以宿主为导向的马驹治疗可增强功能性天然免疫，降低马驹的严重程度

细胞内细菌引起的肺炎马红球菌是一个重要的原因，疾病和死亡的免疫缺陷宿主，特别是马驹。抗生素是治疗的标准。马氏马驹肺炎和辅助治疗是必要的。我们测试了马驹中加入tlr激动剂(pul-042)是否能提高先天免疫力，减少肺炎的严重程度和持续时间。马氏感染。48只初生小马驹(n=48)用PUL-042或载体雾化，其肺细胞在体内外被感染。体内外感染Pul-042增加BAL液和肺泡巨噬细胞的炎性细胞因子马氏。然后，观察Pul-042对22只小马驹支气管内激发后肺炎临床症状的体内效应。马氏。与非雾化马驹相比，感染和雾化吸入Pul-042或车辆的马驹肺炎临床症状持续时间较短，肺部病变较小。我们的结果表明，宿主导向疗法可以增强新生儿对呼吸道病原体的免疫反应，并减少持续时间和严重程度。马氏肺炎。

马红球菌是一种兼性细胞内细菌，在巨噬细胞内优先复制。1并导致马驹和类似结核病的免疫缺陷患者出现脓性肉芽肿性肺炎。马驹感染马氏发生在出生后的头几周2，当马驹更容易感染这种病原体时3，可能是先天免疫反应和适应性免疫反应的幼稚/不成熟所致。4,5,6,7,8,9。适应性免疫反应需要更多的时间来发展，使所有物种的新生儿都有一个窗口，在此期间他们无法受到疫苗的保护，因此严重依赖于先天免疫反应。10。即使马驹能对疫苗产生有效的适应性免疫反应，也没有针对马氏尽管经过几十年的研究，肺炎仍可在商业上获得。有证据表明马氏保护马驹免受临床肺炎11然而，这种方法有一些局限性，例如它依赖于大坝的免疫状态和对疫苗的充分免疫反应，在出生后24至36小时内摄入足够的初乳(在马种中没有免疫球蛋白通过胎盘转移)等其他预防方法。马氏-特异性高免疫血浆并不完全有效，对马驹也有一定的风险。12,13,14,15。不推荐使用大环内酯类或其他类抗菌药物进行化学预防，因为马氏(和其他细菌)对这些药物16。因此，控制马氏马驹肺炎依赖于对临床或亚临床肺炎影响的马驹的抗菌药物治疗。17.

几十年来，大环内酯类抗生素一直是治疗的标准抗生素。马氏16。对大环内酯的抗药性马氏是马医学中一个新出现的问题，它与在地方病流行的农场对患有亚临床肺炎的马驹进行广泛的抗菌治疗有关。马氏17,18,19,20,21,22。因为有效的替代抗菌药物马氏感染是有限的18,23,24,25,26目前迫切需要采用非抗生素的方法，如宿主导向疗法(Hdt)来对抗这些病原体。针对新生儿天然免疫反应的免疫治疗是HDT的重要策略，因为幼崽的免疫系统尚不成熟。4,5,6,7,8,9以及感染马氏似乎发生在生命的早期2当人们知道马驹对这种细菌更敏感的时候3.

Toll样受体(Toll-like receptor，TLRs)是启动天然免疫的主要信号受体之一，可产生多种效应，包括细胞因子的产生。27。细胞内TLR 9识别细菌非甲基化胞嘧啶磷酸鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(cpG-ODNs)28。我们以前已经证明，A类CpG-ODN能通过体内外的免疫细胞诱导促炎细胞因子的表达。4,29,30,31，包括γ干扰素(IFN-γ)。有证据表明，幼崽出生时的干扰素-γ水平低于年长的小马驹。7,8，而用干扰素-γ刺激吞噬细胞，可促进对细胞内细菌的杀伤，如马氏32,33和结核分枝杆菌(MTB)34。TLR 2识别革兰氏+细菌的脂铁杉酸和肽聚糖。TLR 2−/−老鼠对这两种动物都比较敏感。马氏感染35和Mtb36提示TLR 2信号通路的激活对细胞内细菌的防御具有重要意义。PUL-042(Pulmotect，Inc.，休斯顿，TX)是一种吸入产品，由两种合成的TLR激动剂Pam2CSK4(TLR 2/6配体)和C类CpG-ODN M 362(TLR 9配体)组成。这种复合药物已在多种不同种类的病毒、细菌和真菌病原体中进行了试验，并在提高宿主存活率和减轻病原体负担方面显示出了良好的效果。37,38,39,40,41,42.

我们的研究的目的是检验在马驹中雾化吸入Pul-042是否能改善天然免疫反应，并减少因支气管内感染引起的肺炎的严重程度和持续时间。马氏在28天大的时候。我们证明：(1)在不同剂量和多次雾化吸入TLR 2/6和TLR 9激动剂(Pul-042)对新生马驹是安全的；(2)用Pul-042气雾剂治疗幼崽，可提高肺泡巨噬细胞体外感染时肺泡巨噬细胞上清液中白细胞介素(IL)-6和干扰素-γ的浓度；(3)雾化吸入活毒性支气管刺激的胎鼠肺内注射Pul-042。马氏减少发烧、临床肺炎和咳嗽的持续时间，并与未雾化的马驹相比，减少肺部病变的大小。结果表明，与非雾化组相比，PuL-042雾化增强了AMS的功能反应，减轻了临床肺炎的严重程度。

Pul-042雾化吸入对新生小马驹是安全的。

43匹马驹(36匹来自活体研究，7只来自活体挑战研究；图1)。1A，B)多次雾化吸入Pul-042，无一例出现呼吸强度和呼吸速率增加、泪液增多、咳嗽、鼻分泌物增多等不良反应，巨噬细胞比例明显增加(图二)。2中性粒细胞百分比下降(图一)。2(B)随着年龄的增长，在所有马驹的BAL细胞中，不论治疗情况如何。淋巴细胞百分率随年龄或治疗组无明显变化(图二)。2c)。未发现全身炎症的迹象可归因于雾化吸入Pul-042。血清淀粉样蛋白A(图1)2(D)，IL-6(图1.3(A)和肿瘤坏死因子-α(图1)。3(B)随着年龄的增加，所有组的气溶胶化治疗均有不同程度的下降。雾化吸入不会改变血清中白细胞介素-10的浓度。3c)。治疗后血浆纤维蛋白原浓度无明显变化(数据未显示)。这些结果表明，PUL-042雾化吸入对新生马驹是安全的，不引起全身或局部炎症。

Pul-042雾化吸入对体外感染BAL液和AMs细胞因子产生的影响马氏

我们在出生后的第二周和第三周用2.8%的甘油或三种不同剂量的Pul-042中的一种对48头小马驹进行了6次雾化吸入，并收集了BAL细胞和液体(见图)。1a)。2×和4×剂量的Pul-042剂量可使BAL液中的肿瘤坏死因子-α(TNF-)升高，与甘油组比较无显着性差异(图1)。3(D)，但没有其他细胞因子(IL-6，IL-10；图1)。3处理后BAL液中E，F)浓度发生改变。白介素-1α和白细胞介素-1β在两种时间点均未检测到，不包括在分析中。

收集雾化马驹肺泡巨噬细胞，将其保存在培养基中(未感染，基线)，或在体内感染。马氏(无花果)1a)。感染/未感染井浓度比值是由于细胞因子基线产生的个体间差异很大而使用的。白细胞介素-10和肿瘤坏死因子-α在所有治疗组(包括对照组)中相对于未感染的AMs增加(如图所示)。4A，B)，表明与年龄有关的增加对感染的反应。小马驹体内注射了两种最高剂量的Pul-042。马氏产生更大的IL-6(图6)。4C)和IFN-γ与单用2.8%甘油雾化的马驹细胞相比较(见图)。4(D)表明Pul-042对感染的免疫反应增强，但未感染细胞的免疫反应没有改变。白细胞介素-1、α和IL-17在培养的AMS培养上清液中均未检测到，且不包括在分析中。

用Pul-042雾化并不能改善体内外对小鼠的杀伤作用。马氏由AMS

毒力吞噬马氏来自雾化马驹的AMS(图1)。1(A)各年龄组动物在22日龄时均显著高于2天组动物(T0；图1)。5a)。雾化吸入Pul-042对AMs的吞噬作用无明显影响(图1)。5(A)也没有改善对马氏胞内(T48/T0之比)5b)。由于促炎细胞因子和抗炎细胞因子的平衡比其个别浓度更为重要，我们检测了受刺激的干扰素-γ表达率(感染细胞与未感染细胞的比例)和白细胞介素-10的表达(感染细胞与未感染细胞的比例)，并发现其与杀伤细胞有关。马氏(无花果)5C；R值−0.4740)。

雾化吸入Pul-042可减轻肺炎的严重程度。

在我们确保了48只小马驹中Pul-042雾化的安全性，以及它在体内外感染后对Ams免疫反应的调节能力之后，马氏通过促炎和抗炎细胞因子的产生，我们观察了肺内注射Pul-042在活、强毒支气管内感染前后是否雾化吸入。马氏降低马驹肺炎的严重程度(图一)。1b)。所有被实验感染的小马驹都被证实马氏临床肺炎基于我们的病例定义：≥2体征，肺脓肿的证据，以及两者都存在。马氏以及T-TBA标本中存在退化中性粒细胞的化脓性肺炎的细胞学证据。随机分为3组：对照组不雾化，感染前后用2.8%甘油(Pul-042稀释剂)雾化，感染前、后雾化吸入Pul-042。感染后用Pul-042雾化的马驹肺炎、咳嗽和发热的临床症状持续时间明显缩短(P<0.05)。6(A)检测时间较短(图1)。6(B)，和较小的总额(图1)。6(C)与未接受雾化吸入的马驹相比，与纯甘油雾化的马驹相比，TUS病变更为严重。

在本研究中，我们发现在支气管内激发后，用Pul-042雾化吸入。马氏减轻了马驹肺炎的严重程度。这可能是一个重要的发现，因为它可能是天然马驹抗菌药物的潜在辅助疗法。马氏肺炎。据推测，调节肿瘤坏死因子-α作为常规化疗辅助物的hdts通过减少炎症反应，缩短治疗时间，减少病理改变，减少结核病复发。43。此外，在流感肺炎小鼠和抗病毒治疗中也可以看到。37与抗菌药物合用时，PUL-042具有协同作用，可减少抗生素的用量或治疗时间，有助于降低耐药性的发生压力。在我们的研究中，马驹在临床肺炎发生前被雾化吸入，因此，抗菌药物治疗和雾化治疗不是同时发生的。大环内酯类药物与PuL-042在马驹肺炎中的协同作用值得进一步评价。令人惊讶的是，我们还观察到，单用甘油雾化治疗(我们的雾化对照组)有利于减轻疾病的严重程度。虽然单用甘油组发热持续时间、临床症状持续时间和肺部病变持续时间往往较高，但差异无显着性。我们无法解释这一发现的原因。甘油化合物是电子烟中化学物质的溶剂，甘油基的蒸气可以增加小鼠肺部的炎症反应。44,45,46增加人支气管上皮细胞因子的分泌47,48,49,50然而，电子香烟含有甘油的剂量(15-100%)远高于我们研究中使用的甘油(2.8%)。甘油能刺激人单核细胞源性巨噬细胞和培养的气道上皮细胞分泌促炎细胞因子。51,52。据作者所知，喷雾剂甘油对马肺细胞天然免疫反应的影响还没有被研究过，但我们的发现表明，单用甘油溶液雾化可以激活天然免疫反应，尽管程度低于Pul-042。在本研究中使用的低浓度甘油(2.8%)有可能引起有益的炎症反应。然而，我们推测，雾化甘油车辆控制组的小样本尺寸使我们无法检测到Pul-042和甘油车辆之间的显着差异。然而，我们的结果表明，雾化与Pul-042显着地降低了疾病的严重程度，在接受治疗的马驹。

我们测定了不同的细胞因子在上清收集的雾化马驹和感染体内外。马氏。两种重要的促炎细胞因子IL-6和IFN-γ仅在PUL-042作用下显著升高.有证据表明幼崽缺乏干扰素-γ，这一缺陷被理论解释了为什么马驹更容易感染。马氏肺炎7,8。我们以前已经证明，B类CpG-ODN可以诱导马驹产生INF-γ，但这是否会在体内支气管内感染时产生更好的临床效果？马氏，尚未确定。肺泡巨噬细胞是感染肺泡巨噬细胞的主要细胞。马氏然而，有证据表明肺上皮细胞对细胞内细菌有重要的相互作用和反应，例如马氏和Mtb53,54,55。也有证据表明，上皮细胞对Pul-042对小鼠肺炎的诱导抗性起作用。40。目前还没有评估马上皮细胞对Pul-042的反应，但它们可能对体内肺免疫有潜在的重要意义。此外，各组马感染AMS液上清液中促炎细胞因子TNF-α和抗炎细胞因子IL-10的浓度均升高。

我们想确定用Pul-042雾化是否会增加马驹AMs的杀菌能力。用Pul-042气雾剂6次采集小马驹的bal细胞后，用活菌感染它们。马氏，我们既没有观察到吞噬作用的增加，也没有观察到对马氏与单用甘油的马驹相比，单用甘油的比例为2.8%。尽管我们假设用Pul-042治疗的小马驹的AMs会杀死马氏我们的阴性结果比从未治疗的马驹中收集到的AMs要好得多。有证据表明，在没有上皮细胞存在的情况下治疗巨噬细胞不足以增加对巨噬细胞的杀伤。马氏42，这些细胞在我们感染AMS的培养系统中不存在。此外，清除马氏可由其他天然免疫细胞(包括中性粒细胞)介导。11,56,57。我们的结论是，尽管Pul-042的雾化并不直接影响对.马氏通过AMS调节免疫反应，有利于改善肺环境中的功能反应，从而增强肺细胞杀死细胞内病原体的能力。

因为我们观察了Pul-042对细胞因子产生的影响，这些作用与细菌的杀灭直接相关。33,34,35下一步，我们要确定细胞因子的产生与细菌的杀灭是否相关。Cfu比值(T48/T0；代表细菌复制)确实与IFN-γ除以IL-10的比率有关。Cfu比值越低(意味着细菌杀伤越大)，细胞因子比率越高，说明细胞内杀灭病原体需要在促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间取得平衡。

我们在本研究中还发现，在43头多次用Pul-042雾化的小马驹中，雾化吸入Pul-042不会产生任何副作用，如泪液过多、呼吸强度增加或鼻分泌物。我们也没有观察到任何由Pul-042引起的全身炎症反应的迹象，因为雾化治疗后，马驹血清中的促炎细胞因子或抗炎细胞因子或SAA的浓度并没有增加。我们发现，无论治疗组是哪一组，2天时马驹的SAA浓度明显高于28天。血清淀粉样蛋白A是一种急性期蛋白，在肺炎或有炎症刺激时迅速增加。58。据我们所知，没有任何报告评估马驹出生后第一个月的年龄变化，或随后雾化吸入。我们的发现可能的解释是2天大的小马驹在摄入初乳后有更高的SAA，或者雾化过程本身就会引起炎症。没有证据表明雾化增加了SAA，而且由于我们没有在体外研究中没有雾化的年龄匹配的对照组，我们无法确定是什么导致了与年龄相关的SAA减少。

我们观察到，无论治疗与否，雾化马驹的BAL液中中性粒细胞百分比和巨噬细胞百分比均显著下降，而淋巴细胞百分比保持不变。Hostetter等人(2017)还观察到，与1周龄小马驹相比，第一个月中性粒细胞百分比下降，巨噬细胞百分比增加，但差异不显著。59。根据我们的经验，在出生后的前3天，中性粒细胞的百分比高于1周龄的小马驹，这可以解释这两项研究的差异。

增加BAL液中中性粒细胞的百分比会表明雾化吸入后会出现短暂的局部炎症，因为中性粒细胞在肺部的浸润被认为是炎症的标志。在感染的情况下肺炎链球菌(SPN)然而，在小鼠中，由雾化的Spn溶解液所赋予的对致命Spn肺炎的保护作用与中性粒细胞在肺中的吸收无关。60。在本研究中，未见有证据表明吸入Pul-042 2×和4×但非6×时，小鼠BAL液中的TNF-α增加，但未见肺炎症的发生。我们认为这是治疗新生马驹的一个积极特点，因为炎症加剧会加重肺炎的严重程度。所有其他细胞因子在雾化马驹的BAL液中保持不变。

4,5,7,8,31。重要的是要注意马氏实验感染(包括本研究中使用的挑战模型)通常比在自然感染中观察到的肺炎更严重，这可能是由于在实验挑战中使用的感染生物体数量较多。因此，用Pul-042雾化可能对低剂量的自然感染更有效。尽管如此，我们的结果显示出有可能改善新生儿对细菌呼吸道病原体的免疫反应，并降低支气管内感染后临床肺炎的严重程度。