双面效应牛分枝杆菌卡介苗

卡介苗(BCG)是全球唯一有效的结核病疫苗。除了对分枝杆菌病的影响外，自1921年引进以来，越来越多的流行病学和实验证据表明，卡介苗对许多疾病也有非特异性的影响，例如非分枝杆菌感染、过敏和某些恶性肿瘤。最近爆发的2019年度冠状病毒病(新冠肺炎)再次让卡介苗再次成为人们关注的焦点。卡介苗是一种具有重要非特异性保护作用的经典疫苗。本文简要回顾了卡介苗的各个方面，为这一古老、多方面和有争议的疫苗的特异性和非特异性保护机制提供了新的视角。

卡介苗(Bcg)，一种活的减毒细菌疫苗，来源于牛分枝杆菌最初是在1902年从一头患有结核病的奶牛中分离出来的。1。该分离物连续培养了13年(1908-1921)，连续培养了230代以上，获得了一株毒力较弱但免疫原性较高的突变株。2。卡介苗于1921年首次应用于人类，自1974年以来，世界卫生组织(WHO)已将卡介苗纳入婴儿免疫计划。截至2018年，bcg已在亚洲、非洲、欧洲和美洲180个国家或地区的国家疫苗接种计划中使用，覆盖范围超过90%。3,4,5。自20世纪20年代以来，最初的卡介苗株已被运往20个不同的国际地点，疫苗在不同的条件下反复传代。这就产生了不同的持牌卡介苗制剂，它们在活分枝杆菌的含量和遗传组成上都是不同的。6,7,8。目前，全球应用最广泛的卡介苗菌株包括法国巴斯德株(巴斯德1173P2)、丹麦1331株(丹麦1331株)、巴西株(卡介苗Mearou rj)、俄罗斯株(莫斯科-368株)、保加利亚亚株(索菲亚SL 222株)和日本172株(东京172-1株)。9,10.

作为世界上最古老和最广泛使用的疫苗之一，卡介苗已经使用了近一个世纪，全球有超过40亿人接种了卡介苗。11。在大多数国家，新生儿出生后几小时或几天服用卡介苗，对结核性脑膜炎和粟粒性结核病的保护效果分别为73%和77%。12,13,14,15,16。虽然卡介苗是专门研制出来的结核病疫苗，但大量的研究表明，卡介苗有能力诱导所谓的非特异性效应(NSE)，从而有效地预防其他传染病。在结核病流行国家进行的几项流行病学研究表明，新生儿接种卡介苗可使新生儿死亡率降低50%。17，这可能是因为接种卡介苗后，儿童出现脓毒症和呼吸道感染的可能性降低。17,18,19,20。临床证据还表明，卡介苗可能对呼吸道合胞病毒等病毒病原体引起的感染有效。21,22，人乳头状瘤病毒23,24,25和单纯疱疹病毒26。此外，越来越多的使用小鼠模型的动物研究证实了卡介苗对继发性病毒感染的影响。在两项单独的研究中，卡介苗免疫小鼠的甲型流感病毒(H1N1)滴度明显低于未接种卡介苗的小鼠，导致炎症和肺损伤程度降低。27,28。此外，其他研究报告称，卡介苗疫苗的动物模型或人类对各种病毒(包括单疱病毒1型和2型)的抵抗力更强。29,30,31仙台病毒32、乙型脑炎病毒33脑心肌炎病毒34,35，以及外胚层病毒(Ectromelia Virus)36,37，或非传染性疾病，如白血病。38、过敏39，儿童糖尿病40.

值得注意的是，bcg可以作为重组抗原的表达载体，开发新型的致病菌和病毒疫苗。41,42,43,44,45，以及癌症免疫治疗38,46,47。很明显，卡介苗不能被视为一种只对单方面预防结核病有“特定效果”的疫苗。因此，需要对卡介苗可能的“NSE”有进一步的了解。

无论是用于免疫预防还是免疫治疗，卡介苗的安全性仍然是首要关注的问题。48。在经常使用卡介苗的国家，儿童因接种卡介苗而产生的不良反应已得到很好的报告。49。卡介苗接种引起的并发症可以是轻微的，也可以是严重的。50。有严重的综合免疫缺陷、细胞免疫缺陷、慢性肉芽肿性疾病、IL-12和IFN-γ介导的免疫缺陷的免疫受损个体。51对卡介苗经常表现出更严重的反应，因此应避免接种卡介苗.可能导致不良反应发展的其他因素包括所采用的评价标准、所用疫苗株的效力和剂量、免疫接种的次数、接生路线、被接种个人的年龄和免疫状况以及接种疫苗的操作者的技能。

卡介苗接种的正常反应

卡介苗作为一种活菌疫苗，在一定的条件下，不可避免地会从接种点和区域淋巴结传播到身体的各个部位。卡介苗接种后约2周，注射部位通常出现平均直径约为10毫米的硬化区，随后出现红肿、化脓和自发性溃疡，6~12周愈合后，皮肤自行脱落，形成一个小的永久性疤痕，俗称“卡介苗疤痕”。卡介苗接种后约2至3个月，便会出现“卡介苗疤痕”，而不会有任何全身不良反应。值得注意的是，有少数接受卡介苗疫苗接种的人在接种地点的同一侧，腋窝淋巴结轻微肿大。52。一般来说，上述的反应在卡介苗接种后是正常的，这是自我限制，不需要任何特殊的医疗。

卡介苗接种不良反应

卡介苗是全球使用最广泛的疫苗，具有良好的整体安全记录。卡介苗接种后的不良反应和并发症主要包括轻度和暂时性发热(1-2天后自然缓解)，注射部位脓肿。53(直径>10毫米，在>12周内愈合)，淋巴结炎，结核病皮疹54(如卡介苗接种后10天至2个月出现的硬皮病、阴囊苔藓和结核丘疹坏死)，骨髓炎55,56，以及全身播散性卡介苗感染57。据报道，在2500例卡介苗接受者中，~1例出现局限性卡介苗相关的轻度并发症，而每100,000人中就有1例出现播散性严重并发症51,58,59。由于疫苗接种后脓肿的形成通常是自我限制的，无需治疗就能得到解决，因此只有少数患者需要住院治疗和特殊程序。BCG淋巴结炎最常见的副作用49,60,61,62,63表现为局部淋巴结肿大可形成脓疱、溃疡、化脓和其他临床异常，如干酪、脓肿和窦房结。统计分析显示，30%-80%的bcg淋巴结炎可发生化脓性改变。64，15%-30%的非化脓性淋巴结炎可发展为化脓性淋巴结炎。65。此外，据报道，卡介苗接种后尿液颜色的变化是另一种异常反应。一般来说，在接种疫苗后的第二天，尿液颜色就会变成橙色，然后在1周内自行恢复。65因此不需要任何干预。值得注意的是，极少数卡介苗接受者在接种疫苗后可能会出现过敏性紫癜、过敏性休克、免疫性血小板减少症和地衣样皮肤病变。虽然上述并发症的发病率较低，但仍需及时对症治疗，如有必要，可包括全身抗结核治疗。

天然免疫保护

作为一种由活弱分枝杆菌组成的复合疫苗，bcg会在给药点引起局部感染和免疫激活，在此，驻留的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(Dc)与芽孢杆菌相互作用。66,67(无花果)1A)。由DC内化的卡介苗可以在这些细胞内存活2周。68，触发共刺激分子的上调和免疫极化细胞因子的产生，其特征是CD 40、CD 80、CD 83和CD 86的表达水平增加。69,70。另一方面，bcg可被巨噬细胞吞噬和降解，从而产生bcg细胞壁骨架中的免疫原成分，包括共价连接的霉酚酸、阿拉伯糖聚糖和肽聚糖。66这可以通过激活不同的模式识别受体(Prr)来强烈刺激炎症反应。69,71,72,73。在bcg的识别过程中，Toll样受体(Tlr)2的信号是通过分枝杆菌细胞壁脂甘聚糖和脂类，如脂甘露聚糖(Lm)来触发的；tLR 4信号是通过其它分枝杆菌蛋白(如多种热休克蛋白和糖蛋白)触发的。66,74,75,76,77。结果表明，bcg cpG-dna能激活dc和巨噬细胞内的tLR 9，导致细胞活化，产生IL-12，α和mcp-1，这是Th1免疫应答的重要介质。78,79,80,81,82。同样，补体受体cr3和cr4、核苷酸结合寡聚结构域(Nod)样受体和C型凝集素也被证明与细菌细胞壁成分相互作用，并参与bcg的识别和内化。71,83,84。此外，对卡介苗免疫成人的研究表明，单核细胞前体具有较高的PRRs表达和更强的对刺激的反应性，例如TLR激动剂。

自适应免疫保护

抗原提呈细胞(如dc、巨噬细胞和B细胞)将bcg来源的抗原肽呈现给位于最近次级淋巴组织或脾脏的主要组织相容性复合体(Mhc)分子和原代T细胞，以启动适应性免疫应答。85(无花果)1B)。卡介苗接种部位活化的DC迁移至引流淋巴结，随后分泌肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和白细胞介素-12同时激活CD4。+和CD8+T细胞86,87,88。活化CD4+和CD8+T细胞产生高水平的干扰素-γ，最终提高巨噬细胞的抗分枝杆菌活性。85,89,90。这就解释了为什么人类对结核病的敏感性有所提高。干扰素-γ突变91在老鼠身上干扰素-γ基因中断91。同时，中性粒细胞和活化的dc共同刺激抗原特异性T细胞的应答。92。研究表明，在新生儿中，大量的卡介苗特异性CD4。+和CD8+接种卡介苗后10周外周血中可检测到T细胞。此外，血清中可检测到较高水平的干扰素-γ、颗粒酶、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-2。93,94,95。在bcg或TB相关疫苗的开发中，传染病免疫学的主要概念在于Th1/Th2范式，在这种范式中，辅助T(Th)细胞被指定为独家分工。96。根据这种模式，Th1细胞保护宿主免受细胞内病原体的侵害(包括结核分枝杆菌，Th2细胞保护宿主免受细胞外病原体的侵袭。96。因此，在结核病病例中，Th1细胞分泌的IFN-γ可作为评价BCG保护性免疫的指标。然而，人们对卡介苗诱导的免疫保护和结核病免疫学缺乏了解.因此，进一步的研究表明，干扰素-γ确实是卡介苗诱导免疫保护的正确标志。

体液免疫在结核病中的作用常常被忽视。66。因此，B细胞对卡介苗接种的反应也被忽视了。然而，由于最近的研究表明抗体在预防结核病方面起着重要作用，因此人们对确定抗体与疫苗研制的相关性越来越感兴趣。事实上，抗体介导的抗MTB免疫的潜在机制包括增强吞噬功能、增加巨噬细胞形成、细菌中和、增强炎症小体活化和增强细胞毒性自然杀伤(NK)细胞活性。例如，细菌抗体复合物的形成导致吞噬细胞对mtb抗原的加工和表达增加，进而增加T细胞的活化并增强细胞毒性反应。97。研究表明，在卡介苗接种过程中，B细胞也可以通过调节IL-17反应来调节中性粒细胞减少，早期中性粒细胞水平的大幅升高也会影响CD4的产生。+T细胞通过影响DC向引流淋巴结的迁移，最终触发不利于抗体产生的Th1免疫应答。98。一项关于卡介苗的临床研究发现，与未接种疫苗的志愿者相比，接种卡介苗的人外周血单个核细胞中ppd特异性记忆B细胞的数量显著增加，但对eSAT-6或cfp-10缺乏B细胞反应性。99。结果表明，卡介苗接种后4~8周内诱导的B细胞反应可增加IgG的产生，诱导长寿命的记忆B细胞。99,100。对Ag85复合物的一种抗体反应被发现与一组感染mtb的墨西哥印第安人的优越结果有关。101。同样，针对MTB表面糖脂阿拉伯甘露聚糖的低滴度抗体也被证明与TB在儿童中的分布有关。102，说明抗体效应器功能可能在感染控制中起一定作用。103。此外，另一种途径(鼻内接种)免疫产生的IgA也能形成粘膜免疫，从而预防结核病感染。104。这些抗体可以中和和消除病原体，并通过调节细胞因子如肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的分泌来激活免疫反应。105.

卡介苗对呼吸道感染的保护机制一直是积极研究的课题。据推测，这些非特定的好处可以防止无关的感染。第一种机制，“异源T细胞免疫”是由异源T细胞记忆反应介导的，以提供交叉保护。106。第二种机制是“经过训练的免疫”，它依赖于天然免疫细胞的重新编程，从而将非特异性的免疫记忆传递给天然免疫反应。107。此外，其他机制包括旁观者细胞和抗体/交叉反应的TCR。

卡介苗免疫的异源T细胞免疫

异源T细胞免疫是基于适应性免疫系统的作用，主要是T细胞介导疫苗相关抗原和疫苗无关抗原之间的交叉反应，从而导致疫苗中NSE的产生。因此，T细胞疫苗的反应可能通过接触先前感染的病原体而受到影响或改变。106,108,109。虽然抗原交叉反应在某些情况下可能提供一些有益的保护性免疫，但在其他情况下，这种反应可能会造成严重的免疫病理损害。因此，T细胞介导的异源免疫提供了一种可能的生物学机制，可以影响后续无关感染的免疫反应。这也解释了疫苗如何会对二次感染的结果产生不利影响。BCG抗原与病毒抗原(如表位)之间的分子相似性，可诱导产生识别BCG和其他病原体的记忆B和T细胞群。例如，卡介苗疫苗可以通过增加CD4产生的γ来保护小鼠免受痘苗病毒的感染。+细胞110。在人类健康志愿者中，bcg疫苗接种后1年内仍可观察到非特异性Th1和Th17应答的增强。111。同样，在动物实验中，非靶向抗原具有激活特异性CD4的作用。+和CD8+记忆细胞，从而调节Th1和Th17对非分枝杆菌继发性感染的反应。此外，bcg还被证明会导致旁观者CD4和CD8记忆细胞的抗原无关激活。110,112,113,114。然而，这一机制不太可能解释通过卡介苗疫苗对不同病原体的多种保护。更重要的是，虽然异源Th1/Th17免疫可能介导异源免疫的长期效应，但至少需要几个星期才能形成，因此极不可能对围产期免疫所观察到的即时效应负责。18,106.

卡介苗免疫训练免疫

许多缺乏适应性免疫的生物体，如植物115昆虫116,117暴露于感染后表现出强大的免疫记忆。在缺乏功能性适应性免疫反应的小鼠身上，天然免疫也表现出类似的适应性特征。118,119。训练有素的免疫是指由单核细胞/巨噬细胞和天然免疫系统的NK细胞形成的非特异性天然免疫保护，它根据配体的性质和浓度，对不同微生物的继发性感染反应更快、更强。108，不涉及T细胞和B细胞26,107,120,121。最初在NK细胞中被发现，经过训练的免疫已经被证明是BCG-在单核细胞中可诱导的.

单核细胞在感染或免疫部位的表观遗传重新编程已经被证明是诱导训练免疫的分子机制之一。2)。这些单核细胞经过组蛋白修饰(如甲基化、乙酰化、脱胺和脯氨酸异构化)，在编码炎症细胞因子的基因启动子位点上，导致它们对新的刺激持续反应的能力，从而在重新激活时产生越来越活跃的免疫反应。由于组蛋白修饰是高度动态的，可以在几分钟内改变，重新编程的单核细胞可以非常迅速地发挥作用，赋予对其他病原体的抵抗力。免疫系统的表观遗传修饰涉及细胞分化、炎症和自身免疫反应。108,122,123,124,125。在支持卡介苗免疫训练免疫的过程中，观察到接种卡介苗的成人单核细胞与未接种卡介苗的单核细胞相比，其与免疫激活有关的各种表面标记物的表达增加，并产生更多的细胞因子，如IL-1β、IL-6等。干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α暴露于各种病原体的感染.此外，外周血单个核细胞(PBMCs)显示H3K4me3组蛋白修饰增加，h3k9me3组蛋白修饰减少，均与促炎细胞因子tf-α、IL-6和tLR 4的转录激活启动子相关。126,127.

代谢物重编程是另一种诱导训练免疫的分子机制(如图所示)。2)。已有研究发现，接种卡介苗后，人单核细胞糖酵解代谢水平升高，细胞代谢过程由氧化磷酸化向有氧糖酵解转变。单核/巨噬细胞检测到的β-葡聚糖可通过脱粘素-1受体激活PI3K(磷酸肌醇3激酶)-aKT-mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)-HIF-1α(低氧诱导因子-1α)途径，从而诱导代谢向有氧糖酵解方向转变；增加谷氨酰胺分解，补充三羧酸循环；激活胆固醇合成途径；阻断itacacate途径。119,128,129,130,131,132。因此，富马酸、琥珀酸和甲丙戊酸等代谢物积累，成为表观遗传修饰物的辅助因子，并作为经过训练的免疫放大器。130,133。卡介苗已被证明可以诱导全基因组表观遗传的改变，包括组蛋白(H)3赖氨酸(K)4/9的单甲基化和三甲基化，以及h3k27在代谢、免疫和宿主防御途径相关基因的启动子和增强子上的乙酰化。119,127,134。因此，经过训练的单核/巨噬细胞在受到微生物成分的挑战时，会产生更高水平的细胞因子，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6。119,127,130,135.

卡介苗还可以减少非分枝杆菌感染，减少异源感染的风险，由各种病原体，包括细菌，病毒，和疟原虫。不同的临床研究已经在bcg的基础上进行了(表)。1)。然而，值得注意的是，除了致病菌外，还有许多因素可能导致卡介苗接种的异源效应。一些研究表明，白喉破伤风百日咳疫苗可能影响卡介苗对儿童死亡率的影响，提示其他疫苗可能对卡介苗免疫产生调节作用。此外，患者年龄、性别和卡介苗接种后的时间也可能是NSE的致病因素。卡介苗异源效应对新生儿出生时的影响最为明显。同样，研究表明，在幼崽中，卡介苗诱导的先天训练对循环免疫群体的影响可以持续三个月。136。BCG异源保护作用的逐渐减弱可以解释为：随着婴儿年龄的增长，他们更频繁地接触病原体，从而发展了对传染病的传统免疫力，最终克服了BCG的异源有益效应。

2019的冠状病毒病(新冠肺炎)大流行促使人们迫切需要新的疫苗接种或干预措施，以降低全球疾病的发病率和死亡率。有希望的新试验旨在确定这种常用的“老疫苗”是否对“新疾病”新冠肺炎有效。BCG在传染病文献中已经有了很好的记录，因为它能够在不相关的情况下诱导NSE。随机对照试验需要提供直接证据，以证明通过经过训练的免疫接种卡介苗是否能够提供对新冠肺炎的保护(图一)。2)。体内研究表明，卡介苗可以通过表观基因重组人类天然免疫系统中的单核/巨噬细胞，成功地缓解黄热病病毒血症。127。虽然卡介苗能在小鼠模型中诱导出对H7N9的训练有素的免疫反应，但随后的评估表明，这种免疫反应与临床生存、临床评分或肺部炎症没有显著关系。137。BCG的有效性是基于这样的认识：在接种BCG疫苗的健康人中，经过良好训练的免疫系统可以增强固有的抗菌机制，这可能有助于抑制病毒复制和减少病毒载量，从而减轻炎症和症状。然而，目前尚不清楚老年人在接种卡介苗多年后是否能够维持一批受过训练的单核细胞。同样，在一些高危人群中，最初的缺陷抗病毒反应可能导致病毒载量增加，从而刺激无效的全身炎症并导致严重疾病。

目前已有大量文献通过对不同国家的卡介苗接种政策和预防接种情况的流行病学分析，对利用卡介苗预防新冠肺炎的可能性进行了大量的文献综述。流行病学证据表明，与那些没有接种卡介苗方案的国家相比，采用国家普及卡介苗预防结核病方案的国家严重新冠肺炎的发病率和死亡率要低得多。然而，不可否认的是，不同国家在新冠肺炎检测能力、治疗效果和隔离政策以及经济状况、人口统计和人口遗传结构方面存在差异。正是由于上述种种制约因素，本次流行病学调查的结果只能用来解释这一假设的可能性。由于需求高和生产限制，卡介苗供不应求。2016年和2019年全球卡介苗短缺，导致用于治疗膀胱癌的卡介苗管理方式发生了变化。因此，许多国家减少了卡介苗的用量，限制了卡介苗的使用。为了防止卡介苗的过量使用，以及避免认为卡介苗可以提供预防新冠肺炎的假象，世界卫生组织最近警告说，除非有适当的证据，否则不应任意使用卡介苗。138。值得称道的是，在澳大利亚、美国和荷兰等国家，已经对医护人员和老年人进行了十几项新的新冠肺炎卡介苗临床试验。这些临床试验可能会揭示卡介苗对新冠肺炎的作用(表)。2).

卡介苗除了提供结核病的特异性预防或其他传染病的非特异性预防外，还被认为对非肌肉浸润性膀胱癌(Nmibc)有非特异性的治疗作用。139。卡介苗于1976年首次用于泌尿外科的临床应用，随后于1990年被食品和药物管理局(Fda)批准用于治疗浅表性膀胱癌。140。若干准则，包括美国泌尿协会(AUA)概述的准则141，国际膀胱癌组织(IBCG)142和国际泌尿疾病协商会议(ICUD)143推荐BCG用于NMIBC免疫治疗。卡介苗仍被认为是缓解NMIBC进展和复发的标准干预措施之一。144,145。虽然卡介苗治疗NMIBC已有近40年的历史，但其疗效仍有待进一步研究。

膀胱内灌注卡介苗可诱发多种免疫反应，导致炎症并随后消除肿瘤。146(无花果)3)。一方面，虽然含有数亿分枝杆菌的卡介苗原药的绝大部分是从膀胱中冲走的，但剩余的分枝杆菌通过纤维连接蛋白粘附在尿路上皮和癌细胞上，纤维连接蛋白是一种细胞外糖蛋白，分布在正常和恶性的泌尿上皮。147。通过内化卡介苗调节APC的抗原处理，以启动早期免疫应答148增强膀胱癌细胞MHC-Ⅱ和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表面表达47。另一方面，卡介苗可在注射数小时内引发一系列复杂的炎症事件。主要由粒细胞组成的白细胞数量显著增加，较小程度上可在尿液中检测到巨噬细胞和淋巴细胞。149。此外，还发现卡介苗治疗后尿液中释放多种细胞因子和趋化因子，包括Th1(INF-γ、IL-2、TNF和IL-12)、Th2(IL-6和IL-10)、IL-8和IL-17，卡介苗治疗后，细胞因子和趋化因子的释放明显增强。145,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163。更重要的是，大量的中性粒细胞163,164,165已经发现单核细胞/巨噬细胞浸润膀胱壁，在肿瘤微环境中添加额外的特异性细胞因子和趋化因子。146,166,167。组织病理学上，卡介苗治疗后膀胱活检显示浅表上皮糜烂，粘膜下肉芽肿发炎，伴有水肿和非级联肉芽肿，周围有淋巴浆细胞和嗜酸细胞浸润。157。此外，卡介苗诱导的非特异性抗肿瘤作用被认为是NMIBC免疫治疗的关键干预措施。特别是CD4介导的抗肿瘤作用。+T细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞已被证实。肿瘤浸润性CD4增加+T细胞计数和CD4增加+：CD8+T细胞比率已被证明与改善患者对卡介苗的反应密切相关。156无胸腺裸鼠168。最近的研究也表明，白细胞或中性粒细胞的主要细胞亚群在反复滴注bcg后会产生更高水平的TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)，从而提供一种额外的细胞毒性机制，从而诱导TRAIL受体表达的肿瘤细胞凋亡。79,80,81,82,169.