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内啡肽A2缺乏通过调节T细胞活化保护啮齿动物抗自身免疫性关节炎

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发表时间:2021-01-28 09:35作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

CTLA-4重组融合蛋白的引入,通过选择性调节类风湿关节炎患者T细胞的活化,显示了其治疗作用。在这里,我们用正向遗传的方法,证明了SH3gl1内源性蛋白内切蛋白A2基因与啮齿类动物关节炎的发生密切相关。有缺陷的表达SH3gl1影响T细胞效应功能,改变自身反应性T细胞的激活阈值,从而对小鼠和大鼠的慢性自身免疫性炎症疾病有完全的保护作用。我们进一步证明SH3GL1调节人T细胞信号转导和T细胞受体内化,其在类风湿关节炎患者中的表达上调。我们的数据表明SH3GL1是T细胞活化的关键调节因子,是治疗自身免疫性疾病的潜在靶点。

导言

自身反应性T细胞的异常激活被认为是诱发和驱动类风湿关节炎(RA)和多发性硬化(MS)等自身免疫性疾病的重要途径。据信,RA是在临床发病前几年通过激活主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类限制的自身反应性T细胞来启动的,这些细胞对B细胞有特殊的帮助,从而导致自身抗体的产生。1。在RA中,由适应性免疫系统引发的关节慢性炎症性发作,伴随着TNF和IL-6等炎性细胞因子的增加,在过去的几十年中,已经开发出有效的药物治疗来中和这个晚期的炎症期。虽然早期治疗已被证明是更有效的,因为它增加了干扰自身免疫性疾病的潜在原因的可能性,但患者在疾病建立后很好地接受治疗。2。因此,需要更好地理解促进疾病早期发展的适应性免疫系统的作用,即在疾病临床公开之前,以改进自身免疫性疾病的治疗。

众所周知,RA的遗传易感性与MHCⅡ类基因密切相关,与T细胞的主要贡献有关。此外,最近的一项全基因组元分析显示超过100个非mhc危险位点,其中许多与T细胞免疫功能有关。3。RA患者滑膜中存在大量T细胞。4而T细胞靶向治疗的成功应用,如CTLA-4-Ig融合抗体的应用,证实了T细胞在本病慢性期的重要性。这些观察在RA动物模型中得到了证实,在RA动物模型中,使用抗体或基因缺失导致的T细胞耗竭可以防止疾病的发生。5,6。T细胞受体(TCR)在调节关节炎发展中的特殊作用已在SKG小鼠中得到进一步阐明。7,其中TCR信号分子ZAP 70的突变导致TCR信号的改变。这反过来又扭曲了胸腺中T细胞的发育,增加了自身反应性T细胞的数量,进而导致关节炎的发生。

在此,我们鉴定了内亲素A2(EA2),由SH3gl1基因作为TCR内化、信号传递和下游T细胞效应的调节因子。到目前为止,EA2主要被研究在中枢神经系统的突触传递和癌症中。8,9,10。我们证明了SH3gl1无论是由DA大鼠自发突变引起的,还是在转基因小鼠中引起的,都会对自身免疫产生保护作用。我们在此报告EA2在自身免疫中的重要作用,并限制了自身反应性T细胞的诱导。发现EA2对T细胞活化的影响,不仅为RA,而且对所有T细胞依赖的炎症性疾病开辟了新的途径和治疗的可能性。

结果

SH3g11基因自发突变对自身免疫性关节炎的保护作用

DA大鼠由于对关节炎和实验性自身免疫性脑脊髓炎等慢性炎症疾病的高度易感性而被广泛应用于自身免疫研究。11。我们注意到,在我们的近交系DA大鼠群体中,关节炎的易感性增加了。选择并培育抗关节炎大鼠,建立一个新品系(表示DA突变(DA))。穆特),它被发现对Pristane诱导的关节炎有完全的保护作用(pia;图1)。1A,b)。我们怀疑潜在的原因是遗传的,而不是环境的。为了检验这个假设,DA穆特通过剖腹产将菌落重新建立在SPF(FELASAⅡ)控制的设施中.我们给大鼠注射了Pristane,并观察了关节炎的发展。结果的临床评分与常规设备相似,排除了明显的环境因素(补充图)。1A,b)。为了在基因上定位突变,我们穿越了DA穆特老鼠遗传不同,关节炎易感,E3.DA-Pia 457大鼠品系12和F2该杂交后代经免疫诱导PIA。随后的连锁分析揭示了9号染色体上一个多态标记与关节炎发病率的显著关联。第43段),位于9号染色体端粒末端。1C,d)。这个Pia 43在以前的E3xDA杂交中没有发现位点13,14,确认这一轨迹对于地方检察官来说是独一无二的。穆特排队。该片段被导入到同基因株DA中。穆特.E3-Pia 43并通过新的组合最小化到2 Mb(如图所示)。1E,f).

图1:DA中关节炎调节位点穆特大鼠被限制在9号染色体上的一个2-Mb区域.

a5例DA和7例DA患者Pristane诱导性关节炎后的平均关节炎评分穆特老鼠。关节炎数据被复制了三次,结果是相同的。b原发性关节炎后DA和DA的发生率穆特老鼠。c51例PIA发病率Lod评分图(E3.DA-)Pia 457X DA穆特)x DA穆特所有基因型染色体的大鼠。dPIA发病率Lod评分图(E3.DA-)Pia 457×DA穆特)DA穆特9号染色体上的大鼠在2.63处断线,表明有显著连锁e检察官的示意图穆特.E3-Pia 439号染色体上的同基因片段SH3gl1基因。微卫星标记Acsbg 2Uxs1基因指示同基因片段和标记的内缘。Mllt 1达兹勒指出外部边界。f8例DA患者Pristane诱导性关节炎后的平均关节炎评分穆特和4 DA穆特E3-Pia 43杂合子少白蚁。关节炎在几个不同的同种基因片段中被复制,结果是相同的。非参数Mann-WhitneyU数据统计评价采用检验方法。数据以均数表示,误差条表示±SEM,每个点代表单个值。

为了确定特定的基因改变,我们对DA进行了测序。穆特并将其与BN大鼠基因组参考文献(Rno5)进行比对。DA中的所有变体穆特.E3-Pia 43将同基因区与两个先前测序的DA基因组进行了手工比较。15,16。未检出能区分DA的单核苷酸多态性(SNP)或短插入或缺失(Indel)。穆特来自同基因区的其他DA菌株,例如,在DA之间检测到的所有337个SNP穆特在其他DA基因组中也发现了这一参考序列。然而,发现了一个结构变体,这是DA的独特之处。穆特的第1内含子插入ERV I类(ERV 1)的长端重复序列(LTR)。SH3gl1基因(图1.2A).

图2:内亲素A2缺乏对啮齿动物自身免疫的保护作用。

a的示意图SH3gl1基因与插入ervi的长期重复元件的位置和引物对的位置,用于定量的H3K4me3和H4Ac水平。b3DA和3DA中H3K4me3水平的折叠变化穆特年龄匹配的大鼠(初级配对1和2)和(初级配对3)后插入SH3gl1基因。c3DA和3DA中H4Ac水平的翻倍变化穆特年龄匹配的大鼠(初级配对1和2)和(初级配对3)后插入SH3gl1基因。d折叠变化SH3gl15-DA和6-DA基因在PBMC中的表达穆特天真的年纪相配的老鼠。计算出一个DA的相对褶皱变化穆特参考样本。e3例DA和DA脑组织内亲素A2蛋白表达的Westernblot分析穆特老鼠。以组蛋白2B作为负载对照。f胶原诱导性关节炎后平均关节炎评分9例SH3gl1击倒16只野性小白蚁。关节炎数据被复制了两次,结果是相同的。g脊髓匀浆诱发EAE后平均EAE评分10 DA和10 DA穆特老鼠。h胶原抗体致关节炎10例SH3gl1−/−和10SH3gl1+/+野生的小白蚁。i上述实验小鼠4例胶原抗体诱导关节炎后的平均关节炎评分SH3gl1击倒三只野性小白蚁。非参数Mann-WhitneyU数据统计评价采用检验方法。数据以均数表示,误差条表示±SEM,每个点代表单个值。

反转录转座子(如LTR元件)已被证明对小鼠和人的基因表达都有调节作用。17。中插入ERV 1的情况是否也是如此。SH3gl1DA基因穆特我们用染色质免疫沉淀(芯片)和qPCR技术检测了组蛋白3(H3k4me3)赖氨酸4甲基化水平和组蛋白4乙酰化(H4ac)水平,因为这些修饰与活性基因转录有关。18,19。我们观察到插入LTR上游的H3K4me3和H4ac水平在DA和DA中相似。穆特老鼠。相反,位于插入下游的区域的水平受到了下调(图中所示)。2B、C),表示SH3gl1DA基因转录不活跃穆特老鼠。为了确定这对基因表达是否有影响,我们分析了来自DA和DA的外周血单核细胞(PBMCs)。穆特大鼠和定量基因表达的qPCR。令人惊讶的是,地方检察官穆特大鼠几乎没有表达SH3gl1基因与DA大鼠比较(图1)。二维空间)。这种大大减少的基因表达也被转化为SH3gl1编码蛋白EA2,由Westernblotting确定。2E)。以证实DA中观察到的关节炎抵抗穆特大鼠是由于EA2缺乏表达所致。SH3gl1基因进入关节炎易感B6N.Q小鼠通过回交和评估胶原诱导关节炎(CIA)。类似于地区检察官穆特老鼠,SH3gl1缺乏的老鼠也被保护不受关节炎的影响,这与他们的老鼠不同。SH3gl1足够的野生型小白蚁(图1.2F)。为了研究这种作用是否仅限于控制关节炎的发展或其他自身免疫性疾病,我们测试了实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE),这是一种T细胞依赖性的MS模型,证实了EA2介导的对关节炎的保护作用(见图)。2G)。此外,我们还测试了T细胞无关的胶原抗体诱导的关节炎模型。20并观察到在疾病严重程度或诱导程度上没有差异(图1)。2H,i)。我们认为EA2是T细胞依赖性自身免疫性疾病的主要调节因子。

EA2缺乏改变自身反应性T细胞诱导阈值

由于EA2缺乏对T细胞依赖性自身免疫紊乱有很大的影响,我们研究了SH3gl1关节炎诱导后T细胞增多。在体内激活后第8天SH3gl1增加了一倍多(无花果)。3A)暗示.的一项重要功能SH3gl1在T细胞启动和激活过程中。进一步阐明SH3gl1缺乏的大鼠是由我们使用CD4的T细胞介导的+αβ+T细胞依赖的Pristane诱导过继转移模型21。多巴胺(DA)或多巴胺(DA)初级启动淋巴结细胞穆特将大鼠移植至单纯DA受体前,体外扩增T细胞。只有DA大鼠供体的细胞才能诱发严重的关节炎(图1)。3B),表明检察官穆特大鼠不能产生致心律失常的T细胞。为了证实关节炎抗性是T细胞固有的,我们将胸腺细胞从SH3gl1缺乏型或野生型小白鼠在诱导葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)诱导关节炎前进入tcrβ基因敲除小鼠。小鼠接受SH3gl1胸腺细胞缺乏几乎没有关节炎(图一)。3C与野生型受体相比,GPI肽测定的抗原特异性细胞较少,而有丝分裂原激活细胞无显着性差异(图1)。三维空间)。为了确定这种抗原特异性细胞的减少是否是由于胸腺T细胞发育缺陷所致,我们用流式细胞术评估了胸腺T细胞的数量。T细胞数量无明显差异。SH3gl1与野生型小白蚁相比,缺乏抗原的小鼠表明抗原特异性细胞数量的减少并不是胸腺T细胞发育缺陷所致(图一)。3E)而是在外围诱导。以更好地理解SH3gl1缺乏的T细胞不会变成致精性的,我们观察了激活标记物和诱导失能。GPI肽免疫后10d,活化指标无显着性差异,SH3gl1缺陷T细胞对PD-1、CD 73/FR4等无反应性标记物有明显上调作用(图一)。3F)。在随后的实验中,对GPI蛋白和卵清蛋白的反应进行了比较,GPI与外源性抗原卵清蛋白的反应趋势相同(附图)。2)。我们接下来调查的是SH3gl1缺乏T细胞在Pristane诱导的T细胞转移模型中具有调节或抑制作用.天真的DA大鼠要么单独使用Pristane启动的DA细胞,要么与等量的DA一起使用。穆特细胞,含DA穆特细胞单独作为阴性对照。在接受Pristane启动的DA细胞和DA的受体中,关节炎的严重程度没有明显的降低。穆特细胞,表明DA穆特T细胞不通过主动抑制发挥其调节作用(图1)。3G,h)而是通过抑制的激活。

图3:T细胞调节内啡肽A2对关节炎的保护作用。

a表达SH3gl1免疫后第0天和第8天从DA大鼠淋巴结中分离T细胞。bPristane-primedDA和DA过继转移后关节炎的平均评分穆特细胞数分别为9个,4个幼稚DA受体。过继转移实验共重复了三次,结果相同。c17例和19例tcrβ基因敲除者在gpi诱导的关节炎后的平均关节炎评分。SH3gl1−/−SH3gl1+/+胸腺细胞分别在疾病诱导前7天。数据来自三个单独的实验。dGPI诱导关节炎后第44天,GPI肽刺激后产生抗原特异性IL-2、IL-17A和IFNG的T细胞数目及ConA刺激后第44天产生IL-2的细胞数。9只重组野生型T细胞的tcrβ基因敲除小鼠和8只重组tcrβ基因敲除小鼠的数据。SH3gl1T细胞回忆实验已经重复了两次SH3gl1−/−老鼠。e8例双阴性(DN)、双阳性(DP)、单阳性CD4(SP CD4)和单阳性CD8(SP CD8)胸腺细胞的频率SH3gl1−/−和8SH3gl1+/+老鼠。数据已复制两次。fCD 25,CD 44,PD-1,CD 73的频率+FR4+、ki-67和Foxp 3在CD4中的阳性细胞。+TCRB+GPI肽免疫后10天腹股沟淋巴结细胞SH3gl1−/−和6SH3gl1+/+老鼠。g纯净性DA受体在采用Pristane导联DA后关节炎的平均评分穆特只有细胞,DA细胞或DA细胞加上DA穆特细胞,每组7只。hDA受体单用或加入DA过继转移后的关节炎评分穆特细胞,每组7只。非参数Mann-WhitneyU数据统计评价采用检验方法。数据以均数表示,误差条表示±SEM,每个点代表单个值。

缺乏EA2的啮齿动物正常生长,对癌症和感染有正常的反应。

EA2是中枢神经系统中一种普遍存在的高表达蛋白。22。因此,EA2缺乏症可能影响多种细胞类型,影响发育。然而,我们并没有观察到由DA缺乏EA2引起的任何主要生理障碍。穆特大鼠通过血细胞计数、体重、繁殖能力和寿命(不超过1.5岁)进行测量,其中DA穆特大鼠与正常的DA小体完全相同(补充图)。3A-E)。类似于地区检察官穆特老鼠,SH3gl1与野生型小白蚁相比,缺乏的小鼠发育正常。8。鉴于EA2缺乏的啮齿动物对自身免疫性疾病有很强的保护作用,我们认为它们可能有严重的免疫系统缺陷。我们的动物设施没有特定的病原体,但爆发了一次金黄色葡萄球菌引起免疫缺陷小鼠化脓性关节炎的感染23。然而,没有SH3gl1缺乏的动物金黄色葡萄球菌在这次爆发期间感染。进一步挑战SH3gl1缺乏细菌感染的小鼠金黄色葡萄球菌LS-1菌株24静脉接种。这种化脓性关节炎模型金黄色葡萄球菌LS-1株通过超抗原毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)激活T细胞而依赖于T细胞。25。在这种脓毒性关节炎模型中,我们没有观察到在细菌清除或关节炎的发展方面有任何差异。SH3gl1与野生型小白蚁相比,缺乏的小鼠(补充图)。3F,g)。为了进一步挑战EA2缺乏小鼠的免疫系统,我们注射了SH3gl1B16F10黑色素瘤细胞缺陷型和野生型小鼠,并伴随肿瘤生长。与野生型小白蚁相比,EA2缺乏的小鼠没有过度的肿瘤生长(补充图)。3H)。因此,EA2缺乏似乎影响自身免疫的调节,但不影响啮齿动物的一般健康,也不影响啮齿动物对由以下原因引起的细菌感染的易感性。金黄色葡萄球菌也没有癌细胞的过度生长。

EA2缺乏通过TCR降低T细胞活化

考虑到EA2的内源性功能以及EA2表达缺失对T细胞的影响,我们认为EA2可能对TCR的内化有重要作用。因此,我们检查EA2是否在激活时与TCR共定位。虽然在未刺激的细胞中未发现共同定位,但我们可以看到,在仅3分钟的抗CD3/CD 28刺激后,EA2和TCR共定位(如图所示)。4A和补充图。4)。我们接下来研究了TCR内化的动力学,实际上,SH3gl1缺陷的T细胞以比SH3gl1足够的T细胞更慢的速度内化他们的TCRs。4B)在刺激后15分钟内已经有减少的内化现象。观察到的TCR内化率下降并不是由于TCR循环增加,因为SH3gl1缺陷和足够的T细胞在TCR内化方面的差异,即使在Bregeldin A治疗后也能维持(见图)。4C)。为了研究这是否对T细胞的反应性有任何影响,我们研究了SH3gl1缺陷型和野生型T细胞的TCR下游信号分子。与野生型T细胞相比,SH3gl1缺陷T细胞TCR信号级联减少,磷酸化ZAP 70水平降低,ERK 1/2激活(图1)。4D-f)。的响应能力下降SH3gl1T细胞缺陷通过CD3/CD 28在体外刺激后转化为抑制T细胞增殖(如图所示)。4G,h)。观察到的增殖减少并不是如前面所述的白细胞介素2受体内化减少的结果。26但必须通过TCR(补充图)减少激活。5).

图4:内亲素A2在激活时与TCR共定位,调节TCR内化和信号传递.

a抗CD3/CD 28诱导Jurkat细胞中tcR与EA2共定位的近邻连接酶法测定,并显示为德州红。+使用共焦成像的斑点。b5 DA和5 DA T细胞内化TCR的百分比穆特抗CD3/CD 28刺激大鼠。数据被复制了两次。cCD4内化TCR百分比+CD3+三个T细胞SH3gl1−/−SH3gl1+/+用抗CD3/CD 28抗体刺激小鼠30 min,在1.25μg/ml条件下,用Breceldin A刺激30 min,重复两次实验,结果相同。d两个T细胞磷酸化和非磷酸化ZAP 70和ERK 1/2实验的代表性Westernblot分析SH3gl1−/−SH3gl1+/+抗CD3/CD 28刺激小鼠0、3、7 min。以组蛋白2B作为负载对照。e磷酸化ZAP 70与非磷酸化ZAP 70的归一化OD值比较SH3gl1−/−SH3gl1+/+老鼠。f磷酸化ERK 1/2与非磷酸化ERK 1/2的归一化OD值比较SH3gl1−/−SH3gl1+/+老鼠。g流式细胞仪杂交显示DA体外细胞增殖穆特和DA T细胞在抗CD3/CD 28刺激后72h。h7 DA和5 DA分类T细胞的分裂指数穆特抗CD3/CD 28刺激后72h大鼠。非参数Mann-WhitneyU数据统计评价采用检验方法。数据以均数表示,误差条表示±SEM,每个点代表单个值。

SH3GL1调节人T细胞TCR反应及其在RA患者中的表达

由于ea 2高度保守,对T细胞介导的小鼠和大鼠的arthrit原性产生了如此深远的影响,我们接下来将研究其在何种程度上。SH3GL1在人类T细胞中很重要。为了证明EA2在人T细胞中的相关性SH3GL1CRISPR敲除Jurkat T细胞(补充图.6),体外用抗CD3/CD 28刺激。TCR信号和TCR内化在SH3GL1与野生型对照和正常Jurkat T细胞相比,Jurkat细胞缺乏。5A,b)。我们讨论了SH3GL1可在RA患者T细胞中过度表达并检测两者的表达SH3GL1TCR分子CD3e从RA患者和健康对照者的全血中发现SH3GL1表达式与CD3E分子(图1.5C)。类似于动物模型的发现,SH3GL1在类风湿关节炎患者中CD3E(无花果)5D)证实来自国家CBI GEO数据库的数据27与健康对照组相比,RA患者CD4+T细胞中SH3gl1基因表达上调(图1)。5E)。因此,SH3GL1在跨物种的T细胞中具有保守的机制功能,并且与人类疾病环境有关。

图5:EA2在人T细胞中具有保守功能,在RA患者中表达上调。

aTCR内化SH3GL1CRISPR敲除Jurkat细胞(T3-5和T3-21)和野生型对照(T3-23)。b两种磷酸化ZAP 70和ERK 1/2 T细胞的代表性westernblot分析SH3GL1CRISPR基因敲除(T3-5和T3-21)、野生型对照(T3-23)、Jurkat(J)细胞抗CD3/CD 28作用0、3、7 min。以组蛋白2B作为负载对照。c相关的CD3eSH3GL1健康人和RA患者全血中基因的表达。每个圆圈代表一个人。d归一化SH3GL1基因表达CD3e随机抽取35例健康对照者和36例RA患者全血中基因表达c。每个圆圈代表一个人。e SH3GL1基因在分类CD4中的表达+10名健康对照者和8名RA患者的T细胞(数据可从NCBI GEO数据库获得,登录:GSE 4588)。非参数Mann-WhitneyU数据统计评价采用检验方法。数据以均数表示,误差条表示±SEM,每个点代表单个值。

讨论

自身反应性T细胞的异常激活是导致自身免疫性疾病慢性和低分辨率的先天免疫反应和适应性免疫反应自激活恶性循环的关键。利用大鼠RA动物模型,我们发现SH3GL1是T细胞效应功能和自身免疫性疾病的主要调节因子。我们发现SH3gl1对突变的DA大鼠和大鼠的自身免疫性疾病都有完全的保护作用。SH3gl1敲除小鼠并认为这是由于T细胞效应功能丧失所致。此外,我们还表明SH3gl1啮齿动物和RA患者自身免疫性关节炎时T细胞表达增加。

抗原提呈细胞的TCR内化和表面再循环对抗原提呈细胞的MHC识别在建立稳定的免疫突触和随后的T细胞活化中起着关键作用。28。为了限制自身反应反应的潜在诱导,T细胞的激活通过TCR和共刺激分子受到严格的调控。TCR信号级联过程中TCR的表面表达和适配器的表达对决定T细胞的效应功能具有重要意义。例如,CD4+缺乏洗涤蛋白的T细胞可减少TCR的转运和T细胞的增殖。类似于SH3gl1缺乏症动物,CD4+条件清洗敲除小鼠也不受EAE的影响。29。一些早期的研究表明SH3GL1对于许多受体的内化和贩运是必要的。26,30,31。我们的数据表明SH3GL1也调节TCR的内化。由于TCR内化和免疫突触的形成对TCR信号传递的重要性,缺乏SH3GL1可导致T细胞信号的减少,进而导致自身反应性T细胞数量的减少,进而限制关节炎的发展。适配器在tcr信号级联中的重要性最近以适配器蛋白nck为目标被证明了。32。就像在SH3gl1Nck的抑制能降低T细胞的增殖,诱导免疫抑制,并对EAE有保护作用。虽然TCR的调节在SH3GL1和Nck之间是不同的,但其结果似乎是相似的。事实证明,在自身免疫性疾病领域开发有效的组织限制性免疫疗法是很困难的,在上世纪90年代开发的各种抗原特异性疫苗接种策略取得了有限的成功。33,34。因此,该领域非但没有试图解决抗原特异性问题,反而更多地进入了分子的耗竭(如肿瘤坏死因子阻断)。35)或全细胞群体(例如使用抗CD 20抗体的B细胞)。36)参与发病机制。虽然这些疗法是有益的,但它们并不是有效的,而且仍有相当数量的患者是无效的,或者出现严重的副作用,如感染易感性的增加。37,38。我们的结果SH3gl1在啮齿动物中,有一种有趣的途径,通过TCR调节自身反应性T细胞的激活,同时保持对病原体的反应能力。因此,SH3GL1靶向治疗RA和其他T细胞介导的疾病是一种很有前途的治疗策略。


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