喘息而住院的婴儿和幼儿患哮喘的风险很高。10,11。Yanney等人12报道毛细支气管炎的主要病理改变是急性炎症所致的小气道阻塞。约34%-50%的毛细支气管炎儿童在未来会出现继发性气道高反应性(AHR)。哮喘发作期间出现的2型细胞因子也可在毛细支气管炎中发现。以上结果提示毛细支气管炎的发病机制与哮喘相似。

长期以来，人们一直认为哮喘的免疫学发病机制是Th1/Th2亚群功能和比例的失衡。13，其中Th1细胞的功能被抑制，而Th2细胞是超功能的。2000年，格雷厄姆14其他人首次提出，毛细支气管炎儿童易发展为哮喘，这可能与Th2衍生细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的高功能有关。从那时起，有关毛细支气管炎免疫机制的报道也显示，血清中IL-2和干扰素γ的表达降低，Th2来源的细胞因子(IL-4、IL-5、IL-6、IL-8和IL-10)的表达增加，提示毛细支气管炎和哮喘的发病机制也存在Th1/Th2的免疫失衡。6,15.

近年来，对哮喘免疫学发病机制的研究发现，除Th2细胞外，还存在2型固有淋巴样细胞(ILC2s)。ILC 2不依赖T细胞，在IL-25、IL-33和胸腺基质淋巴细胞生成素(Tslp)的作用下，分泌大量的2型细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-9和IL-13)，参与与2型免疫应答相关的哮喘、病毒感染和蠕虫宿主防御。16。ILC2s依赖于dna结合的转录因子抑制剂2、反式作用的T细胞特异性转录因子3(GATA-3)、维甲酸受体相关孤儿受体α(rorα)以及Notch信号。17,18,19，其中GATA-3和RORα是ILC2s的特异转录因子。由于ILC2s的表面分子还不十分清楚，研究人员主要通过以下方法来证实ILC2s的存在：ILC25R(IL-17Rb)、IL-33R(t1/st2)、ILC2s表达的tslp、以及ILC2s分泌的IL-5、IL-9、IL-13等转录因子gta-3、rorα。16,17,18,19。本研究通过检测ILC2s相关细胞因子，探讨ILC2s与毛细支气管炎发生、发展的关系，进一步了解毛细支气管炎的发病机制，为毛细支气管炎的治疗提供新的途径。

学习人口

研究对象包括26名毛细支气管炎婴儿和20名健康儿童，他们来自中南大学湘雅医院。年龄2个月~2岁，分为毛细支气管炎组和对照组。细支气管炎患者及正常对照者的临床及人口学特征见表。1。在性别和年龄方面，各组之间没有统计学差异(P>0.05，见表1)。患者和对照组的父母都签署了知情同意协议。该项研究已获湘雅医院伦理委员会批准，并已在中国临床试验登记处注册(注册编号：20151029-08)，我们根据有关指引及规例进行临床试验。

毛细支气管炎组由18名男孩和8名女孩组成，他们住院并符合美国儿科学会对毛细支气管炎的诊断标准。20。毛细支气管炎组的纳入标准：(1)2岁以下第一次喘息；(2)咳嗽、气促；(3)裂纹、副肌肉的使用和/或鼻腔扩张；(4)排除先天性心脏病、气道异物、肺结核等可引起哮喘的先天性气道畸形。

在同一时期，对照组由12名男孩和8名女孩组成。正常对照组的纳入标准：(1)在我院体检前4周内无发热和感染性疾病；(2)无喘息史、过敏史(个人和家庭过敏)史和哮喘史；(3)无自身免疫性疾病、免疫缺陷、肿瘤和心脏病；(4)不使用免疫抑制剂和激素。

样本收集和保存

毛细支气管炎患儿入院时采集外周静脉血。取2ml常规促凝管，在−20°C的冰箱中分离和保存血清，采用ELISA和液芯片技术检测IL-9、IL-5、IL-13、IL-33、IgE和TSLP的表达水平。取2ml于EDTA抗凝管，分离单个核细胞，保存在−80°C超低温冰箱中。采用实时定量RT-PCR方法检测T1/ST2、IL-17RB、TSLP、RORα和GATA-3的mRNA表达水平。对照组健康儿童的方法与上述方法相同。

实验程序

在进行实验之前，从−20°C制冷机和−80°C制冷机中取出样品，并与室温进行平衡。从冰箱取出试剂盒，在室温下平衡至少30分钟。

IgE检测

血清1ml送到湘雅医院实验室检测。

ELISA法

人TSLP酶联免疫吸附试验(R&D，美国)根据制造商的协议进行分析，并使用微型平板阅读器(R&D，美国)进行分析。

液芯片技术

如所述，采用了液态芯片技术。21检测IL-5、IL-9、IL-13和IL-33的表达.首先彻底解冻样品，然后在3000下混合离心。g持续5分钟。按规定把盘子放好，然后在4°C下孵育一夜，轻轻摇动。室温下用第二抗体阻断平板1h，每口加入25μl链霉亲和素-藻红蛋白，孵育30 min。最后将平板放入Luminex 200(美国Luminex)，保存结果并计算样品中细胞因子的浓度。

用三唑试剂从外周血单个核细胞中提取总RNA。以美国TAKARA转录第一条cDNA合成试剂盒(TAKARA)为基础，根据制造商的指令，反转录μg总RNA。根据制造商的指示，使用SYBR预混橡胶(Takara，USA)进行实时PCR.该反应是在Roche LightCycler 480序列检测系统(德国罗氏)中进行的。结果用2-δCT方法计算，允许对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行归一化，校准装置设置为1。引物对排列如下：T1/ST2：5‘-TTGTACCCAGCAATTAAA-3’和5‘-TTCAAACCACAATTAAA-3’(前向)和5‘-TTCAAACCACTAAGAGATACTCTCTA-3’(反向)；IL17RB：5‘-GTCCCAGGAACTA-3’(正向)和5‘-CTATAAGGACCACACACACACG-3’(反向)；TSLP：5‘-GAACACTTA CTCTGGGGGGAAC-3’(前向)和5‘-CTAATAAGGGATACTA-3’(前向)和5‘-CTAATAAGGACCACACACACA-3’(反向)；GATA 3：5‘-GCTGTAAGGCATCATAGAT-3’(前)和5‘-CTGTTGTTTTCCATTTGA-3’(反向)；RORα：5‘-AGTAAGCCA AGCCTTACG-3’(前)和5‘-TCCAGATATATATACACAAT-3’(反向)GAPDH：5‘-TGTTGTCATCAATCACCCG-3’和5‘-CTCAACGCATATATACTCAGCCCG-3’(反向)。

统计分析

数据用SPSS26.0统计软件进行分析。正态分布用学生t检验，结果表示为均值±标准差([(stackrel{-}{matrem{x}}]采用秩和检验，计算结果用M(QR)表示；p < 0.05 was considered significant.

毛细支气管炎组(n=26)和对照组(n=20)外周血中TSLP、T1/ST2、IL-17RB、RORα和GATA-3mRNA的表达水平

毛细支气管炎组外周血TSLP mRNA表达水平明显高于对照组(16.98±2.12 vs 15.07±2.25)。P < 0.05, see Fig. 1)。同时，毛细支气管炎组IL-17Rb(9.83±0.35)、RORα(7.18±0.71)和GATA-3(4.86±0.66)mRNA表达水平均高于对照组(9.19±0.58、5.46±1.09和4.19±0.90)，两组间差异有统计学意义(P<0.01)。P < 0.05, see Fig. 2).

毛细支气管炎组T1/ST2(IL-33R)mRNA表达水平与对照组无显着性差异(5.59±0.68vs5.41±0.87)。P>0.05，见图。2).

毛细支气管炎组(n=26)和对照组(n=20)外周血IgE、IL-5、IL-9、IL-13、IL-33和TSLP的表达

毛细支气管炎组与对照组比较差异无统计学意义[19.05(14.15)vs 14.85(20.2)，P>0.05，见图。3].

毛细支气管炎组外周血IL-5[41.99(21.11)]，IL-9[27.04(37.51)]，IL-13[184.05(132.81)]，IL-33[83.70(46.69)]和TSLP[31.42(5.41)]的表达水平均高于[25.70(19.64)，8.30(0.54)，121.75(176.13)，11.23(55.31)，对照组分别为28.76(2.56)和28.76(2.56)，两组间差异有统计学意义(P<0.05)。P < 0.05, see Figs. 4, 5和6).

研究人员发现，在哮喘患者中，白细胞介素2通过特异性转录因子rorα和gta-3进行分化和成熟，并在IL-25、IL-33和tslp的刺激下分泌大量的2型细胞因子IL-5、IL-9、IL-13。22，这是致病性的免疫学机制。ROR是ILC发育成熟的关键转录因子，可分为rorα和rorγt，rorα是IL 2发育的特异转录因子。17,18,19。同样，GATA-3在ILC 2细胞的分化和成熟过程中起着重要的作用，这种分化和成熟是由ILC 2和共同淋巴前体(CLP)产生的。已证实中电产生的GATA-3水平极低，而GATA-3高水平的表达是由ILC 2细胞表达的，被认为是一种特殊的标记。23。Klein和他的同事发现，在gta-3缺乏嵌合小鼠中，当使用IL-25和IL-33进行干预治疗时，它们的ILCs没有增加表达，不能分泌2型细胞因子。24。本研究测定毛细支气管炎患者外周血中ROR、α和GATA-3水平。结果表明，毛细支气管炎组转录因子ROR、α和GATA-3的表达明显高于正常对照组(P<0.01)。P < 0.05). Based on RORα and GATA-3 as the specific markers of ILC2, it is suggested that ILC2s increase and activate in the peripheral blood of patients with bronchiolitis.

TSLP在病原微生物的初级识别和2型适应性免疫反应的发生中起着重要的作用。此外，tslp与IL-33和IL-25的协同作用是第2型天然免疫应答的关键。25。TSLP对CD4分化的调节作用+通过诱导树突状细胞产生IL-4、IL-5、IL-13等致Th2细胞的幼稚T淋巴细胞。动物实验发现，tslp的特异性表达可以诱导AHR、气道炎症、杯状细胞增生，缺乏tslp不能产生过敏原诱导的肺炎症反应。26,27。提示TSLP参与了气道炎症性疾病的发生，这与刘的研究是一致的。28。虽然TSLP单独作用于ILC2s，产生低水平的IL-5和IL-13，但与IL-33和IL-25协同作用可促进IL-5和IL-13等2型细胞因子的产生，并参与气道炎症和AHR。

IL-25可与IL-17 Rb(IL-25R)特异性结合，促使IL-2分泌大量的2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-9和IL-13)。29。IL-25还能扩增Th2细胞介导的2型免疫应答。30...白细胞介素-25单克隆抗体在动物实验中的应用能降低AHR和气道炎症，抑制气道重塑。31.

T1/ST2是IL-33的特异性受体，在ILC2s细胞和Th2细胞表面均有表达。对大鼠的研究发现，它们的ILC 2细胞有IL-33受体，能与IL-33结合，反应迅速，产生IL-13和IL-5。32...给缺乏T细胞的实验小鼠注射IL-33可引起气道嗜酸细胞性炎症。33。IL-33作用于ILC 2细胞，刺激其分泌大量的2型细胞因子。22导致哮喘的发生。

与对照组相比，毛细支气管炎组IL-17RB、TSLP、IL-33水平明显升高。虽然他们也可以通过Th2细胞途径参与哮喘的发病，但本研究发现毛细支气管炎组的IL 2特异性转录因子RORα和GATA-3明显高于对照组，提示IL 2已被极化。因此，IL-17RB、TSLP、IL-33可能通过ILC2s细胞参与毛细支气管炎的发生发展。

在共沉淀实验中，IL-33与T1/ST2结合，激活下游信号分子，促进2型细胞因子的分泌。Beltran等人34发现核内IL-33可抑制转录因子的表达，降低促炎因子的表达，提示IL-33具有双重作用，一方面促进炎症因子的分泌，另一方面抑制转录。T1/ST2在毛细支气管炎组与正常对照组之间无显着性差异(PIL-33在两组间差异有显着性(P<0.05)。P < 0.05). It should be considered whether IL-33 has transcriptional repression in asthma and bronchiolitis. It has not been reported so far and needs further exploration for related mechanism.

以往的研究表明，IL-5、IL-9和IL-13只是Th2来源的细胞因子，但近年来大量的研究证实IL-2也能分泌这些细胞因子。35,36。白细胞介素-9(il-9)是一种多效细胞因子，在哮喘的发病过程中起着极其重要的作用。37。在本研究中，毛细支气管炎组与正常对照组相比，IL-9水平有显着性差异(P < 0.05). Mcnamava and Scruple reported that IL-9 increased in the peripheral serum of children with bronchiolitis, suggesting that IL-9 is involved in the airway inflammatory response of bronchiolitis38,39，这与我们的研究是一致的。

在体内，人们发现IL-13是肺部炎症的主要来源，这种反应不依赖于T细胞。40...IL-13能激活嗜酸性粒细胞，促进IgE分泌，参与哮喘炎症的维持，诱导小气道重塑和AHR，在哮喘的发生发展中起着重要作用。本研究中IL-13的表达水平高于正常对照组，提示IL-13可能参与了小儿毛细支气管炎急性期气道炎症和AHR的发病过程。实验研究表明，在过敏性或非过敏性哮喘中，IL-13是治疗哮喘的有效靶点。41.

IL-5通过促进嗜酸性粒细胞的产生、活化、趋化和延长细胞寿命，参与慢性气道炎症，因此被称为嗜酸性粒细胞分化因子。42。在动物实验中，以小鼠吸入卵清蛋白为模型，引入抗IL-5抗体，结果显示肺嗜酸性粒细胞明显减少。研究还发现，在Balb/c小鼠中，嗜酸性粒细胞趋化因子基因和白细胞介素-5基因被敲除，嗜酸性粒细胞的产生被阻断，不能形成AHR。43。在本研究中，毛细支气管炎组与正常对照组血清IL-5水平有显着性差异(P<0.0 5)。P < 0.05), indicating that children with bronchiolitis have eosinophil activation and AHR, which is in line with the Nenna et al. study44.

在本研究中，毛细支气管炎组的儿童没有过敏史或家族史，因此IgE在两组之间没有差异。P>0.05)，IgE表达随病情复发而逐渐下降。

应当指出，本研究存在局限性。首先，样本规模相对较小，这可能导致数据分析的统计能力较低。其次，未采集呼吸道标本，仅检测外周血和毛细支气管炎病因，可能影响研究结果的一致性。比较呼吸道合胞病毒感染与其他毛细支气管炎病因之间的细胞因子水平和研究基因表达水平将是很有趣的。