抗人抗体分枝杆菌转运蛋白介导结核病的保护

结核分枝杆菌(MTB)暴露会引起抗体反应，但活动性肺结核患者是否会产生保护性抗体，以及针对哪种抗原，目前尚不清楚。在此，我们从一名患者的记忆B细胞中产生单克隆抗体，以研究活动性感染时的B细胞反应。这些抗体是四种不同B细胞克隆的成员，针对Mtb磷酸转运体亚基PstS 1。抗体p4-36和p4-163牛分枝杆菌-BCG和Mtb水平在体外人全血生长抑制试验中呈FCR依赖性；同时，p4-36和p4-163的种系版本不与Mtb结合。P4-36和p4-170与PstS 1配合物的晶体结构分别在2.1Au和2.4Ar处测定，揭示了两个独特的PstS 1表位。最后，在Mtb感染的Balb/c小鼠中预防性应用p4-36和p4-163，可减少50%的细菌肺负荷。我们的研究表明，抑制性抗PstS 1 B细胞反应发生在活动性肺结核.

暴露于结核分枝杆菌(MTB)导致一系列的结果，其中之一导致活动性结核病(ATB)疾病。1。免疫反应的先天和适应性都与mtb的免疫有关。2,3，但是体液免疫的作用，特别是抗体的作用，仍然存在争议。4,5。一些研究表明，抗体可能在至少一部分曾经接触过mtb的健康人群中起到保护作用。4,6,7,8，抗体反应与实验性结核病疫苗的保护效果密切相关。9。在活动性疾病中，抗糖脂脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗体效价升高与感染严重程度降低有关。10，有证据表明B细胞功能障碍在积极的疾病，解决后，治疗11。此外，在活动性感染过程中，检测到抗mtb磷酸转运体psts 1的血清抗体。12,13。然而，从ATB患者中分离出的单克隆抗体的功能特性尚未得到证实，目前尚不清楚这些抗体是否具有抗菌作用。

本研究以免疫显性抗原PstS 1为研究对象，探讨ATB过程中B细胞的应答。我们从1例抗PstS 1反应增高的患者中分离和分析了85株单克隆抗体，并从具有抗BCG和Mtb活性的不同克隆中发现了两种抗体，p4-36和p4-163。结构分析表明，这两种抗体针对PstS 1上的两个不同的表位，不相互竞争。在Balb/c小鼠感染Mtb之前，两种抗体都能减少50%的肺部细菌负担。我们的数据表明，p4-36和p4-163都具有抗菌活性，并提供了在活动性肺结核病过程中产生保护性抗体反应这一概念的第一证据，这一发现可能为治疗性和预防性疫苗的设计提供参考。

PstS 1特异性单克隆抗体的分离

我们招募了26名住院病人(补充表)。1)。所有患者均接受标准治疗，康复，并最终出院。我们使用两株致病性Mtb菌株H37Rv和CDC 1551的裂解物筛选了患者血清中的抗Mtb抗体反应。与健康社区对照组不同的是，大多数患者(23/26)通过酶联免疫吸附试验(ELISA)显示血清对至少一种溶解物的反应性(见图)。1A，b)。非致病性Mtb-H37Ra可溶性溶酶体与细胞壁组分抗体滴度的测定14显示了对这两种成分的反应，但对Mtb表面有较高的反应活性(如图所示)。1C)。为了确定抗体对特定Mtb蛋白的反应性，我们检测了5种表面暴露蛋白的血清(内部生产，补充图)。1)在人类感染中引起抗体反应(如图所示)。1D-h)15,16。最强烈的反应是针对PstS 1。12(无花果)1D，i)，这与Mtb毒力有关。13这是先前发现的包含氨基酸序列变异的三个基因之一，在保守的表位中进行了多样化的选择。17,18。因此，我们决定对PstS 1的抗体反应进行表征。

我们关注一个病人，第4页，他对PstS 1有最强的个体反应，并且在他的治疗过程中保持了较高的抗PstS 1反应(如图所示)。2A)。因此，我们试图分离针对PstS 1的mAb，并测试其对Mtb感染实验模型的影响。我们从全血中分离出外周血单个核细胞(PBMCs)，并对单个IgG+，PstS 1+B细胞进行了分类，这些细胞占IgG+B细胞总数的0.5%。2B)19。单细胞Ig PCR扩增了102条重链和90条轻链；20其中，85个构成了天然的重对和轻对(补充图)。2)。与以前关于人类抗mtb B细胞反应的报道一致。7，大多数抗体序列不是克隆的。基于VH DH JH、VL，和JL在CDRH 3中的识别率>75%21在16个序列中共鉴定出5个克隆家族(图1)。2C)。如前所述21，VH与V相比，克隆重链的序列发生了更多的变异。H不是克隆的一部分的序列(图)。二维空间)，但两组都有相似的VH基因使用分布(附图)2B)。我们从在IgG 1表达载体中表达的四个克隆中产生了9个抗体。20(无花果)2E，f表达的抗体呈红色)。我们无法从克隆5变异体中扩增轻链，因此该克隆没有产生抗体。除p4-31外，所有被测mAb均与PstS 1反应强烈(解离常数在纳摩尔范围内，附图)。3)，用ELISA法与Mtb裂解物进行比较(见图)。2G-I)。在我们生产的9种抗体中，mAb p4-36和p4-163与细菌裂解物的结合最强(图1)。2H，i)。与同型对照相比，这些mAb还与全菌H37Ra-mCherry结合(附图)。4)。因此，我们决定在其余的研究中集中精力研究这些抗体。

首先，由于p4患者自然感染过程中产生了抗PstS 1单克隆抗体，我们试图研究亲和力成熟对其活性的影响。P4-36和p4-163均表现出较低水平的体细胞高突变，其中p4-36在重链和轻链中分别有6个和12个氨基酸的变化，p4-163在重链和轻链中分别表现出10个和8个氨基酸的变化。尽管如此，我们假设这些突变为mAb提供了结合PstS 1和Mtb裂解物的能力。为了验证我们的假设，我们将p4-36和p4-163的氨基酸序列恢复到它们的生殖系序列(补充图)。5A，b)，类似于以前为其他自然诱发的mAb所做的工作。22，从而产生每种抗体的未突变预测生殖细胞株(Gl)版本：P4-36gl和p4-163gl。与成熟的PstS 1抗体以及H37Rv和CD 1551 Mtb裂解物的结合进行了比较。除mAb p4-36gl与成熟的mAb(p4-36mt)有相似的结合作用外，两株mAb在体细胞高突变后的结合率均有显著下降(p4-36mt)。然而，SPR测量显示亲和力降低了4.7倍(如图所示)。2J，补充图。5C-g)。为了进一步研究重链或轻链中发生的突变对抗体活性的影响，我们在重链成熟时产生嵌合抗体，轻链为生殖细胞(HCmtLCgl)，反之亦然(HCglLCmt)。结合试验表明，对于p4-36，轻链上的突变比重链中的突变更显着，而p4-163则是重链上的突变比轻链中的突变更重要(补充图)。5C-g)。总之，我们的结论是，mAb p4-36和p4-163对PstS 1和自然感染过程中获得的体细胞增生症都具有特异性，从而改善了它们与Mtb的结合。

体内外活性

接下来，我们试图测试mAb p4-36和p4-163对Mtb感染的影响。首先，我们测试了我们的单克隆抗体对细菌进入的影响。我们感染了佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(Pma)分化的THP-1巨噬细胞。23用带有PstS 1特异性单克隆抗体和不含PstS 1特异性单克隆抗体的H37Ra弱毒株。MAb与巨噬细胞内的H37Ra结合，没有阻止细菌进入巨噬细胞，但略有增加(见图)。3A，上面板，mAb结合显示在下面板)。接下来，我们询问mAb p4-36和p4-163是否能抑制分枝杆菌的生长。为此，我们采用全血分枝杆菌体外生长抑制试验(Mgia)，将来自健康献血者的全血细胞感染到致病菌中。24。本系统曾用于检测健康供者的多克隆抗体。25并允许在一个生理相关性更强的体外系统中检测抗体活性。在这里，p4-36和p4-163能够显著限制两者的生长。牛分枝杆菌-卡介苗(BCG)和致病性Mtb(图1)。3B，c)24,26。这种活性不是剂量依赖性的，是mAb p4-36和p4-163所特有的，在其他抗PstS 1单克隆抗体(如p4-31和p4-141)中也没有观察到，表明酶联免疫吸附试验(ELISA)与Mtb裂解物的结合与其体内外活性有很好的相关性。

接下来，我们试图探讨单抗诱导CFU随时间的减少的机制。单抗p4-36和p4-163不抑制感染，感染后THP-1细胞中立即发现更多的抗体结合细菌(图一)。3A)。这表明细菌通过fcγ受体(fcγrs)进行抗体依赖的增殖。6,8,24。为了验证这一点，我们将野生型IgG 1抗体与gg1-n297A(NA)进行比较，后者是一种不与fcγrs结合的gg1基因变异体。27...与野生型IgG1mAb相比，NA变异体治疗取消了保护作用(图一)。三维空间)。评价FCγRs的贡献+效应细胞对p4-36和p4-163抗体的抑制作用，我们用选择性的FCγR阻断剂重复MGIA实验。阻断人巨噬细胞表达的主要FcγRs，CD 16(FCγRIIIA)、CD32a和CD32b(FCγRIIA和FCγRIIB)共同抑制p4-36和p4-163的抑制活性。3E)。相比之下，T细胞的特异性耗竭或阻断MHCⅡ类分子并不影响mAb诱导的CFU减少(图1)。3E)。总之，我们的数据表明抗体的FC结构域促进了它们的抗菌活性。提示FCγRs可介导细菌向细胞内的调理，从而促进抗体对感染的抑制作用。Mtb的这种抑制是由于细胞内细菌复制的积极限制，还是由于诱导细菌死亡，尚不确定。

结构-功能研究

为了进一步了解保护性抗体与靶标结合的机制，我们制备了p4-163和p4-36的抗原结合片段(Fabs)，并制备了Fab-PstS 1配合物进行结晶。我们测定了与PstS 1配合物的Fab p4-36的结构，分辨率为2.1，如图所示。4A和补充表2)。两个PstS 1-Fab p4-36杂二聚体位于晶体的不对称单元中，在结合的Fabs的恒定区上只有微小的差别(补充图)。6)。P4-36结合位于由141-145和前面的残基136-137和139-140形成的α螺旋上的连续表位。4B和补充图。7A)，面积较小，为583奥尔2。P4-36与PstS 1的接触主要是Van der Waals和氢键，主要由轻链互补决定区1(CDR 1)和CDR 3(CDRL 1和L3)和重链CDR 3(CDRH 3)贡献(图3)。4B，补充图。8a，b和补充表3)。在界面处观察到10个氢键，在Asp36之间形成了一个盐桥。P4-36 CDRL1和Lys 136PstS 1(D36)L[OD1]-K 136PstS 1[新西兰])(图1。4B和补充表3).

Fab p4-163与PstS 1的配合物不能获得晶体。因此，我们切换到p4-170，这是一个密切相关的变种p4-163和一个成员的B细胞克隆(克隆1，图1)。2E，f)，氨基酸序列与p4-163重链和轻链的同源性分别为97.6%和93.86%(附图)。5A，b)。此外，p4-170在MGIA中表现出与p4-163相似的抑制活性。9)。Fab p4-170和PstS 1配合物可被结晶，其结构在不对称单元中以一个PstS1-Fab 4-170异二聚体，分辨率为2.4确定(图1)。4C和补充表2)。从配合物的结构可以看出，p4-170与p4-36所识别的表位不同。

P4-170识别的表位高度不连续，构象接近分子中间的PI结合位点，位于PstS 1的两个结构域I和II之间(图1)。4C)。表位是977的一个大表位。2由PstS 1的三个螺旋和四个循环组成(图1)。4D和补充图。7b)。P4-170和PstS 1之间的相互作用是通过盐桥、氢键和范德华尔斯接触来实现的。4D和补充表4)。除CDRH 1外，p4-170的所有CDR均与PstS 1结构域I的85、88和92残基以及第II域的125、174、177-178、181-182、190、246-248、267-268、270-271、275-276和279-281残基相互作用(图二)。4D，补充图。8C，d和补充表4)。氢键由PstS 1的主链原子和侧链原子组成。在接触界面上形成了四座盐桥，包括Glu88。PstS 1[Oe1]-Arg 55H[ne]，GLu88PstS 1[Oe1]-Arg 55H[NH1]，Lys 268PstS 1[新西兰]-阿斯佩97L[OD1]和Asp279PstS 1[OD2]-第54条L[NH2](图2。4C，d和补充表4).

为了确认关键抗体：由结构鉴定的抗原接触残基，我们在PstS 1中产生了一组点突变。P4-170处的突变残基：pstS1接口，S246GPstS 1、K268EPstS 1，和D279APstS 1降低所有被测克隆1 mAb变异体的结合，但不降低p4-36的结合(图1)。4E)。含有p4-36残基k136E表位的α-螺旋中的氨基酸替换PstS 1、D139APstS 1，和D140APstS 1减少p4-36结合。克隆1 mAb的结合也减少了，表明p4-36结合的α螺旋可能是PstS 1折叠的关键。

接下来，我们询问p4-36或p4-170的结合是否会干扰转运体的多倍化。为此，我们对PstS 1与转运体复合物的结合进行了建模。根据我们的预测，结合抗体对PSTA-B-C-S复合物的组装没有阻断作用，也没有阻断PSTA 1与PSTA、B、C转运体复合物的结合(如图1所示)。5)。我们认为p4-36和p4-170并不通过抑制转运体的活性而发挥作用。

体内活性

最后，我们测试了两株mAb p4-36和p4-163对Mtb感染的体内活性。为此，我们使用野生型Balb/c小鼠。在气溶胶感染致病性Mtb前5小时，每只小鼠腹腔注射0.5或1mg mAb。2周后处死小鼠，测定肺细菌负荷。用mAb p4-36和p4-163预处理小鼠，或用约0.5logCFU降低小鼠的肺负荷(见图)。6)，与MGIA结果相一致，验证了mAb具有抗Mtb抑制活性。

在这里，我们描述了一个病人，第4页，他有活动性结核病，是从一组受感染患者中挑选出来的，因为他对已知的免疫显性抗原PstS 1有强烈的抗Mtb反应。虽然我们分离到的两个抗PstS 1单克隆抗体的活性不高(约0.5 log)，但据我们所知，这是第一种自然激发的PstS 1抗体在感染中具有抗Mtb活性的描述。

PstS 1是一种38 kDa结合的浆膜周围蛋白，是mtb磷酸盐特异性转运体(Pst)复合物的三个亚基之一。12。PstS 1是ATB的免疫显性标记28,29,30。Psts 1也是mtb毒力所必需的；psts 1缺失突变体在小鼠感染模型中被减弱。13。有趣的是，psts 1被认为是仅有的三个受进化序列多样化影响的mtb基因之一，表明psts 1变异在mtb免疫逃避中起着重要作用。17,18.

在本研究中，我们描述了PstS 1上两个可以被抑制Mtb生长的抗体靶向的不同位点。P4-163是9个mAb最大B细胞克隆的成员，序列同源性>93%。P4-163，p4-170克隆变异体的高分辨率结构显示了一个大的、稀疏的、高度构象的表位，与PstS 1的活性位点相邻。有趣的是，p4-170接触残基中的7个(Lys 268)PstS 1、Pro270PstS 1、Ala271PstS 1，Ile275PstS 1、Ser276PstS 1、Asp279PstS 1，以及GLy280PstS 1)与高度保守的Mtb T细胞表位259-AAAGFASKTPANQAISMIDG-280，免疫表位数据库35重叠。17,31。MAb p4-36是另一种较小的B细胞克隆的成员，与残基136内的α-螺旋结构结合。PstS 1–145PstS 1，该表位与p4-170结合的表位相距30。

供者p.4有活动性结核病，因此，根据定义，我们分离出的mAb不能预防或消除该病人的Mtb感染。然而，来自其他传染病的证据表明，B细胞的反应与刺激B细胞活化和成熟的高病原体负荷同时发生，导致中和/保护性抗体“太少，太晚”，对产生它们的个体没有明显的好处。22,32,33,34。考虑到亲和力成熟程度较低，如p4-36和p4-163中体细胞高度突变的数量相对较少，这些B细胞克隆可能只是开始进化，没有达到完全的抗Mtb潜能。另一方面，这些抗体最终产生的事实为B细胞在ATB中发挥积极作用提供了证据。

尽管长期存在争议，但最近的研究表明，在某些情况下，抗mtb的体液反应可以起到保护作用。7,24,35或与缺乏活动性疾病或甚至缺乏感染有关4,6,35,36。只有一项先前的研究在单克隆水平上描述了人类B细胞对mtb抗原的反应。7。本研究将细菌抑制归因于IgA亚型而非IgG型。然而，在这项研究中，“保护”被定义为感染后不久细胞内活Mtb的减少。不幸的是，这项研究既没有评估体内活性，也没有评估抗原结合的精确分子模式。虽然我们在本研究中使用的Balb/c小鼠模型并不能再现作为活动性结核感染标志的肺肉芽肿，但在致病性Mtb感染前被动转移mAb可显著降低小鼠的肺部细菌载量，表明其具有预防性的mAb活性。

这是人类抗Mtb单克隆抗体的第一份报告，该抗体在体内具有温和但健壮的活性，并与其相应的Mtb靶标一起分解了它们的结构。Psts1dna曾被报道能诱导小鼠抗mtb的保护性T细胞免疫。37。P4-36，p4-36gl的种系版本结合了重组的PstS 1，这一事实表明PstS 1可以作为人类的一种免疫原，在天真的人群中激发B细胞反应和类p4-36抗体。我们的研究对开发新的抗Mtb疗法和预防有一定的指导意义。