不同血细胞群DNA修复与放射敏感性的比较

尽管电离辐射(IR)在治疗和诊断中的频繁使用以及不可避免地暴露在外部辐射源中，但我们对人类血细胞辐射敏感性的了解是有限的，并且在不同的实验条件下获得的数据是不均匀的。为了比较不同造血细胞群的放射敏感性，我们对健康志愿者外周血中的细胞在相同条件下(静止、非刺激细胞)的反应进行了测定。首先测定T细胞(Treg、Th、CTL)、B细胞、NK细胞、CD 34+祖细胞和外周血单核细胞来源的巨噬细胞(MPH)和未成熟树突状细胞(IDC)的辐射反应，发现T细胞和B细胞高度敏感，在低剂量0.125 Gy的IR后开始发生凋亡。重要的是，当剂量为2Gy时，没有明显的阈值剂量，细胞死亡/凋亡增加到饱和水平。敏感性依次为T细胞>NK细胞和B细胞>单核细胞>巨噬细胞和IDC。这些数据证实了以前的一份报告，即与它们的祖细胞单核细胞相比，MPH和IDC具有抗辐射能力。虽然与单核细胞和巨噬细胞相比，非受刺激的T和B细胞对辐射高度敏感，但它们能够修复dna双链断裂，如暴露后γh2ax焦点的下降所示。外周血CD 34+细胞也显示暴露后γH2AX下降，说明它们具有修复能力。IR后，粒细胞(CD 15+)未见γH2AX染色。外周血淋巴细胞以T细胞为主，较单核细胞具有更强的辐射敏感性，但表现出修复蛋白xrcc 1、连接酶Ⅲ和papp-1在单核细胞中几乎不表达。为了评估IR后单核细胞在体内是否耗尽，我们测量了接受全身辐射(TBR，6×2Gy)的癌症患者T细胞和单核细胞的数量。我们观察到外周血T细胞数在治疗后第1天已明显下降，并维持在较低水平，同时还伴有存活CD3+T细胞比例中γH2AX灶数的增加。相比之下，单核细胞的数量并没有大量下降，这反映了它们与T细胞相比的抗辐射能力。单核细胞在体内也有γH2AX灶的聚集，但其水平明显低于T细胞。CD 56+NK细胞表现出与T细胞相似的反应。这些数据支持未受刺激的T细胞亚组分几乎同样具有辐射敏感性的观点。然而，淋巴系和髓系间的辐射敏感性有显着性差异，淋巴样细胞比髓系细胞更敏感。在髓系中，巨噬细胞和IDCs是最耐辐射的细胞类型.

抑制造血是放射治疗(RT)对癌症患者的一种严重毒副作用。1。它也会影响健康的个体，因为人类经常暴露在自然背景源、诊断程序或极端的核事故造成的外部辐射中。2。在~60%的癌症治疗中，通常采用1.8~2.0Gy的高剂量放疗。虽然高精度照射可提高选择性肿瘤细胞的杀伤率，但免疫抑制可通过影响在照射肿瘤领域血管中循环的免疫细胞而引起。细胞毒性T细胞和其他浸润肿瘤组织的免疫活性细胞的死亡也可能导致免疫抑制。可以想象，这最终会导致肿瘤导向的局部免疫反应减弱。值得注意的是，在骨髓或造血干细胞移植之前，高剂量辐射也用于消除免疫细胞，包括残留的肿瘤细胞，其中几个剂量为2Gy。3。单剂量0.1~0.5 Gy的低剂量照射常用于治疗良性疾病，特别是退行性和炎症综合征。4,5。在这种情况下，疗效主要取决于慢性炎症组织免疫反应的调节。5。虽然高剂量和低剂量放射治疗在世界范围内频繁使用，但我们对人类血细胞群体敏感性的了解有限。此外，用于诊断目的的辐射照射和随后的外部照射要求对造血系统细胞的辐射敏感性有一个精确的洞察。目前有关造血细胞群辐射敏感性的知识已被广泛综述。6我们的知识差距是显而易见的。

免疫应答依赖于B细胞、细胞毒性T细胞(CTL)、调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞(Th)、中性粒细胞和其他粒细胞群体以及单核细胞(Mo)产生巨噬细胞(MPH)和树突状细胞(DC)的平衡活动。在此之前，我们已经发现，体外照射的单核细胞比通过细胞因子处理产生的巨噬细胞和dc更具有辐射敏感性，但在本研究中缺乏与其他血细胞群体的比较。7.

本文采用AnnexinV流式细胞术和γH2AX法测定了健康志愿者外周血中不同细胞群体的死亡反应。检测CTL、Treg、Th、B和NK细胞的凋亡反应，并与粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和IDCs进行比较。这些数据揭示了细胞群体反应的明显差异，在以前公布的数据中对此进行了讨论。我们还对全身辐射患者的辐射毒性和γH2AX水平进行了中试研究，并与体外实验结果进行了比较。

不同血细胞群在照射后的剂量反应的比较如图所示。1A.资料显示淋巴系细胞比髓样细胞对IR更敏感。因此，在0.125 Gy后，T和B细胞中有相当一部分为AnnexinV(AV)阳性，表明死亡发生在0.125~2Gy的剂量范围内。外周血淋巴细胞总数(PBLs)与T、NK细胞反应相似(图1)。1a)。值得注意的是，AV阳性T细胞和B细胞的自发水平在20%~40%之间，在计算诱导频率时考虑到了这一因素(总凋亡水平如图所示)。沙一A，统计数字见图。沙一b)。正如以前报道的那样，细胞凋亡是IR后淋巴细胞死亡的主要途径。与此形成对照的是，在用交联剂mafosfaide处理后，发现有更多的淋巴细胞(约80%)是坏死的。8，表明淋巴细胞凋亡或坏死途径的激活以一种药物特异性的方式发生。用Milteny珠分离外周血CD 34+祖细胞，其辐射敏感性略低于B、T(Th、CTL)和自然杀伤(NK)细胞。我们应该注意到，这些CD 34+细胞是在细胞因子补充的培养基中培养的，以确保群体的高存活。新分离的CD 34+细胞在未加入细胞因子的培养基中表现出较高的基础水平和诱导凋亡水平，因此在相同条件下难以与其他细胞群体进行比较。在骨髓系中，单核细胞明显比巨噬细胞和未成熟DC更敏感，后者具有很高的抵抗力(图一)。1(A)。这与以前的报告是一致的。6,7.

取外周血粒细胞，分别进行检测。他们显示，经过一天的体外培养，极高水平的细胞凋亡，这并没有进一步增强的IR处理的部分(图一)。1B代表情节)。如以前报告的那样9粒细胞不经历IR诱导的细胞死亡，而是在潜伏期内自发死亡，这很可能是由一个固有的细胞死亡程序触发的。

在另一个实验环境中，我们比较了T淋巴细胞亚群Th(CD4+)和CTL(CD3+CD8+)中的小部分Treg(CD4+，CD 25+)。在这种情况下，用磁珠从健康献血者外周血中纯化细胞，在培养基中孵育，辐照后继续培养72h，在其他条件下，细胞不受刺激分裂。流式细胞术检测细胞凋亡。照射诱导的Treg、Th和CTL细胞凋亡随剂量的增加而增加，可达8Gy。Th、Treg和CTL诱导的细胞死亡水平差异不大，T细胞群间差异无统计学意义(图5)。1C和补编图。沙一c)。唯一例外的是0.5Gy后的Treg细胞，与Th相比，其诱导的细胞死亡明显减少(见图)。沙一d)。总的来说，这些数据与图中所示的剂量-反应曲线是一致的.1其中Th和CTL表现出几乎相似的反应。我们还用亚G1定量测定细胞死亡。在这种情况下，Treg比Th和CTL敏感，尽管Treg和CTL之间的差异没有统计学意义(图1)。1d)。综上所述，这些数据使我们得出结论，Th、Treg和CTL是血细胞中最受辐射影响的细胞类型。在不同供者的血液样本中观察到的高度个体间的差异并不能最终得出Treg、Th和CTL在辐射敏感性上是否存在显著差异的结论。此外，与T细胞相比，NK细胞和B细胞辐射后细胞死亡诱导率无明显差异。然而，与T细胞一样，NK细胞和B细胞比单核细胞、巨噬细胞和IDCs具有更强的放射敏感性。1A和沙一b)。

在凋亡检测中观察到的辐射敏感性促使我们比较γh2ax病灶形成(dna双链断裂的一个公认的指标dsb)。10,11)及随时间的减少(这是DSB修复的一个指标)。在图中。2A.给出了辐照后不同时间点γH2AX聚焦的典型例子。定量评估显示，在所有细胞类型中，除单核细胞外，γH2AX病灶在染毒后6h明显下降(图1)。2B，如图所示。2C正常化至1小时)。因此，在T、NK、B细胞、巨噬细胞和CD 34+祖细胞中，处理后6h的DSB水平约为诱导水平的50%，而单核细胞则不然。在随后的潜伏期(24小时)，病灶水平进一步下降，在单核细胞中也有观察到。因此，在2Gy剂量照射后，单核细胞似乎能够在一定程度上修复dsb，而在较高剂量水平(5Gy)时，dsb修复强度明显减弱，似乎已饱和。7。值得注意的是，单核细胞中γH2AX焦点的基本水平高于其他细胞群体，这可能是由于这种细胞修复受损所导致的DNA损伤的积累所致。

在另一个实验装置中，用γH2AX及相应的表面标记对细胞进行染色，并进行光镜分析。如图所示。3照射后1h出现γH2AX病灶，24h后完全消失，表明DSB已修复。值得注意的是，CD 19+B-细胞和CD 34+祖细胞在照射后24h内由于其耗竭性强，难以进行分析。对CD 34+细胞，用LSM法分析2Gy后1、4hγH2AX聚焦动力学。数据(图1.3B显示具有代表性的Z-栈图像和量化)与实验结果一致(图1)。2(C)从外周血中获得的CD 34+细胞能够修复IR诱导的DSB。我们应该注意到，γH2AX在实验系列中的基础水平如图所示。2和3是不同的，当评估发生在LSM而不是Metafer系统时，基础水平较低，这可能是由于不同的设置对减少背景染色产生影响。有趣的是，粒细胞(CD 15+)在照射后没有显示出任何γH2AX病灶形成(图1)。3(A)，这证实了上一次报告9.

结果显示，由于关键修复蛋白的下调，单核细胞出现了衰减的dna修复。7,12,13,14。这一点在图中得到证实。S2，表明与PBL相比，单核细胞中连接酶Ⅲ、XRCC 1和PARP-1的表达水平极低。值得注意的是，单核细胞虽然表现出修复缺陷，但比包括不同T细胞群在内的外周血淋巴细胞具有更强的抗辐射能力(图一)。1)。下文将讨论可能的原因。

人体血细胞的辐射敏感性是否在体内反映？我们通过测量反复使用2×2Gy/天(累积剂量12 Gy)的患者外周血中造血细胞数量及其γH2AX水平来解决这一问题(治疗环境见图)。4a)。在图中。4B，对1例患者进行流式细胞术计数。其定量结果显示，PBMC中CD3+T细胞的数量显著减少，而单核细胞的数量在累积剂量达到12 Gy后并没有减少(图1)。4c)。这与我们在体外观察到的情况是一致的，在这种情况下，单核细胞在IR后的细胞死亡率明显低于T细胞(图1)。1a)。在无花果里。4D，e，T细胞和单核细胞在两种不同患者的PBMC群体中的相对数量。再一次，TBR期间T细胞大量减少，照射后第一天已经观察到，而单核细胞数量并没有减少。在1天和2天后，它们甚至显示出短暂的积累(图1和2)。4(分别为d、e)。我们应该再次指出，这些实验是在PBMC样品上进行的，密度离心法几乎完全去除了PBMC中的粒细胞组分。如果我们评估病人的总血量(图一)。4(F)2×2Gy后1d淋巴细胞数量急剧减少(约95%)。单核细胞数量也明显减少，但明显较小(在TBR第一天减少约50%)，而粒细胞(中性粒细胞)数量和白细胞总数同时增加。中性粒细胞的相对增加，以补偿淋巴细胞和单核细胞的减少，与其强烈的辐射抵抗力是相容的。9。同样可以想象的是，在TBR期间，它们的池被一个抗辐射的先驱者填满，甚至造成额外的补偿。总之，在TBR期间，我们观察到外周血淋巴细胞数量明显减少，单核细胞明显减少。中性粒细胞没有受到影响。这反映了细胞的辐射敏感性决定在体内。

为了评价体内辐射后血细胞中DSB的水平，我们在玻璃片上固定了TBR(2×2Gy)后12~14h的PBMCs，用T细胞(CD3+)和单核细胞(CD 14+)表面标记物染色，同时用γH2AX染色。有代表性的图像如图所示。5A.定量结果显示，在12 Gy的累积剂量下，T细胞的γH2AX病灶水平比单核细胞更广泛地增加(如图1所示)。5b)。在离体粒细胞中，即使在12 Gy TBR后，也不能观察到任何γH2AX染色。5(A)，这与体外获得的数据一致(图1)。3a)。我们还评估了CD 19+B细胞和CD 56+NK细胞对照射后γH2AX灶形成的影响。6)。在B细胞中，γH2AX病灶在照射后1天几乎检测不到，2天后(累计8Gy)明显增加，但在照射第3天(累积12 Gy)不能检测到有病灶的B细胞，表明损伤的B细胞已被有效清除。6a)。与此形成对照的是，在NK(CD 56+)细胞中，存活人群的γH2AX病灶水平在照射患者中呈逐步上升趋势(如图所示)。6B)，表明在存活的NK细胞中，DNA损伤在反复照射后积累。这些细胞在后期是否会发生凋亡死亡，或者是否有能力在DNA损伤的情况下存活，还有待于确定。

尽管IR在治疗和诊断中经常使用，而且不可避免地暴露在外部辐射下，但我们对人类血细胞亚群辐射敏感性的知识是有限的，而且公布的数据也是多种多样的。6,15,16。这是因为多年来在不同的实验室中使用了不同的实验设置。因此，淋巴细胞的辐射敏感性由中性和碱性彗星试验、活力测定或克隆原性试验确定，每种方法的结果不同。在大多数情况下，植物血凝素(PHA)刺激的淋巴细胞被使用.有趣的是，增殖淋巴细胞和不增殖淋巴细胞对IR和化学遗传毒物的敏感性有显着性差异，非增殖(非受刺激)淋巴细胞比从同一供体获得的增殖(CD3/CD 28)淋巴细胞对辐射更敏感。8。为了比较不同的血细胞群，应该研究非增殖细胞，因为(A)髓系细胞(单核细胞、巨噬细胞、DC)在体外不增殖；(B)体内外周血中的大多数淋巴细胞不增殖(除非它们在感染期间被激活和膨胀)。

为了比较不同造血细胞群的放射敏感性，我们在相同环境和相同实验条件(不加PHA或CD3/CD 28刺激)下，测定了正常人外周血淋巴细胞和髓系细胞(新鲜分离自布菲外套细胞)在同一环境和相同实验条件下对不同类型细胞的辐射敏感性。结果表明，T细胞和B细胞高度敏感，低剂量0.125 Gy照射后细胞开始发生凋亡。重要的是，在低剂量范围内，在1Gy剂量下，细胞凋亡率呈线性增长，达到50%左右的饱和水平。我们没有观察到T细胞亚群之间的强烈差异。在细胞凋亡试验(AV+)中，Th细胞似乎是最敏感的部分，0.5Gy照射后，Th细胞凋亡率约为30%，而Treg、NK和B细胞的凋亡率为20-25%。1A，c)。然而，由于个体间的高度变异性，T细胞亚群之间的差异在统计学上没有显着性(见补充图)。沙一b)。在AV+和亚G1期，CTL高度敏感，细胞凋亡率与Th细胞相似。1a)。T细胞、B细胞、NK细胞及CD 34+祖细胞经0.125 Gy照射后，细胞凋亡率明显升高。有趣的是，在所调查的剂量范围内，我们没有观察到一个无效果的阈值，表明凋亡程序已经准备好(随机地)激活一小部分已经处于低dna损伤水平的细胞。

外周血淋巴细胞对辐射的高度敏感性与Nakamura等人的数据是一致的。Nakamura等人在1990年已经证明了CD4。+和CD8+T细胞和未分类淋巴细胞的死亡呈剂量依赖关系，2Gy后死亡率约为50%。17，以及Pugh等人。结论：淋巴细胞对IR的致死作用高度敏感，凋亡起主要作用。18。值得注意的是，T细胞和B细胞群体之间的差异并不明显，这证实了霍恩等人先前的一项研究，支持了他们的结论，即“就生物剂量学而言，分析单个亚群是不必要的”。16。值得注意的是，在我们的实验中检测到的PBLs及其亚群的凋亡频率高于Bordon等人的报道。19以及霍恩等人。16。他们在放疗后3天观察到最高频率(0.5 Gy后约40%)。16)。此外，霍恩等人。16流式细胞术检测凋亡细胞，结合caspase活性测定细胞凋亡信号，采用常规的AnnexinV(AV)染色法。我们没有进行时间过程实验，我们不得不承认，我们使用edta(而不是肝素)进行血液采样，这可能会对细胞的存活能力和背景凋亡频率产生影响。20。Falcke等人报告了极低的凋亡频率，其原因可能与不同的门控策略和将细胞凋亡/坏死的早期和晚期分组有关。21。值得注意的是，单剂量2Gy的TBR通常用于干细胞移植前几乎完全消除T细胞和B细胞，这支持了PBLCs比体内许多其他靶点更辐射敏感的观点。

与淋巴系细胞相比，从外周血中分离出的单核细胞明显具有更强的抗辐射能力。因此，在剂量为2Gy的情况下，10%的单核细胞为AV+，而淋巴样细胞和CD 34+祖细胞的比例为30-50%。1a)。单核细胞与淋巴细胞相比具有较高的抗辐射能力，这与另一组的报道一致。21。比单核细胞更耐药的是巨噬细胞和IDCs，因此髓系与淋巴系相比具有高度的抗辐射能力。在此之前，我们曾报道过单核细胞在dna修复和辐射敏感性方面受到限制，而巨噬细胞和dc则是由细胞因子成熟而来的。7。报告的数据证实了这一发现。因此，当剂量高达2Gy时，巨噬细胞和IDC几乎没有发生凋亡(图1)。1a)。单核细胞不表达修复蛋白xrcc 1、连接酶Ⅲ和prp-1，这是断裂dna末端非同源端连接(B-nhej)所必需的。22,23。由于修复能力有限，其dna修复率较低，特别是当残馀修复活性耗尽时，在高剂量水平下尤为明显。7,8。单核细胞在碱基切除修复(BER)中也受到损害，这影响了它们对烷基化剂的敏感性。12,13。由于XRCC 1的下调而导致的BER缺乏症(这是切除受损基底后的结扎步骤所必需的)是否有助于单核细胞(相对于巨噬细胞和DC)的辐射敏感性，这是一个悬而未决的问题。在这方面，应该强调的是，本研究中的所有细胞类型都没有受到刺激(CD 34+除外)，因此没有增殖。因此，如前面所建议的，DNA修复中间体可能会干扰复制机制。24，在非刺激的造血细胞中不起作用。有趣的是，如果淋巴细胞被刺激增殖，它们的辐射敏感性就会降低，这会导致atm表达和信号的下调。8.

如果单核细胞在DNA修复中受损，另一方面，非受刺激的淋巴细胞具有修复能力，为什么(非受刺激的)淋巴细胞比单核细胞更具有辐射敏感性？合理的假设是淋巴细胞已经准备好接受凋亡死亡，这是他们在血液和组织中永久消失的正常方式。25。显然，即使是少量的dna损伤也足以激活dna损伤反应和下游凋亡途径。26。相比之下，在单核细胞、mph和idc中，死亡受体通路不是自发激活的。7而且，尽管积累了较高水平的DNA损伤，细胞并没有经历凋亡的准备。

为了探讨单核细胞是否也能在体内观察到较高的辐射抵抗力，我们对接受全身辐射(TBR)(2×2Gy/d，累计12 Gy)患者的血液样本进行了检测。我们观察到淋巴细胞数量明显减少，但单核细胞(相对于PBMC)却没有下降。即使在累积12 Gy后，单核细胞仍未完全耗尽，这支持了单核细胞比B、T和NK细胞更耐辐射的观点。因此，体内数据基本上证实了我们在体外观察到的情况。

在此之前，我们发现单核细胞很容易受到ros的伤害，因为他们自己的ros破裂或附近的巨噬细胞被激活产生ros而导致中毒而死亡。27。这种情况称为“反式杀人，被提议发生在发炎的组织中，调节炎症驱动的免疫细胞的数量，如单核细胞、巨噬细胞和dc。27。与淋巴样细胞相比，单核细胞具有较高的辐射抵抗力，这与这一概念并不矛盾，后者依赖于局部细胞与细胞之间的相互作用。在肿瘤放射治疗中，肿瘤相关单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞是激活肿瘤特异性免疫反应的重要因素，它们很可能在2Gy照射下存活。虽然我们不知道分馏剂量的效果，但可以想象，这些细胞也能存活。

单核细胞是从造血干细胞中产生的，而造血干细胞是辐射敏感的细胞。6。它们在骨髓中成熟，然后在外周血中释放，在那里停留2-5天，直到它们迁移到组织中。28。相比之下，淋巴细胞是活得很久的细胞，在体内停留到2年，幼稚的T细胞甚至可以活到9年。29。因此，在TBR期间，造血干细胞的耗竭预计会导致放射治疗后晚期单核细胞数量的减少。事实上，我们观察到了一些波动，其他人也有报道。30，这可能是补偿池充注的结果。6但与T细胞相比，我们没有观察到较强的单核细胞耗竭现象，而T细胞在TBR发病后3天内表现出较强的耗竭性。然而，我们不能排除单核细胞的耗竭发生在较晚的阶段，导致先天免疫反应在TBR后晚期下降。这些数据与大鼠在低剂量照射下所观察到的辐射效应是一致的。在照射后一天，已经有0.3 Gy导致血细胞计数下降。31.

我们还研究了粒细胞(主要成分是中性粒细胞)的反应。类似于我们上一次的报告9，粒细胞不显示γH2AX焦点形成，支持在最后阶段他们在DNA损伤信号中受损的观点。它们在栽培期间开始死亡。因此，高的自发凋亡水平使得无法确定辐射诱导的反应。值得注意的是，在TBR后的血液总数中，中性粒细胞在辐射期间并没有下降，这表明它们对辐射具有很强的抵抗力，或者是永久性地被一种抗辐射的前体所取代。

用于癌症治疗的高剂量放疗(1.8~2Gy)被认为是通过激活反式免疫反应直接或间接杀死肿瘤细胞的。32。此外，单次剂量0.5 Gy的低剂量辐射已被证明是治疗与疼痛和炎症相关的类风湿关节炎的有效方法。33。虽然巨噬细胞(M1)通过促炎细胞因子的分泌在此过程中起驱动作用，但由于它们具有较高的放射抵抗水平，很难被认为是炎症放射治疗的靶点。然而，我们应该注意到，我们不能排除辐射治疗后其功能受到损害的可能性，需要对此进行调查。鉴于目前已发表的数据，将ctl和其他淋巴样细胞类型作为低剂量放射治疗的靶点是合理的。6,34,35。这一观点得到了这项研究的支持，这项研究揭示了T细胞的高放射敏感性，这将不可避免地导致它们在发炎组织中的耗竭。我们还应该注意，DC疫苗联合放射治疗可能是一种有效的策略，因为肿瘤浸润的抗辐射DC有可能存活治疗，并能够激活受照射肿瘤组织内的抗肿瘤免疫反应。