18氟脱氧葡萄糖正电子发射体层摄影术评价应激红细胞在小鼠体内的器官分布

高温应激下的红细胞(RBCs)在病理条件下与衰老或受损的红细胞相似。可以有效地将RBCs标记为18氟脱氧葡萄糖(FDG)。本研究的目的是评估应激性红细胞的红细胞吞噬功能和器官在体内的分布情况。18FDG PET/CT。在高温(48℃)下诱导RBCs制备应激性RBCs。用荧光活化细胞分选法(Fcs)分析活性氧(Ros)的产生和胞内Ca的变化。2+红细胞的浓缩和膜磷脂酰丝氨酸(PS)外化。18用F-FDG标记红细胞，评估红细胞吞噬功能.最后，18应用F-FDGPET/CT技术检测应激性红细胞在小鼠体内的器官分布。与未处理的RBCs相比，应激性RBCs的细胞体积减少，ROS水平升高，细胞内Ca含量增加。2+浓度和PS暴露。可将RBCs标记为18F-FDG应激后的RBCs往往通过对FACS和放射性的评估而被巨噬细胞吞噬。18F-FDGPET/CT显像显示应激性RBCs主要滞留在脾内，而未治疗的RBCs仍在循环系统中。因此，有压力的RBCs可以被有效地贴上标签。18用PET/CT评价，F-FDG可能被困在小鼠脾脏内.

红细胞是血液的主要成分，占总血容量的一半。在生理条件下，红细胞呈双溶洞状，具有可逆变形性和耐久性。1。由于RBCs结构简单，缺乏细胞核和内细胞器，很容易受到氧化应激、渗透休克、能量耗竭和细胞因子等内部环境变化的影响。这些变化导致红细胞形态和功能的改变，包括脂质氧化失衡、膜离子通道异常激活、磷脂酰丝氨酸(Ps)外化以及膜蛋白的聚集或分化。2,3,4最终加速清除RBCs。一些研究表明，这些变化发生在某些慢性疾病的红细胞中。5,6,7...巨噬细胞通过一种称为红细胞吞噬的基本生理过程从循环中清除衰老或受损的红细胞，而红细胞吞噬是铁/血红素代谢和稳态所必需的。一般认为红细胞吞噬作用是由肝巨噬细胞和脾巨噬细胞完成的。8,9。然而，什么样的巨噬细胞在RBCs清除过程中起着关键的作用，目前尚不清楚。一些研究表明，储存损伤和衰老的rbc主要由脾红髓巨噬细胞清除。10,11而其他研究人员则认为肝巨噬细胞是清除老年和应激性红细胞的重要细胞。12,13。因此，研究红细胞在病理状态下的分布及其主要的清除器官具有重要的意义。

正电子发射断层扫描(PET/CT)作为最先进的技术之一，可以同时获得代谢和解剖数据。PET/CT是将短时间的放射性同位素标记物质注入体内，通过放射性聚集来反映代谢活动的状态。18氟脱氧葡萄糖18F-FDG是一种放射性标记的葡萄糖类似物，是临床主要的PET/CT显像剂。18F-FDG PET/CT已广泛应用于高糖代谢疾病的检测和诊断，包括感染、炎症和癌症等。18不同组织中的F-FDG摄取率14。RBCs的能量代谢依赖于糖酵解。作为葡萄糖类似物，18因此，rbc可以使用ffg来实现rbc标记，而最近证明这是可行的。15。目前，压力下的红细胞是否被吞噬，它们在体内的分布位置尚不清楚。

在本研究中，我们使用高温诱导的应激性红细胞来模拟病理条件下的红细胞。18用F-FDG标记红细胞，检测红细胞吞噬功能，用PET/CT评价应激性红细胞在小鼠体内的器官分布。

应激性RBCs的特点

48℃加热30 min后，红细胞形态发生变化。前向散射可以反映RBCs的相对体积。16未处理RBCs的前向散射宽度(FSC-W)高于应激RBCs的前向散射宽度(FSC-W)，说明应激RBCs的细胞体积小于未处理的RBCs(图1)。1A、B)。应激红细胞的膜分子分布和细胞内离子浓度也不同于未处理的红细胞。活性氧水平与细胞内钙2+浓度表示为平均荧光强度(MFI)，PS外化以Annexin阳性率表示.DCFH-DA MFI(图1)。1C，D)，Flou4 MFI(图1)。1E，F)和Annexin阳性率(图1)。1应激性RBCs的G、H明显高于未处理的RBCs。这些结果表明，加热导致ROS水平升高，钙内流增加，PS暴露于应激的RBCs中。

应激性红细胞容易被吞噬

由于流式细胞术(FACS)是测定红细胞吞噬功能的最常用方法，我们使用荧光探针ter-119标记的红细胞来检测这一过程。巨噬细胞FITC依赖的荧光强度反映了RBCs的吞噬能力。应激红细胞孵育的巨噬细胞的平均荧光强度高于未经处理的巨噬细胞。2A、B)。与FACS结果一致的是，免疫荧光显示，应激的RBCs比未处理的RBCs更有可能被巨噬细胞吞噬。明亮的视野显示原始的264.7细胞(图)。2c，D)。荧光场显示，许多受胁迫的RBCs位于巨噬细胞中，说明它们被吞噬(图1)。2f)。未处理的红细胞较少被巨噬细胞吞噬，未处理的RBCs粘附在巨噬细胞膜上的较少(如图所示)。2e)。应激红细胞处理的巨噬细胞的平均荧光强度值高于未处理的巨噬细胞。2g)。

18未经处理和应激的RBCs的F-FDG标记效率分别为96.13±1.81%和95.71±2.46%。3a)。应激性RBCs与未处理RBCs的标记效率差异无显着性(P>0.05)。未处理红细胞在1h、2h、3h的标记后稳定性分别为98.91±0.079%、98.2±0.183%、98.34±0.079%，应激性RBCs标记稳定性分别为97.68±0.452%、96.56±0.375%、96.71±0.478%。3b)。测定未吞噬红细胞和巨噬细胞的放射活性，计算吞噬率。应激红细胞孵育巨噬细胞的比率高于未处理的红细胞孵育巨噬细胞的比率(图1)。3C)，这意味着与未处理的RBCs相比，应激的RBCs更容易被巨噬细胞吞噬。

应激性红细胞被困在脾脏中

注射未经治疗的RBCs时，心脏放射性较高，而其他器官的放射性较低(见图)。4a)。图像显示未经治疗的红细胞主要分布在心脏。4c)。相反，当注射应激的RBCs时，脾脏的放射活性很高(如图所示)。4(B)图像显示脾脏有较强的蓄积性。18F-FDG标记的应激性RBCs(图1)。4d)。总之，注射应激的RBCs被困在脾脏，而未经治疗的RBCs则保存在心血管系统中。

随后，应激性RBCs注射小鼠脾脏的H&E染色显示脾窦内有许多RBCs。5B)，但未注射RBCs的小鼠脾脏中RBCs较少(图1)。5a)。免疫荧光也显示，应激下的红细胞聚集在脾脏中(如图所示)。5(c-E)。这些结果表明，应激性红细胞被困在脾脏，与PET/CT测量的体内器官分布数据一致。

关于负责清除红细胞的主要器官有争议。10,11,12,13。我们的研究用PET/CT证实了应激性红细胞的准确器官分布，可以反映其清除部位。首先，我们证明应激性RBCs在病理状态下表现出与RBCs相似的特征(图1)。1)。其次，我们证明了18F-FDG能有效标记RBCs，应激和未处理RBCs的标记效率无统计学差异(图二)。3a)。因此，18F-FDG标记的红细胞适于评估红细胞吞噬功能和体内器官分布。然后，我们的数据显示压力下红细胞的红细胞吞噬功能增强。2, 3c)。最后，PET/CT显像显示，应激性RBCs注射小鼠脾脏放射性迅速增加(图一)。4这些结果经H&E染色和脾脏切片免疫荧光证实。5).

脾脏是网状内皮系统的一部分，与红细胞清除有关。应激性红细胞被束缚在脾脏中，这意味着应激性红细胞很可能被脾脏清除。这可以解释某些疾病的贫血。此外，由于红细胞必须在心血管系统中才能正常工作，因此脾内注射应激性红细胞的输注效率较低。心血管系统中的红细胞可以发挥其生理功能，这意味着输血可以达到其目的。因此，18F-FDGPET/CT有助于研究输液效果。

在我们的研究中，我们使用18F-FDG为RBCs贴上标签。作为葡萄糖类似物，18F-FDG可由RBCs承担.后18F-FDG转换为18F-FDG-P，它不能继续下面的糖酵解过程直到18F经历放射性衰变17。标记后稳定性18Ffg标记的rbc值很高，这意味着18F-FDG标记的RBCs适合于显示RBCs的分布.

本研究使用48个℃处理的RBCs(应激RBCs)来模拟病理状态下的RBCs。Utoh等人认为高温处理会导致红细胞溶血和渗透脆性升高，这是膜成分变化的结果。18。此外，热处理也会导致能源消耗。19，它与参与质膜置乱的Janus激酶3(Jak 3)的激活有关。20。最近的研究表明，温度的影响与加速红细胞损伤/老化有关。21。我们的研究表明，细胞内的活性氧、钙2+应激性RBCs的浓度和PS外化增加(图1)。1C-H)，在糖尿病等慢性疾病患者的红细胞中也观察到了这些变化。22，自身免疫性溶血性贫血23溶血性尿毒症5。RBCs的细胞核在进入血液循环之前就被挤压出来，成熟的RBCs中没有内质网和线粒体等细胞器。因此，RBCs对内部环境的变化非常敏感。在某些疾病中5,22,23,24、高渗和氧化应激以及能量消耗导致红细胞膜表面分子和细胞内成分的变化。2。氧化应激导致脂质氧化失衡，细胞内过氧化物积累，活性氧水平升高。25。同时，离子通道被异常激活，Ca也被激活。2+内流增加，导致胞内钙增加2+浓度，这与PS从细胞膜内小叶转移到红细胞表面有关。26。因此，我们选择了ros，ca。2+浓度和PS暴露代表应激RBCs的特点。事实上，压力下的RBCs的变化也类似于衰老时观察到的变化。6和长期储存的RBCs27,28,29.

病理状态下红细胞易被巨噬细胞吞噬6。红细胞吞噬作用主要依赖于三种途径。红细胞上增强的ps和带-3聚集是主要的亲吞噬信号。30,31。CD 47作为一个“不吃不吃”的信号，通过与sirpα的相互作用而起中介作用。32。在本研究中，应激RBCs的PS外化增加，提示应激RBCs的红细胞吞噬作用可能是通过PS途径介导的。体外实验还表明，应激下的红细胞更容易被巨噬细胞吞噬。2, 3c)。

本研究用高温诱导的红细胞(应激红细胞)来研究病理条件下红细胞的清除情况，但这并不能充分反映红细胞在体内的清除情况。在随后的研究中，我们将继续研究体内清除红细胞，如长期储存的红细胞，并调查红细胞的输血效率，因为长期储存的红细胞的输注效率还不甚清楚。

我们用18F-FDG标记的红细胞在体内测定红细胞吞噬功能和器官分布，证实应激性红细胞有吞没倾向，脾脏是应激性红细胞聚集的主要器官。由于应激红细胞在病理条件下模拟受损的红细胞，应激性红细胞被困在脾脏可能解释了糖尿病和自身免疫性溶血性贫血等疾病的贫血。22,23。此外，本研究也为临床对储存红细胞输注效率的进一步研究奠定了基础。