脂质代谢途径的综合图谱

脂质介质是多种生物学功能的主要因素，与疾病密切相关。最近的脂质组学方法使得分析多种代谢物和单个脂质介质的关联成为可能。这种系统的做法使我们能够确定生物相关性的关键变化。在此背景下，基于知识的脂质介质路径图将有助于可视化和理解这些因素的整体相互作用。在这里，我们建立了一张精确的脂质介质代谢途径图(LimeMap)，以可视化各种疾病中动态变化的脂质介质的全面轮廓。我们以ω-3和ω-6脂肪酸代谢物及其各自的代谢途径为重点，通过人工管理公共数据库和相关研究中的参考信息，构建了地图。最终，LimeMap由282种因子(222种介质，60种酶、受体和离子通道)和来自102项相关研究的279个反应组成。用户可以使用CellDesigner和VANTED软件修改地图并可视化特定于其目的的测量数据。我们期望LimeMap将有助于阐明脂质介质的综合功能关系和途径。

脂肪介质来源于脂肪酸(FAS)，是一类重要的生物活性代谢物。它们是由体内脂质代谢酶产生的，并通过特定的G蛋白偶联受体(GPCRs)发挥作用。前列腺素(PGs)、白三烯(LTs)和羟基二十碳四烯酸(HETES)是花生四烯酸(AA)和ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)的代谢产物。近年来，有关二十烷类化合物代谢的酶被广泛研究，其代谢途径被称为AA级联。此外，对二十烷类脂质介质的gpcr大多已经确定并进行了表征。1.

越来越多的证据显示，二十烷类药物在各种病理和生理反应中起着重要作用，包括炎症反应、血管扩张、血小板聚集、哮喘、发热、疼痛和癌症。1,2,3,4,5,6,7,8。因此，AA级联被认为是一个有效的药物靶点。例如，非甾体类抗炎药物，包括针对环氧化酶(Coxs)的阿司匹林(pg生物合成的关键酶)，是应用最广泛的药物之一；靶向Lt受体的药物(如Pranlukast)被用作抗过敏疗法；以及PGE 1-衍生物和PGF。2α分别用作抗血小板/血管扩张剂和引产药物。9,10,11,12.

除了AA级联外，最近的研究还将脂质介质的储备扩展到ω-3 PUFA，例如二十碳五烯酸(Epa)和二十二碳六烯酸(Dha)以类似于aa的方式被氧化，产生各种抗炎和促分解介质，例如分解素和保护素。13,14,15,16,17.

通过对脂质介质产生酶和脂质介质受体等蛋白质因子的鉴定和功能分析，对脂质介质的生物学作用进行了研究。利用转基因动物进行的研究揭示了个体脂质介质的各种病理生理作用。然而，由于脂质介质具有前体和生物合成途径，而且往往具有功能相互作用，因此有必要对大量脂质介质进行全面分析，以揭示它们在体内的不同作用。

最近，质谱仪在速度、灵敏度和选择性方面的改进加速了对脂质介质的综合分析策略的发展，这些策略以前是通过单目标分析(如酶联免疫吸附法)来评估的。18,19,20。目前，100多个与脂质介质相关的代谢产物可以同时量化在一个样本中，所得数据可以通过多元分析(如主成分分析(PCA)、偏最小二乘回归(PLS)或PLS-判别分析(PLS-da)和聚类分析)来评估。21,22。基于脂质介质定量特征的分析可以识别对特定生物学功能有重要意义的物质，也可以揭示不同脂质介质之间的功能相似或相互作用。然而，如果没有基于路径的解释，分析有时就无法证明生物学意义。将代谢途径信息与代谢物定量数据相结合是一种有效的代谢组学策略：在代谢途径图上将脂质介质和酶(即调节因子)联系起来，因此对生物过程的全面概述变得十分明显。为此，对资源和工具的需求日益增长，这些资源和工具可以将复杂的组学数据集分离出来，并将其可视化。为一般代谢组学和脂肪组学的目的，公共数据库，如京都基因和基因组百科全书(KEGG)(Http://www.kegg.jp)23、豹(Http://www.pantherdb.org)24、血脂图(Http://www.lipidmaps.org)25、人体代谢数据库(HMDB)(Http://www.hmdb.ca)26，和PubChem(Https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)已成为必要的研究资源。还有一些工具是特定于领域或兴趣的，目的是在生物路径网络上可视化特定类型的组学数据。27,28,29,30,31,32,33,34,35。然而，目前还没有足够的精确性和覆盖面的路径图来可视化脂质介质数据集。因此，本研究的目的是填补这一空白。脂质介导代谢途径图(LimeMap，LimeMap)是将ω3-FA和ω6-FA来源的脂质介质和相关代谢产物映射到代谢途径上的相关酶和受体，目的是同时可视化和注释从广泛靶向介质脂质组学分析中获得的实验数据。它整合了手工管理的文献、公共知识库和数据库中的信息。为了演示它的应用，我们测量了小鼠急性炎症模型中的脂质介质，并将其映射到LimeMap，并以与CellDesigner和VANTED兼容的格式实现。我们证明，LimeMap可以有效地可视化从全面的脂质介质分析得到的数据集。

石灰石的发展及其特点

我们通过人工管理相关的研究和数据库，如基因组资源联盟、HMDB、KEGG、脂质图谱和PubChem，整合了脂质介质代谢途径的最新知识，从而构建了LimeMap。代谢过程之间的关系是通过使用标准系统生物学标记语言(SBML)格式的CellDesigner软件构建的，并将其可视化为系统生物学图形符号(SBGN)。33。软件生成的XML格式文件(LimeMap.xml)33可以灵活编辑和扩展用户信息和数据。通过整合当前的知识，LimeMap可以支持研究人员全面分析脂质介质之间的相互作用(如图所示)。1)33。最终，LimeMap.xml包含282种因素(222种脂质介质和代谢物以及60种酶和受体)和来自102项相关研究的279种反应，每种反应都在“说明”一节中对每个节点、链接、酶和受体进行注释。地图还被移植到地理标记语言(GML)格式的VANTED软件(LimeMap.gml)中。34。这两个文件中的LimeMap都可以作为LimeMap.xml/LimeMap.gml使用。本研究报道的LimeMap最初版本主要关注ω6-和ω3-FA代谢产物，尽管还有其他几类生物活性脂质，如溶血磷脂，它们也具有重要作用。ω6-和ω3脂质介质通路都非常重要，与控制炎症反应等生物功能密切相关。16。由AA：PGS，LTS，HETES和EET衍生的代谢产物组成了一个名为eicosanoid的生物活性脂质家族，包括在地图中。该地图还包括ω3-FA代谢物，分解素和树脂，这是必要的抗炎过程和解决炎症.此外，我们还使用小鼠基因符号来描述地图中与脂质介质相关的酶和受体。虽然人和老鼠的脂质中介途径被认为是普遍保守的，但已知它们因某些因素而不同。例如，脂氧合酶的部分作用在人类和老鼠之间有所不同。36人ALOX 15的表达主要产生15-脂氧合活性，而小鼠ALO 15的表达主要产生12-HpETE。人ALOX15B从AA中产生15-HpETE，而小鼠Alor15b则具有花生四烯酸8-脂氧合作用。因此，应该注意物种的差异。

LimeMap可与Garuda平台上的CellDesigner软件和VANTED软件一起使用(Http://www.garuda-alliance.org/).

小鼠急性炎症模型脂质介质谱分析

为了证明LimeMap的应用，我们对正常小鼠和合成双链RNA多聚肌苷-聚胞苷酸(PolyI：C)诱导的急性炎症模型进行了脂质介体谱的比较分析。37,38,39。小鼠腹腔注射聚乳酸(polyi：c)或载体，2h后取血浆，用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析脂质介质谱。19。轮廓数据将提供有关脂质介质的炎症反应的重要信息，然而，在比较不同实验之间的剖面数据时，必须考虑取样条件，如麻醉。我们共测量了158种代谢物(补充表)。2)，其中66例在血浆中检出。代谢物的信号强度(归一化为内部标准)汇总在补充表中。3。在158种代谢产物中，除油酸乙醇胺、叠氮酰-PAF、PGE 1-EA、PGK 2和7，17-氢DPA外，其余均位于LimeMap上.为了阐明多元I：C治疗对代谢途径的影响，我们用细胞设计软件(图1)在LimeMap上可视化了脂质介质的折叠变化。2A)。我们还用VANTED软件在LimeMap上绘制了脂质介质的数量。2B)。图中的地图。2成功地阐明了聚I：C治疗对血浆脂质介质代谢途径的影响。来自LimeMap上的血浆样本的数据清楚地显示出AA衍生代谢物的总体增加，这与LA衍生、EPA衍生和DHA衍生代谢物的减少形成对比(图一)。2一个,b)。再一次，地图可视化使我们能够识别活性路径：PGD 2及其代谢物，以及PGE 2及其代谢物，在多I：C处理下明显增强(图1)。2A)。应该指出的是，并非所有变化都具有统计学意义(补充表)3)然而，基于路径的评估提供了更全面和直观的信息，以了解与炎症相关的疾病(如传染病)的生物学功能和生物标记物，与代谢物的明智比较相比，这些信息更为直观。40,41,42.

以这种方式，LimeMap是一个有用的手段，以全面比较脂质介质的概况。

总之，我们开发了LimeMap作为一个工具，以便于全面分析脂质介质数据。用户可以通过CellDesigner和VANTED软件修改地图和可视化测量数据。目前，地图的覆盖范围仅限于我们策划的内容和我们所知道的。有必要继续努力，根据反馈、校正和研究界最新数据建立和扩展路径，以开发地图并使其不断更新，并进一步提高其可用性。

作为今后使用LimeMap的一个项目，有关代谢反应的动力学规律可以以SBML格式分配给MAP，此外，我们还计划建立一个仿真模型。最后，我们计划在特定组织和各种生理条件(如衰老)中积累脂质介质的轮廓，并试图利用limeMap途径揭示脂质介质的功能网络。43,44.

石灰岩的构造

LimeMap中的代谢物主要包括Yamada等人描述的代谢物，19世卫组织开发了一种同时分析主要脂质介质的方法。此外，为了描述代谢途径，我们手动编制了有关脂质介质、它们之间的代谢相互作用以及与代谢和功能相关的因素(如酶和受体/离子通道)的信息，这在两个公共数据库中都有描述[基因组资源联盟(Http://www.alliancegenome.org)，人类代谢数据库HMDB(Http://www.hmdb.ca)26、KEGG23，如地图的“注释”部分所指出的，以及出版的手稿。基本LimeMap主要是通过使用CellDesignerVersion4.4软件构建的。该映射符合基于XML的数据交换格式SBML，并以符合SBGN标准的CellDesigner图形符号表示。使用SBGN过程描述语言生成MAP内容、因素和反应，这有助于状态转换的可视化。

对于MAP的构建，每个脂质介质被描述为一个简单的分子，构成通路的边缘。分子式、分子量、化学名称和Inchi键等信息主要是从PubChem数据库收集的，并包含在每种脂质介质的注释部分。这些分子是按照代谢过程逐步连接的。代谢酶，通过老鼠的基因符号描述，连接到节点作为催化因子。此外，与特定脂质介质相关的受体作为相关的脂质介质被放置在地图上。酶和受体主要是通过小鼠基因符号来描述的，它们来自基因组资源联盟(Http://www.alliancegenome.org)，而基因名称、同义词、人基因和大鼠同源基因则包括注释部分。为了通过几种图形方法实现测量值的可视化，我们还使用基于XML格式的LimeMap的VANTED软件构建了一个GML格式的地图。

小鼠急性炎症模型脂质介质谱分析

动物

雄性C57BL/6J小鼠是从查尔斯河实验室国际公司(日本神奈川)购买的，在习惯化后8周龄时用于血脂分析。老鼠被单独安置在一个装有纸屑的笼子里，允许他们免费获取食物和水。饲养条件为：室温23℃，相对湿度60%，光照-暗周期12h(7：00~19：00)。按照Tsumura&Co.实验动物保护和使用指南对小鼠进行饲养和使用，实验前各组间进行平均体重匹配并使用。所有实验程序均经Tsumura&Co.实验动物委员会批准后进行，并按照日本卫生、劳动和福利部动物实验指南进行。

多元I：C的管理

Invivogene[PolyI：C(HMW)，美国圣迭戈](PolyI：C(HMW))用10 ml生理盐水(日本东京大冢制药有限公司)在70°C下加热10 min，溶液在室温下冷却1h，腹腔注射6mg/kg，以确保适当的退火。9只小鼠给予PolyI：C，10只小鼠给予生理盐水作为对照组。我们没有考虑到致盲。所有小鼠均在注射的同时给予蒸馏水。

血液取样

治疗2小时后，用异氟醚麻醉小鼠(AbbVie Inc.，北芝加哥，IL，美国)，用EDTA.2 K(日本大阪华科纯化学工业公司)采集下腔静脉的血液。血样在4℃离心制备血浆样品，保存在−80°C，待使用。

脂质介质的LC-MS/MS分析

用聚I：C.提取低分子量代谢物，提取低分子量代谢产物，取1ml含内标混合物的甲醇(4-前列环内酯-d6、TXB 2-d4、PGE 2-d4、PGD 2-d4、LTC 4-d5、LTB 4-d4、5-HETE-d8和15-HETE-d8、0.25 ng/μl和AA-d8的10 ng/μl)；全部来自美国密苏里州安阿伯的开曼化学公司，在室温下与100μl的血浆样品混合5分钟，然后在15,000℃下离心。g3分钟。上清液用4毫升0.1%甲酸稀释，然后轻轻混合。将该混合物装在预条件固相萃取盒(STRTA-X，10 mg/1ml，phomenex，Torrance，CA，USA)上，用0.1%甲酸1ml洗涤，再用15%乙醇1ml洗涤。在甲醇中用2 5 0μ1的0.1%甲酸洗脱，然后用真空蒸发器还原洗脱液，在甲醇的2 0μ1中进行重组。用5微升的样品进行LC/MS分析。LC/MS系统由两个LC-30AD泵、一个SIL-30AC自动取样器、一个CTO-20A柱烘箱、一个CBM-20A系统控制器和一个三四极质谱仪LCMS-8050(岛津)组成。色谱分离采用反相色谱柱C8(动力学C8，2.1×150 mm，2.6mm，μm，phomenex).利用LCMS溶液软件和LC-MS/MS方法软件包(Shimadzu)对脂肪介质进行色谱采集、质谱峰检测和波形处理，其中包含方法文件，规定了分析条件，并对AA、EPA或DHA等158个脂质介质的数据分析参数进行了分析。计算各量化离子的峰面积，并将其归一化为内部标准。对于归一化，检测峰的强度除以同一类别标准的峰值强度。代谢组学数据的处理采用Excel软件(Microsoft Corporation，Redmond，WA，USA)。原始数据中缺失的值被最小正值的一半所取代，这些数据用于随后的统计分析。