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单细胞基因组学在肾透明细胞癌免疫环境研究中的应用

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发表时间:2021-01-28 10:12作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

透明细胞肾细胞癌(CcRCC)是免疫应答率最高的肿瘤类型之一,尽管肿瘤的突变负担较低。为了表征ccRCC的肿瘤免疫微环境,我们应用单细胞RNA测序(Scrs)和T细胞受体(Tcr)序列分析了25,688个人CD 45的转录异质性。+3例ccRCC患者配对肿瘤和血液中的淋巴和髓样细胞。我们还包括来自其他四人肾脏和外周血的11,367个免疫细胞,以便于识别和评估ccRCC-特异性差异。CD8总体上有所增加。+肿瘤浸润免疫细胞中T细胞和巨噬细胞与正常肾组织的比较。我们进一步证明了肿瘤浸润CD8的不同细胞转录状态。+T细胞和识别MKI 67+增殖性亚群是ccRCC进展的潜在罪魁祸首。利用SCRS基因的表达,通过分组分配,对临床预后和病理疾病有较好的预测作用。随着进一步的特性和功能验证,我们的发现可能揭示某些亚群体的免疫细胞可以接受治疗干预。

导言

肾细胞癌是最常见的肾癌类型,占所有肾癌的70%以上。1。Ccrcc是一种免疫敏感的肿瘤类型,并以早期应用T细胞增殖细胞因子IL-2和干扰素α2b治疗全身免疫治疗而闻名。2。最近针对免疫检查点作为护理标准的新的免疫疗法改变了ccRCC的治疗模式。3,4。然而,相当一部分的肾癌患者对这些疗法没有反应,而最初有反应的患者最终会有进展。5,6。细胞毒性肿瘤浸润淋巴细胞(TILs),特别是CD8+T细胞是适应性抗肿瘤免疫应答的关键效应。7CD8的丰度+实体癌中的T细胞与癌症患者的生存率有关。8,9,10,11。然而,在ccRCC中,免疫细胞丰度与存活呈负相关,特别是包括CD8在内的TIL。+T细胞12,13,14,15。近期临床试验的生物标志物分析结果也证实了在治疗未进行免疫治疗的情况下T细胞浸润对预后的负面影响--幼稚的ccRCC患者。16,17。在ccRCC肿瘤微环境中,其他丰富的免疫分子包括单核细胞、树突状细胞和TAMS。18这一点现在才刚刚开始研究。

从大量肿瘤标本的转录分析中定量推断免疫细胞丰度不足以提供免疫细胞类型的清晰图像。19,20。虽然这些研究具有暗示性,但它们缺乏单细胞分辨能力来描述最终形成抗肿瘤反应的异质细胞亚群,就像在乳腺癌和黑色素瘤中所证明的那样。21,22。单细胞检测方法包括流式细胞术、免疫组织化学和大量的流式细胞术。14,18,23已经揭示了免疫细胞状态在ccRCC中是离散的表型,当在体内时,它们通常表现出不同的分化或激活状态。此外,这些方法需要使用针对已知免疫细胞组分的抗体面板,而且按设计无法识别新的细胞亚群。SCRs使多种癌症的异质性淋巴和髓系免疫细胞具有全面的特征。24,25,26,27,提供了一种无偏的方法来分析细胞,支持不同亚群体的分子分类和新基因程序的鉴定。T淋巴细胞转录图谱与tcr测序相结合,可以在前所未有的深度进一步测量克隆性T细胞对癌症的反应。28,29.

在此,我们报告了ccRCC中免疫景观的单细胞图谱,其中25,688个免疫单细胞(T细胞受体的5‘-测序和重组V(D)J区)在匹配的肿瘤样本和三种治疗方法--幼稚的ccRCC患者的外周血中。我们进一步整合了从外周血和肾实质中分离出的11,367个免疫细胞。30提供对照,以评估肿瘤特异性转录和克隆变化的免疫群体在单细胞水平。对肿瘤浸润T细胞的分析显示,与外周血和正常肾实质相比,T细胞有明显的表达变化。T细胞克隆结构不同,CD8细胞明显扩张+T细胞而不是CD4+T细胞-并与细胞轨迹分析显示的转录模式有关。在髓系细胞中,我们观察到患者之间混合极化的巨噬细胞总体数量增加。CD8预测模型+T细胞和TAMS发现与增殖性CD8相关的整体生存状况较差。+T细胞和CD 207+塔姆斯。这是第一个使用SCRS进行转录和克隆评估的ccRCC免疫前景的报告。

结果

CcRCC中免疫细胞的单细胞表达谱分析

为了确定人ccRCC的免疫微环境,我们对3例未治疗的ccRCC患者进行了流式细胞术和肿瘤髓系细胞的SCRS检测,并与其外周血进行了配对。分离和排序的一般工作流程可在附图中获得。1。在这些样本中,我们加入了外周血和正常肾实质的免疫细胞。30在37,055个原始免疫细胞中获得22簇的整合UMAP投影(图1)。1A)。在这三种组织中,外周血(n=21,160),肿瘤(n=12 239),正常肾脏(n=3556),我们发现许多簇--尤其是簇0,1,3和7--有相似的基因表达(图1)。1B)。尽管整合了测序以减少组织类型的差异,但每种组织类型对不同的簇都有富集作用:外周血构成了第2组的大多数,肿瘤组织在第14、17、18和19组中富集,正常肾脏在第11组中富集。根据基因表达,我们采用三种方法为每一组分配细胞谱系:(1)T细胞标准标记的表达(1)T细胞标准标记的表达(1)。CD3E, CD8A, CD4,和IL7R或CD 127),B细胞(CD 19MS4A1),髓系细胞(CD 14FCGR3A或CD 16)和自然杀伤(NK)细胞(KLRD 1NKG 7)(图1.1C),(2)与ENCODE沉淀的纯化细胞群体中的基因标记的相关性31(无花果)1D)和(3)基于TCR测序的T细胞克隆类型的分配.基于这些方法,我们将群集注释为单核细胞(群集0、5、11、12和16)、CD4。+T细胞(簇4、6、10、13、15和20)、CD8+T细胞(第1、8、9和17组)、NK细胞(第3和第7组)、B细胞(第2组)、巨噬细胞(第14组)和树突状细胞(DC,第18和19组)(图)。1E)。我们还按组织类型检查了构成测序的细胞类型的相对比例(如图所示)。1E)。我们观察到CD4减少+T细胞和B细胞在正常肾脏或肿瘤中相对于外周血(如图所示)。1E)。相反地,正如我们所预期的,我们也发现CD8增加了。+肿瘤中T细胞和巨噬细胞与外周血的关系(图1)。1E)。通过对正常组织和肿瘤组织进行高通量免疫组织化学检测,我们发现CD8的增加趋势与此相似。+和减少CD4+T细胞来自肿瘤与正常肾组织来源于ccRCC患者样本(补充图。2补充方法).

图1:由ccRCC免疫细胞产生的单细胞RNA测序结果。

a37,055例外周血原代免疫细胞、正常肾实质和肿瘤浸润性ccRCC患者的UMAP。b细胞分布按组织类型,外周血(蓝色),肿瘤(红色),肾脏(浅蓝色)。箭头显示潜在的、富集的或独特的组织型免疫细胞群。c在UMAP中表达典型免疫细胞标记的细胞百分比。d每个簇的基于Singler R包的预测免疫细胞表型的归一化相关值;基于欧氏距离的树状图。eUMAP显示了在ccRCC中推断出的免疫细胞类型,团簇由细胞类型和组织型的单细胞测序比例来着色。P基于单向方差的值;缺乏标记p值等于值>0.05。

外周血与肿瘤CD8优先重叠+T淋巴细胞

随着大量文献的出现,TCR的扩增在抗肿瘤免疫和免疫治疗中的作用越来越明显。11,我们首先要研究的是CD4的动力学。+和CD8+CCRCC中的T细胞克隆种。使用我们前面描述的scpertoire软件32我们为TCRA和TCRB分配了生产的TCR序列,并结合基因和核苷酸序列确定了克隆类型。对于ccRCC患者的T细胞,筛选和克隆型重建后,至少一个TCR链的恢复率为74.8%~87.6%。补充数据中提供了ccRCC样本的完整的克隆型信息表。1。T细胞克隆型在UMAP上有明显的分布,主要富集在簇1、4、6、8、9、13、15、17和20中(图1、4、6、8、9、13、15、17和20)。2A)。簇21是T细胞的例外,约占T细胞的19.6%,并与B细胞聚在一起,可能表明B和T细胞之间的细胞相互作用,并被排除在进一步的T细胞分析之外。克隆型的频率是在不同的病人样本中分配的,这样就可以在单个患者的背景下量化克隆型的数量。我们观察到克隆型频率增加,主要是在CD8。+T细胞簇(图1.2A)。在指定的NK细胞群3和7中存在扩增的克隆型,而在其他T细胞群中也有这些克隆型,提示T细胞可能与NK细胞或NK T细胞重叠表达。单个克隆和1~5个拷贝数的克隆横跨髓系簇(图)。2A),这可能是由于在表达整合过程中部分丢失了更精细的基因表达分化所致。33。分离T细胞类后,我们注意到CD8中前10位克隆所占的克隆型空间有着明显的差异。+T细胞与CD4细胞比较+横穿ccRCC患者的T细胞(如图所示)。2B)。这种趋势在肿瘤浸润和外周血CD8之间是一致的。+T细胞(图1.2B)。接下来我们会问CD8的一致性+T细胞扩增是肿瘤与外周血共同扩增克隆型的结果.我们发现CD8中共有的阵挛型有相对的病人特异性增加。+T细胞与CD4细胞比较+T细胞(图1.2C)。我们还注意到,两种CD8的患者阵挛型之间都有极小的重叠。+和CD4+T细胞(图1.2C)。CD8患者特异性重叠+阵挛型在外周血中显示出相对较大的池,导致肿瘤(如图所示)。二维空间)。有趣的是,患者3--肿瘤分期较晚期(pT3a相对于病人1和2的T1)--在血液中未见肿瘤特异性克隆型的扩张(图1)。二维空间)。在较先进的3 ccRCC患者中,两种阵挛型共占619个CD8型。+T细胞分布于UMAP簇中(图1)。2E),它支持T细胞克隆型既不是UMAP集群的决定因素,也不是功能指示的决定因素。这种与耗尽基因表达相关的克隆型的划分可能反映了肿瘤本身扩张的起源。34.

图2:T细胞类型和患者的克隆动力学不同.

a37,055个原代免疫细胞的UMAP与样本鉴定所指定的克隆型的频率覆盖。b为CD8指定的克隆型组占用的曲目空间+和CD4+CCRCC患者T细胞标本及组织类型分析。cCD8克隆重叠系数的定量研究+和CD4+CCRCC患者T细胞标本及组织类型分析。d每名患者的前十位克隆型相对于相应的周边或肿瘤人群的克隆型所占的比例。每种颜色都代表着病人独特的克隆型。e克隆型的分布按组织、UMAP群和ccRCC患者的突出(红色)前两个阵挛型,包括肿瘤特异性克隆型横跨所有簇。

CD8+在ccRCC肿瘤中T细胞表现出一个具有不同群体的转录连续体。

CD8亚群+T细胞有8个明显的团簇(图1)。3A)具有相对的组织特异性分布。3B)。了解这些新的CD8的分布+沿着UMAP的子簇,我们首先按组织类型检查单个细胞在每个簇中所占的相对百分比。组织浸润CD8+T细胞(肿瘤和正常肾)主要为CD8_0、CD8_1、CD8_3、CD8_5、CD8_6和CD8_7。3B)。从右到左穿过x+T细胞(左),可能代表组织浸润本身的过程。在SCRS文献中,人们担心细胞周期的变化会导致异质性的增加或亚群体的模糊不清。35,但CD8的增殖+T细胞是抗肿瘤免疫应答的重要替代标志。7。接下来,我们研究了增殖基因标记的变化,发现随着细胞从右向左在S期或G2M期增加,其分布与组织型相似,以CD8_6簇最多(见图)。3C).

图3:在ccRCC肿瘤中CD8+T细胞表现出一个具有不同群体的转录连续体。

aCD8的UMAP亚群+T细胞(原簇1、8、9和17)。bUMAP按组织型分布,每组细胞的相对百分率和绝对百分比为1%。cCD8细胞周期回归分配+T细胞按簇分配。d表达T细胞生物学标记的细胞百分比。eCD8+星系团(上面板)和阵挛型频率(下面板)的UMAP以弹弓为基础覆盖。36细胞轨迹从CD8_4开始进入五条不同的曲线:分支1(B)1),B2、B3、B4,和B5. f克隆型重叠系数在子簇之间。gZ-通过子簇将ssGSEA对选定基因集的归一化富集分数转化为Z。hCD8对抗pd-1治疗反应或缺乏反应的规范化浓缩评分+T单元(上面板)和每个分支的伪时间(下面板)。

为了更好的鉴别CD8+我们使用典型的和差异的T细胞标记来检测UMAP的基因表达差异(如图所示)。三维空间)有几种模式。第一个模式是发现一个天真的人CCR 7+ + Tcf7+出现在CD8_4中(如图所示)。三维空间)。寻找效应因子CD8+T细胞,接下来我们观察到IFNG+ PRF 1+T细胞,主要见于CD8_1和CD8_0。三维空间)。后者也表示免疫检查点,例如CTLA 4, HAVCR 2, PDCD 1,和TIGIT(无花果)三维空间)。这些免疫检查点在CD8_5和CD8_6的水平上都有较温和的表达;然而,CD8_6只表达了一些增殖标记物,例如Cdk 1, MKI 67, STMN 1,和TOP2A(无花果)三维空间)。为了检验单个或选定基因上的基因表达模式,我们使用了弹弓技术。36为了在子簇之间建立最小生成树,根据变化最大的基因生成曲线(见图)。3E)。我们确定了五条不同的曲线(标记为B)。1调至B5)的原点CCR 7+ + Tcf7+除了B1延伸到CD8_2外,其余的曲线与CD8_1的共同节点沿着相似的轨迹变化,并在不同的簇上分支,肿瘤浸润的CD8水平增加。+T细胞(图1.3E)。这些曲线也随CD8而变化。+基于TCR序列分析的T克隆型,根部无克隆扩张和B3、B4,和B5曲线终止于克隆扩张程度高于B的区域1或B2(无花果)3E)。在CD8_0、CD8_6、CD8_5和CD8_3亚组中也可观察到这种克隆型关系。3F)。相反,CD8_7与其他亚组有极小的重叠克隆型(图1)。3F)。这种关系也被认为是独立于个别病人排序的(补充图)。3)。为了评估基于这些分支的可能的功能差异,我们进行了基因集富集分析(图1)。第三代)37。如预期基于免疫检查点抑制剂的表达。三维空间CD8_0和CD8_5组显示终末分化和衰竭增加。第三代)。PRF 1细胞溶解基因富集在CD8_1中的表达+IFNG+缺乏免疫检查点的人群(图1)。第三代)。高增殖的CD8_6细胞具有较强的代谢活性,如三羧酸循环、糖酵解、DNA修复等。第三代)。B2曲线终止簇CD8_7优先富集细胞因子信号,如IL-2/STAT 5、转化生长因子β、1型干扰素等。第三代)。与不同CD8相关的免疫检查点抑制剂反应性+T细胞群22,我们接下来检查了与抗PD-1治疗反应或无效相关的特征的丰富(图1)。3H)。利用轨迹的序数构造,我们为细胞创建了一个伪时间变量,使我们能够看到曲线上富集度的差异。这一方法发现,在曲线B的末端,基因表达与抗pd-1的反应性有关。2和B的中点3、B4,和B5,对应于CD8_1中的细胞。3H、蓝线)。同样,我们观察到在B曲线的终点,抗pd-1治疗的基因表达总体上与无反应或进展有关。3、B4,和B5(无花果)3H,红线)。

单细胞CD4+CcRCC中的T细胞特性鉴定不同的瘤内人群

CD4+T细胞直接通过溶细胞机制或通过调节肿瘤免疫微环境,以多种方式影响肿瘤的发病。CD4亚群+T细胞显示9个不同的簇(图)。4A),具有类似的模式-如CD8 T细胞-以外周血CD4为主的组织分布。+右侧的T细胞导致组织浸润的CD4。+左边的T细胞(如图所示)。4B)。CD4_8仅由健康供者的外周血细胞组成,并从其余分析中剔除。像CD8+接下来,我们检查了UMAP的标准T细胞标记和差异T细胞标记(图1)。4C)。出现的第一个模式是天真的CCR 7+ + Tcf7+出现在CD4_1和CD4_3中(如图所示)。4C)。在肿瘤浸润的CD4_4细胞内,我们观察到Th1驱动蛋白的表达增加。Tbx 21(t-bet),激活标记LAG 3NR4A2以及细胞因子的表达。4C)。CD4_5和CD4_7均有调节性T(Tregs)细胞标记物的表达。4C),有较高的水平Foxp 3, IL2RA(CD 25),CTLA 4,和TNFRSF 18(GITR)在肿瘤占优势的CD4_5(图1)。4C).

图4:单细胞CD4+T细胞在ccRCC内的特性。

aCD4的UMAP亚群+T细胞(原簇4、6、10、13、15和20)。bUMAP按组织型分布,每组细胞的相对百分率和绝对百分比为1%。c表达T细胞生物学标记的细胞百分比。dCD4+子簇(上面板)和阵挛型频率(下面板)的UMAP(基于弹弓的覆盖)36细胞轨迹从CD4_1(根1)和CD4_3(根2)开始,用弹弓法计算所有曲线的相对假时间。e已占用的CD4储存空间+子集群。fTI占主导地位的CD4的十大标记物+子集群。点的大小与亚组中表达所指示的mRNA种类的细胞百分比有关。gZ-通过子簇将ssGSEA对选定基因集的归一化富集分数转化为Z。

基于CD4的细胞轨迹曲线的构建+子聚类,我们观察到CCR 7+ + Tcf7+簇CD4_1和CD4_3导致共同的CD4_4终止(如图所示)。4D)。不像其他CD4+T细胞,Tregs产生的曲线是不同的,从CD4_5到CD4_7,再到CD4_4(如图所示)。4D)。这可能代表了与其他肿瘤浸润的CD4相比,Tregs(由CD4_5和CD4_7共同分享)的一种独特的表达模式。+T细胞另外,与CD8相比+在CD4_4和CD4_5中有少量的克隆性扩展,并不是细胞轨迹的一个清晰的模式(图)。4E)。对于集群CD4_4曲线的公共终止点,我们接下来要检查是否有CD4的通用标记+肿瘤滤过与外周血CD4对ccRCC T细胞浸润的比较+T细胞肿瘤内浸润的CD4+T细胞,203个基因调整p值<0.05,对数倍变化≥0.5和∆细胞百分比>10%(补充数据)2)。肿瘤浸润性CD4上调+T细胞是热休克蛋白(HSPA1AHSPA1B)、JUN和FOS成分(FOS, ,和俊B)、MHC-Ⅱ分子(HLA-DRB)和分泌分子(CCL 5, GZMA,和GZMK)(图1.4F)。几个上调的基因被共享在所有肿瘤占优势的CD4簇中(如图所示)。4F然而,每个簇也有独特的表达标记。CD4_2和CD4_4均升高了IFNG(无花果)4F),但CD4_2在热休克蛋白中富集,而CD4_4具有细胞毒性成分,并且有表达。CD8A,这很可能代表了CD8的中度污染。+T细胞(图1.4F)。肿瘤浸润Tregs CD4_5有较高水平的肿瘤浸润性Tregs,CD4_5。CTLA 4、GITR(TNFRSF 18)和TIGIT。此外,CD4_5具有高度特异性表达。CCR 8莱恩,与以前的报告相对应38,39。CD4_6集落增加了IL-6细胞因子的表达,OSM 6,和AREGSOCS 3,白介素信号的下游。4F)。差异表达与通路分析一致,CD4_4富集用于细胞溶解和Ⅰ型IFN信号(如图所示)。4G)。CD4_5和CD4_7 Treg对代谢途径有较好的富集作用,肿瘤浸润性CD4_5的终末分化程度较高。4G)。这个OSMCD4_6在IL-6/JAK/STAT 3信号转导和炎症反应基因中富集。4G).

CCRCC中明显浸润的巨噬细胞存在转录差异

与先前观察到的整体增加巨噬细胞和减少单核细胞在整合的UMAP(图)。1E接下来,我们将重点放在髓系人群的差异分析上(如图所示)。5A)。在单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞中,出现了20个不同的簇(如图所示)。5A)。组织特异性分布,大多数肿瘤浸润髓系细胞在0,3,7,8和15亚组。5B)。相比之下,正常肾实质和外周血由大多数单核细胞亚群组成(图1)。5B)。种群的分配使用标准标记,此外,除了前面描述的Singler方法外,还使用以下标记识别了巨噬细胞亚群(0、3、7、13和14)CD1C, CLEC10A(CD 301)FCER1A,和管理系统更新1(无花果)5C)。总的来说,我们观察到CD 14中的比例下降了。+与外周血相比,组织浸润髓系细胞中的单核细胞增多,巨噬细胞增多(见图)。5D)。正常肾实质CD 14含量有不同程度的增加。CD 16单核细胞,无显着性差异(图5)。5D)。如前所述,我们发现少量DC(15、16和19)分别与常规DC1(CDC 1)、浆细胞样DC(PDC)和单核细胞衍生DC(MoDC)相关(补充图1)。4).

图5:ccRCC的单细胞髓系特征。

a髓系细胞的UMAP亚群(原簇4、6、10、13、15和20)。bUMAP按组织类型分布,在每组中按组织分布细胞的相对百分比。c表达髓系和巨噬细胞标记的细胞百分比。P由单向方差分析得出的数值。d按组织类型分类的细胞类型与总抗原提呈细胞的比例。e巨噬细胞亚群:肿瘤相关巨噬细胞1(TAM_1)(n=1262),TAM_2(n=840),TAM_3(n=594),外周巨噬细胞(PM)(n=275),和常住巨噬细胞(RM)(n每组细胞的相对百分比和绝对百分比为194%。f巨噬细胞亚群的顶级差异表达标记。g以弹弓为基础的巨噬细胞umap36细胞轨迹从RM和TAM_2开始,一直持续到PM较小的UMAP显示了由细胞轨迹产生的假时间。hZ-通过子簇将ssGSEA对选定基因集的归一化富集分数转化为Z。

然后,我们分离出5个巨噬细胞亚群,根据各组织来源细胞的相对百分比重新命名为肿瘤相关巨噬细胞1(TAM_1)、TAM_2、TAM_3、常驻巨噬细胞(RM)和外周巨噬细胞(PM)。5E)。虽然在保持全球表达结构的UMAP上分布相似,但这五个集群有不同的表达模式(图1)。1e,5E)。例如,CD 88 (C5AR1)CD 54+ (ICAM 1)TAM_1表达趋化因子和细胞因子水平增加,如CCL 3, CCl 4, CXCL 2,和IL 10CD 64 (FCGR1A)CD 16 (FCGR3A)TAM_2亚群表达载脂蛋白基因。APOE、溶酶体脂肪酶(LIPA)和铁卟啉(SLC40A1);及CD1C CD 86+TAM_3IL1R2和Langerhin(CD 207),皮肤居住的Langerhans细胞的标记物(如图所示)。5F)。在pm子簇中,细胞粘附分子水平最高。CLEC10A, (CD62L)ITGB 7,它可以用ITGA 4(CD49d)或ITGAE(CD 103)。像CD8+T细胞,我们建立了基于不同基因的细胞轨迹,发现两条不同的曲线收敛到TAM_3和PM(图1)。5G)。为了评估巨噬细胞的潜在功能差异,我们进行了基因集富集分析。5H)。正如以前在单细胞数据中观察到的那样。25未见明显的M1或M2极化。例如,TAM 1对与M2巨噬细胞间共同相关的基因集具有富集作用,如血管生成和脂质介质的产生,同时也具有最高水平的肿瘤坏死因子ɑ信号富集,这是M1巨噬细胞的共同特征。在三个TAM亚组中,1型和2型IFN信号均有一定程度的富集(图1和2)。5H)。非TAM亚组RM和PM的富集水平相对较低,除促炎症信号和糖酵解外(见图)。5H)。我们还发现,在TAM_2和TAM_3中,MHC-I对脂类抗原的加工和提呈增加,而TAM_1对多糖抗原的富集程度较高(附图)。5).

CD8的差异预后意义+T细胞和TAM子簇

这些数据显示了CD8的转录差异。+T细胞和TAMS在ccRCC中的表达。为了确定这些转录差异是否导致肿瘤反应中的功能差异,我们研究了是否可以从SCRS数据中发展出具有预后价值的基因标记(图一)。6A)。使用ccRCC的癌症基因组图谱数据集19我们将队列分成两半,产生了一套训练和测试集。我们从CD8的每个子群中分离到显著的上调基因。+T细胞和巨噬细胞根据训练结果选择每种细胞类型的顶级模型。有趣的是,我们看到了在CD8_6和基于TAM_3的标记中,我们训练的所有模型和不同大小的基因签名的总体生存差异的高性能。将模型应用于267例原发性肿瘤的检测队列中,发现这两种信号均表现较强,并将25%的ccRCC分为预后较差组,分别相当于风险比3.44和2.59(图二)。6B)。我们还观察到,不良预后预测与组织学分级增加有关(图一)。6C)。没有明确的联系,在组织学分级的基因在每一个标志(补充图)。6)。然而,CD8_6和TAM_3的分类之间存在着显著的相关性,在分为预后良好(都有188例)和预后差(都有35例)、Fisher的患者中,两者有高度的重叠。p值=9.3e−15。有趣的是,尽管如此,CD8_6信号更广泛地适用于区分所有TCGA数据集的总体存活率(补充图)。7).

图6:CD8+T细胞和TAM亚群基因标记的预后价值。

a原理图的机器学习方法用于签名的开发、选择和测试,基于k近邻算法使用TCGA肾透明细胞癌数据集。bKaplan-Meier曲线用于CD8_6亚类特征的检测子集,并通过模型分配显示相应的组织学分级分布。c具有组织学分级分布的TAM_3子簇特征测试子集总体生存的Kaplan-Meier曲线p价值。d4例正常人、68例原发性ccRCC、4例转移性T细胞937,713 T细胞密度图,并采用质量流式细胞术进行定量分析。18. eCD 45中位表达增高的标记+CD3+CD8+Pd-1+基-67+与其他CD8细胞比较+细胞。调整后p使用Welch‘s的所有指示标记的值<1e−12T测试一下。fCCRCC原发肿瘤和健康标本按CD 45的比例细分为苔藓+CD3+CD8+Pd-1+-67+相对于整个CD 45+CD3+CD8+按组织学分级。

超越mRNA表达,我们想看看我们是否能在肿瘤标本中识别增殖性CD8_6亚群。从4例健康组织标本、68例ccRCC原发肿瘤和4例ccRCC转移标本中分离的T细胞进行大量流式细胞术检测,我们鉴定了pd-1。+基-67CD 45的14.6%的子集+CD3+CD8+T细胞(图1.6d)。CD 45的大多数+CD3+CD8+T细胞为pd-1。+基-67(42.4%)或PD-1基-67(39%)6d)。除了pd-1,这个CD8的增殖亚群+与其他CD 45相比,ccRCC的T细胞ctla-4、icos、4-1bb(CD 137)、Tim-3、HLA-DR和CD 38水平升高。+CD3+CD8+T细胞(图1.6E)。计算pd-1的比例+基-67细胞占总CD8的比例+T细胞按样本分类,将样本分为3组。我们观察到pd-1最高层的CD8_6基因标记的分布与pd-1相似。+基-67细胞在更高级的组织学分级(图)。6f).

讨论

随着人们对免疫治疗方法的进一步了解,肿瘤微环境中免疫细胞的表型和功能特征已成为人们所熟知的影响预后和疾病结局的因素。全面了解基因签名,以充分了解特定免疫群体在癌症中的作用,具有很高的病理相关性;不仅在确定肿瘤进展过程中的免疫失调决定因素方面,而且作为选择患者、评估免疫治疗受益的可能性和进一步确定临床意义亚群体方面的有用工具。

尽管免疫治疗是晚期和治疗的主要治疗手段--幼稚的ccRCC3,40,41,ccrcc肿瘤与其他免疫治疗应答性肿瘤相比,有许多违反直觉的免疫发现。42。例如,与其他对免疫检查点阻断有反应的肿瘤不同,ccrcc的肿瘤突变负荷相对较低,这被认为是T细胞浸润的驱动因素。19,43,而ccrcc的突变负担与抗pd-1治疗反应无关。15。此外,尽管突变负担低,ccrcc在tcga内的肿瘤类型中T细胞浸润评分最高。44。同样,抗pd-1治疗的疗效与肺癌和黑色素瘤的HLA杂合性有关。45,而ccRCC的情况似乎并非如此。15。综上所述,这些不同的发现表明,对于ccRCC肿瘤来说,免疫室之间存在着更为复杂的相互关系。最近的一些研究在单细胞水平上探索了人类ccrcc。30,34,46,47该技术尚未应用于肿瘤浸润免疫细胞来表征全球转录免疫和T细胞受体景观,以及导致这种独特肿瘤环境的潜在机制。

T细胞被认为是适应性抗肿瘤免疫应答的关键效应。几项研究表明,这些细胞与ccRCC治疗不良反应和患者生存不良有关。6,13...在一项综合研究中,T细胞代表了大多数ccRCC病例中的主要淋巴细胞群,而B细胞很少被检测到。23,与我们发现的CD4增加一致+和CD8+T细胞(图1.1)。我们发现血液中的CD8+T细胞是非异质性的,反映肿瘤浸润性CD8的程度较低。+T细胞转录谱图。3A,d)。组织CD8的结构+T细胞流形,我们发现四个不同的分支可能代表肿瘤浸润时的转录状态,其中两个与pd-1有关。+提姆-3+精疲力竭子簇,增殖子簇,和第四个细胞因子信号较高水平(图)。3E,g)。后者CD8_7也是独特的,与其他肿瘤浸润的优势子簇相比,其克隆型重叠最小。黑色素瘤近期单细胞分析显示CD8。+活化程度较低的T细胞和耗尽表达模式的T细胞与抗pd-1反应的改善有关。22。这些反应性T细胞有极小的共同克隆型,类似于CD8_7。22。其他研究发现ccRCC肿瘤多克隆CD8。+T细胞具有“免疫调节”表型,较少克隆CD8的肿瘤具有较低的细胞毒性。+T细胞48。最近对基底细胞癌抗pd-1治疗前后的SCRS研究发现,CD 39的数量增加,克隆性扩大。+CD8+免疫治疗后T细胞49。然而,CD 39+CD8+在ccRCC中的T细胞已被证明与病理分期增加和整体生存不良有关。50。根据基因表达,我们的CD8_0和CD8_6亚群与该细胞群非常吻合,这些细胞群分别占晚期患者3细胞的57%和46.5%。在发展CD8特征的过程中,我们发现该模型区分了整体生存,但也与组织学分级的增加有关,表明更积极的组织学特征也与独特的转录反应有关(图一)。6B,c)。有趣的是,CD 39数量较多的患者+CD8+T细胞对一种多酪氨酸激酶抑制剂苏尼替尼的反应有所改善,提示对CD8衰竭表型的评估+T细胞可能有助于临床决策或治疗选择。50。这特别有趣,因为我们发现了共享的CD8。+,但不是CD4+,CCRCC患者外周血T细胞克隆型。2)。虽然我们发现CD8的重叠系数稳定在13%左右。+克隆型,还需要做更多的工作来评估CD8的浸润和外滤的动态。+T淋巴细胞进入肿瘤床。

精疲力竭的CD8+T细胞表型与晚期组织学特征及疾病进展风险增加有关。44,48,50,增加功能失调的DC6,巨噬细胞数量增加18。然而,围绕髓系细胞在ccRCC肿瘤预后和进展中的作用存在争议。这在一定程度上可能是肿瘤浸润髓系细胞转录和表型可塑性的结果。18,25。我们的分析表明CD 16是不同的。+肿瘤内髓样细胞与外周血或正常肾实质相比较,肿瘤相关巨噬细胞的总体增加(图1)。5A,d)。M2标记物,如CD 163和CD 204,与ccRCC的临床结果不佳有关。18,51在TAM_1和TAM_2亚组中最高。5G)。这是尽管没有明确的鉴定典型的M1或M2巨噬细胞亚群(图一)。5H)。TAMS基因签名的模型训练发现,使用从TAM_3衍生出来的基因可以更好地进行总体识别(图3)。6B),这是一个独特的子簇,它对M2巨噬细胞、血管生成和脂质介质产生的基因富集水平较低(如图所示)。5H)。TAM_3分级与CD8_6有较高的独立程度,提示CCRCC淋巴和髓系细胞之间可能存在相互作用或相互协调。CcRCC的免疫原性增强与通过mhc-i上调抗原呈递机的表达有关。44。在髓细胞亚群中,DC亚群中的MHCⅠ类处理和呈现机制存在基因富集,而巨噬细胞增加了MHCⅡ类的富集(补充图)。5)。虽然检测到了几个不同的DC群体,并且已知肿瘤抗原交叉表达功能的cDC 1子集(第15亚群)有增加的趋势,但进一步的分析受到分离的DC总数的限制。

我们对免疫细胞进行单细胞分析的策略,考虑了淋巴细胞和髓系细胞在流动分选过程中的频率,为识别细胞类型比例与相应免疫细胞状态之间的关系提供了有力的手段。根据我们对多个免疫群体的研究中定义的群体结构和基因程序,我们发现尽管患者在每一种细胞状态中表现出不同比例的淋巴和髓细胞,但状态的数量仍然有限。我们的研究有局限性,包括样本总数很少(n(7)某些细胞群体的稀缺性,以及对这些免疫群体进行进一步功能描述的必要性。然而,结合在一起,我们提供了ccRCC免疫细胞的转录和克隆型图谱,希望能深入了解ccRCC的生物标志物和治疗靶点。


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