C5a-C5a受体轴在实验性多发伤和失血性休克后肺部炎症反应中的作用

在脓毒症的实验模型中，C5a的单一阻断是已知的，通过挽救致死性和减少促炎反应来提供保护。然而，抑制C5a的作用尚未在无菌性全身炎症反应(如创伤和失血性休克(PT+HS))中得到评估。本研究利用一种新的、高度特异性的C5a L-适配体NoxD 21来阻断PT+HS小鼠模型中C5a的活性。本研究旨在探讨PT+HS诱导4h后炎症反应和肺损伤的早期调节作用。NoxD 21处理的PT+HS小鼠肺内多形核细胞增多，支气管肺泡灌洗液(BALF)中促炎症细胞因子水平升高，肺组织髓过氧化物酶水平降低。建立了肺泡毛细血管屏障的体外模型，证实了这些观察结果。多创伤鸡尾酒只在16h后才引起屏障损伤，而NoxD 21体外处理不能挽救这一效应。此外，为了检测C5a同源受体(C5aR1和C5aR2)的确切作用，在C5aR1基因敲除(C5aR1 KO)和C5aR2 KO小鼠中诱导了实验性PT+HS。在PT+HS作用4h后，C5aR2KO小鼠肺内IL-6和IL-17水平均显著降低，而C5aR1KO和C5aR2KOPT+HS小鼠肺内MPO水平均明显降低。结论：C5aR2可能是PT+HS后早期肺局部炎症反应的驱动因子。

多发性创伤是一种危及生命的多发伤，它代表着一个重大的全球性和临床负担，也是年轻人死亡的一个常见原因。1。它是一种无菌全身炎症反应综合征(SIRS)，它破坏器官结构、组织完整性和细胞，导致危险相关分子模式(DAMP)的释放。2。在多发性创伤的早期阶段，阻尼的识别是通过激活补体级联来实现的。3,4，一种强有力的炎症反应是通过白细胞的收集和细胞因子风暴产生的。它常被称为补体病，其特点是补体的快速和稳健消耗，以及补体通路C3a和C5a分别由C3和C5生成的过敏毒素。5,6。急性凝血病也是多发性创伤患者的常见病。7，因此，凝血级联的激活也可能对补体级联的激活有所贡献。8,9。这些强有力的炎症介质反过来又促进了复杂的事件后遗症，建立了复杂的创伤后免疫病理。产生的过敏毒素C3a和C5a通过多种机制扩展了它们的功能。例如，C5a除了吸收中性粒细胞外，还起着免疫代谢“开关”的作用，它可以改变微环境，导致酸中毒。10。这些作用不仅形成了复杂的免疫反应，而且也构成了器官功能障碍的基础。失血性休克被认为是器官屏障损伤的主要驱动因素，可促进实验性和临床多发伤后多器官功能障碍(Mods)的发展。2,11,12，补体在其各自的病理生理过程中起着积极的作用。13。在SIRS期间，肺是主要的靶器官之一，肺泡毛细血管屏障的破坏有助于急性呼吸窘迫综合征(Ards)的发展。14。此外，ARDS的死亡率与肺内的多形核细胞(PMN)募集有关。15。现有文献还指出，肺损伤后肺泡间隙含有高浓度的C5a。16,17,18，因此，C5a阻断剂能最大程度地抑制肺泡内炎性细胞的生成。18,19.

C5a可引起感染性并发症，包括脓毒症和脓毒症所致的多器官功能衰竭。20。它可与G蛋白偶联受体C5aR1和C5aR2结合，其作用已在各种感染和炎症模型中得到检测。21,22。有几种抑制策略针对C5，以改变其他疾病中局部和系统性补体激活的后果。23,24。在SIRS环境下，抑制狒狒C5裂解大肠杆菌大氰基化合物RA 101295诱导的脓毒症可在脓毒症诱导后2h内通过降低c3b、c5a和可溶性c5b-9的循环水平，减轻肺和肾的损伤，迅速减少炎症反应。25。最近，一种新的C5a中和适配体在脓毒症的实验模型中被证明能有效地消除C5a介导的炎症反应和MODS。26可降低血浆和腹腔灌洗液中的炎性细胞因子，减轻器官损伤，提高存活率。此外，阻断c5b-9终末复合物也有助于解决非人类灵长类动物创伤失血性休克模型的损伤反应。13。补体通路激活过程中产生的效应元件被认为是测试它们各自的阻断是否能挽救SIRS相关免疫和器官功能障碍的候选因素。这些可能包括潜在的过敏毒素C5a，其中阻断C5a-C5aR的相互作用可能证明在这方面特别相关。这些方法甚至在改善白细胞功能、器官功能和临床疗效方面显示出了良好的效果。27。之前曾描述过C5aR1或C5aR2的缺失，以减弱C5a介导的在脓毒症条件下的影响。28,29。在脂多糖(LPS)致急性肺损伤小鼠模型中，C5aR1活性在没有C5aR2的情况下，增强了促炎细胞因子水平、髓过氧化物酶(MPO)水平和支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数。30。与肺部的慢性炎症病理或感染引起的急性肺损伤不同，肺部的直接物理损伤可能会引起不同的损伤反应。然而，据我们所知，目前还没有临床和临床前的实验研究来证实C5a抑制在PT+HS后早期的任何益处，特别是在预防肺部炎症和损伤方面。C5a的有效中和甚至可能产生有害影响，因为中性粒细胞清除组织碎片和微生物的一些重要功能可能受到损害。因此，在本研究中，我们研究了一种有效的C5a抑制策略，即静脉注射一种C5a中和的L-适配体。31在高度标准化的PT+HS小鼠模型中。采用一种新型的肺泡-毛细血管屏障模型，对肺泡-毛细血管屏障及其体外C5a阻滞剂的作用进行了研究。此外，用C5a受体基因敲除小鼠研究了C5a信号级联在PT+HS过程中的特异性贡献。

C5a-L-适配体对C5a诱导的PMN趋化作用及对小鼠PT+HS体内效应的影响

NoxD 21是一种聚乙二醇PEGylated L-适配体，能同时与C5和C5a结合，从而有效地阻断C5a。31。这种L-适配体由40 kDa PEG修饰而成，使其循环半衰期增加.首先，我们进行了体外实验，以确定NoxD 21对PMN趋化作用的抑制作用。1a)。对照(Ctrl)为PEGylated反转适配体revNOX-D21(通称Ctrl)，不与C5a结合。用C5a(100 ng/mL)孵育和不加C5a(100 ng/mL)处理，分别测定两种浓度的NOX-D21和对照(分别为0.76mol/L和7.6mol/L的10μg/mL和10 0μg/mL)。C5a与C5a共同孵育可显著降低PMN的趋化性，而与C5a共孵育的L-适配体则无明显的趋化作用(图1)。1a)。

随后，我们在体内进行了PT+HS仿真实验。11在小鼠体内观察适体对炎症反应和器官功能的影响。由于NoxD 21能够在体外有效地阻断C5a的功能效应，因此我们将此阻断策略应用于PT后早期的全身炎症反应中，这一策略至今尚未被探索。实验分为4组：假手术组(Ctrl组)、假手术组(NoxD 21组)、PT+HS组(Ctrl组)和PT+HS组(NoxD 21组)。如上文所述，所有动物都进行了仪器测试和观察。8，在材料、方法和图中。1B.麻醉Sham动物，放置动脉和静脉导管，不引起PT或缺血。观察HS诱导后平均动脉压(MAP)的变化。1(C)献血者血液中血红蛋白浓度。1(D)诱发HS的抽血量(见图)。1(E)和儿茶酚胺的总需要量(如图所示)。1(F)Ctrl组与NoxD 21组比较，PT+HS组无明显差异。这表明PT+HS是在动物体内均匀进行的，其生命状态不受NoxD 21阻断C5a的影响。

如前所述，肺被认为是多发伤的主要靶点和效应器官，尤其是当伤的一部分涉及钝性胸部创伤时。获得Balf，以确定一系列炎症标志物。PT+HS小鼠BAL中总蛋白含量明显高于假手术小鼠，说明C5a阻断对PT+HS小鼠早期屏障功能障碍无明显影响。2a)。C5a-L-适配体处理的PT+HS组BALF中PMN含量较高(图1)。2(B)，白细胞介素(IL)-6。2(C)，IL-1β。2(E)和IL-17(图1)。2(F)与Ctrl处理的PT+HS小鼠组相比，NoxD 21组小鼠的水平显著升高(图1)。2c)。尽管NoxD 21处理的PT+HS小鼠的BALF肿瘤坏死因子TNF-α水平高于Ctrl处理的PT+HS小鼠，但这一趋势没有统计学意义(图1)。2d)。肺损伤通过循环Clara细胞分泌蛋白16(CC 16)水平检测，但由于PT+HS动物体内C5a阻滞，这些水平没有改变。2g)。

为进一步评估PT+HS对肺的影响，对福尔马林固定的石蜡包埋肺切片进行苏木精和伊红染色(H&E；图一)。2用MPO染色检测中性粒细胞活性。2与假手术组比较，PT+HS小鼠肺的肺泡间隔增厚，免疫细胞浸润、纤维蛋白沉积和肺泡出血增多(图1)。2(h-K)而Ctrl处理与NoxD 21处理的PT+HS小鼠肺在H&E染色切片的组织学评价上无明显差异。此外，PT+HS动物肺有较强的免疫细胞浸润(以黑箭头表示)和肺泡内出血，如红血球(RBCs)所示(用蓝色箭头表示)(如图所示)。2(j，k)。为了确定NoxD 21处理对中性粒细胞的吸收和/或活性是否有影响，对Sham和PT+HS小鼠的肺切片进行MPO染色(图1)。2L-O)。Ctrl处理的PT+HS小鼠MPO水平较高，主要见于浸润性免疫细胞、肺泡上皮细胞和终末细支气管衬里的上皮细胞。2(n，O)。NoxD 21处理的PT+HS小鼠肺三种细胞类型的MPO染色均降低(图1)。2o)。因此，尽管肺内的细胞因子水平较高，但由于NoxD 21的治疗，PT+HS动物中性粒细胞的MPO生成似乎受到了调节。

实验结果表明，应用NoxD 21抑制C5a活性在PT+HS后早期可诱导肺内促炎症细胞因子反应，而不影响肺屏障功能。

体外肺泡毛细血管屏障模型的建立

在体内观察的基础上，我们建立了肺泡毛细血管屏障的体外模型，对远端肺环境的细胞组成进行了深入分析，并专门研究了C5a对肺泡毛细血管屏障的作用和C5a L-适配体的有效阻断作用。内皮细胞(HPMEC-ST1.6R)和肺泡上皮Ⅰ型(HAELVi)32)细胞和原代II型(ATII)细胞生长在Transwell过滤器插入物的相反侧。一个连续的播种方案导致了合流内皮和上皮片的形成(如图所示)。3a)。完全建立的体外肺泡毛细血管模型类似于体内屏障的功能特征。第15天，上皮细胞形成紧密的吸收上皮。由肺泡Ⅰ型hAELVi细胞和原代ATII细胞组成的上皮片显示紧密连接蛋白ZO-1(ZO-1)、ATII标志ABCa3和ATI标志小窝蛋白1(图1)的显著表达。3b)。内皮细胞和上皮细胞的三重共培养与单纯的内皮细胞和内皮-hAELVi培养相比，也显著增加了经皮阻力(TEER)和明显减少了肺泡表面液体(ASL)的体积(图1)。3c)。100μM ATP诱导板层体(LB)胞外增生症完全建立的屏障模型33,34，这是ATII细胞的功能标志。35(无花果)3d)。

PMN加重体外肺泡毛细血管屏障损伤

为了评估体外肺泡毛细血管屏障的损伤，我们连续监测了TEER的变化，观察了各种病原体和损伤相关分子标记物(PAMPS和DAMP)和/或PMN(图1)对肺泡毛细血管屏障损伤的影响。4a)。为此，我们区分了NB44天后，这些细胞对N-甲酰基-蛋氨酸-Leu-Phe(FMLP)或佛波醇12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)完全有反应。4b)。初步实验显示，加入一种成熟的含c5a的多创伤鸡尾酒(Ptc)。36)或1μg/mL LPS后，在前4小时内可使TEER升高，随后下降。PTC或LPS的添加作用仅在16h后才能观察到，未处理组为102.7±2.8%(n=14)，PTC和LPS组分别为85.9±3.8%(n=12)和52.8±1.7%(n=6)(见图)。4c)。与活体模型相比，时间进程较慢可能是由于创伤挑战(PTC而不是机械创伤和HS)和免疫细胞组成(如巨噬细胞缺乏)的差异所致。针对这些差异，我们在系统中加入了中性粒细胞样NB4细胞。NB4细胞的存在使PTC处理的NB4细胞的屏障损伤明显加重(分别为85.9±3.8%和68.5±6.5%，在NB4细胞不存在或有NB4细胞的情况下分别为68.5±6.5%和68.5±6.5%)。我们还分析了PTC的个别成分对屏障损伤的影响(图1)。4d)。然而，即使在NB4细胞存在的情况下，包括C5a在内的单个因素也没有导致TEER显著降低，从而导致屏障损伤(图1)。4d)。

C5a-阻断剂不能挽救pmn或ptc引起的肺泡屏障损伤。

最后，我们评估了特定的C5a中和是否能挽救PTC和NB4细胞所致的屏障损伤。在最初的实验中，我们证实C5a中和NoxD 21和Ctrl本身并不显著影响阻隔完整性。16h后，NoxD 21和Ctrl处理的TEER分别为初始TEER的85.6±10.7%(n=6)和98.19±13.9%(n=6)。在Ctrl或NoxD 21存在下，肺泡毛细血管培养物暴露于PTC和NB4细胞后，TEER与单纯PTC和NB4相比，TEER无明显增加(获救)。在Ctrl和NoxD 21存在下，Teer值分别为74.1±11.92%(n=6)和83.3±7.2%(n=7)。5)。结果表明，在NB4细胞存在的情况下，单独与C5a共同孵育16h后，无论是C5a还是PTC中和C5a均不对PTC诱导的屏障减少有保护作用。

C5aR1或C5aR2缺乏症可部分缓解PT+HS后早期肺部炎症反应

与PTC孵育4h后，TEER初步降低，NB4细胞的加入进一步加重了TEER的下降，而NoxD 21抑制C5a则未见明显改善。因此，我们想确定C5a受体的缺失对创伤后下游的损伤和炎症反应有什么影响。NoxD 21可同时阻断C5aR1和C5aR2的活性。然而，由于缺乏这两种受体的小鼠无法进入，因此使用了两种不同的基因敲除变异体，即C5aR1(以下简称C5aR1 KO)或C5aR2(称为C5aR2KO)。

年龄和性别匹配的雄性C57BL6野生型(WT)、C5aR1 KO和C5aR2 KO小鼠接受PT+HS或假手术。在多发创伤后早期，PT+HS组的WT和C5aR缺乏小鼠的MAP和血流量无明显差异(图二)。6A、B)。C5aR缺乏的PT+HS小鼠对儿茶酚胺的总需求量高于WT PT+HS小鼠。6d)。由于C5aR2 KOPT+HS小鼠采血量比C5aR1KOPT+HS组少约20%，因此C5aR2 KOPT+HS小鼠血红蛋白含量比C5aR2 KOPT+HS小鼠高出近20%(图二)。6c)。总蛋白浓度(图1.7(A)和PMN计数(图1)。7B)不同PT+HS治疗组BALF无明显变化。IL-6水平(图1.7C)在没有C5aR 2的情况下明显减弱(如图所示)。7(C)，并在测试时检测IL-17(如图所示)。7(D)C5aR2KOPT+HS小鼠BALF较WT PT+HS小鼠明显降低。如先前发现的，与药理C5a抑制，没有C5aRs不影响循环水平的肺损伤标志CC16(图1)。7e)。PT+HS后小鼠肺形态可再次表现为水肿性肺泡间隔、免疫细胞增多和红细胞浸润(图1、C5aR1、KO、C5aR2KO)。7(f-K)。在NoxD 21处理的PT+HS小鼠中观察到的情况(见图)。2L-O)，C5aR 1或C5aR 2的缺失导致PT+HS小鼠肺浸润粒细胞及肺泡和末梢细支气管上皮细胞MPO染色减少(图1)。7M，N)与WT小鼠比较(图1)。7l)。由于假肺MPO染色阴性，未见WT、C5aR1、KO和C5aR2KO假肺。

尽管实验和临床证据表明，严重损伤后补体系统的激活迅速而有力。5,6,37在PT+HS后早期C5a抑制是否具有保护作用，目前尚无实验证据。本研究采用PEGylated C5a L-适配体Nox-D21抑制C5a活性，建立PT+HS模型。在证实该适配体能抑制C5a介导的PMN体外趋化作用后(图一)。1(A)建立了良好的PT+hs标准化小鼠模型。11在早期创伤后C5a受到NoxD 21抑制的情况下(如图所示)。1.-F；图1.2)。一般来说，肺可以被认为是创伤后由补体引起的炎症反应的中枢。2。早期中和C5a可减少免疫细胞在大鼠钝性胸部创伤模型伤后24小时内向肺泡间隙的聚集。19。相比之下，单独阻断C5a并不降低，而是增加了BALF内的PMN计数，诺克斯D 21处理的PT+HS小鼠创伤后4小时内PMN计数增加(如图所示)。2)。然而，在PT+HS小鼠中，经NoxD 21处理后，MPO染色显示中性粒细胞的效应功能明显减弱(图一)。2o)。这可能表明，C5a的阻断虽然减少了中性粒细胞的氧化爆发，但它可能导致促炎症反应的间接增加，因为这种阻滞同时针对C5aR1和C5aR2。Haegens等人在体外实验表明，细支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞可以从细胞外环境中摄取MPO，从而抑制这些细胞合成IL-6和IL-8等促炎细胞因子。38。本报告排除了MPO可改变NF-kB或AP-1转录调控的假设，不能提供关于MPO降低肺上皮细胞细胞因子合成的机制性见解。因此，我们不能毫不含糊地推断NoxD 21介导的抑制PMN-MPO生成是否确实导致肺上皮细胞局部合成BALF细胞因子的增加。伴随着促炎反应，PT+HS后不久不能发现早期屏障损害，Ctrl和NoxD 21处理的PT+HS动物的循环CC 16水平与此类似(见图)。2g)。这在体内研究中有一些局限性。获得的BALF样本可能被血液污染(因为胸部的钝伤)，这可能有助于测定BALF中的中性粒细胞含量和细胞因子水平。为解决这一问题，采用福尔马林固定肺切片H&E染色，观察到PT+HS小鼠体内有明显的红细胞浸润和免疫细胞浸润，Ctrl和NoxD 21治疗无明显差异(图二)。2(h-K)因此，为了对肺相关屏障损伤有更深入的了解，采用了体外三维标准化肺泡屏障模型。

建立肺泡-毛细血管屏障模型，建立模拟肺泡生理特性(细胞组成、气液间期、上皮和内皮特性)的重复性系统。该模型提供了三种细胞类型-hAELvi肺泡Ⅰ型(Ati)、原代ATII细胞和原代人内皮细胞(hpmecst1.6r细胞)在功能上模拟肺泡间隙的优点。32,39,40,41,42,43(无花果)3)。易碎的原代ATI细胞在处理过程中经常受到损伤，而hAELVi(ATI)细胞株已被证明具有Ⅰ型特征和功能紧密连接，并在气液培养条件下维持稳定的屏障，以延长增殖周期。由于HPMECs在培养过程中表现出较高的批间可变性、明显的污染水平(主要是成纤维细胞)和炎症反应的本构性激活，因此采用HMPECSTR1.6R细胞。“多创伤鸡尾酒”体外治疗26尤其是在NB4细胞存在的情况下，尤其是在NB4细胞存在的情况下，每个奇异组分在16h后才导致TEER值降低。4)。这可能部分解释了为什么在NoxD 21处理的PT+HS动物体内没有检测到排他性的“早期”屏障损伤(图一)。2在同一实验模型中，当在稍后的时间点观察时，这种情况可能会更加严重。C5a的单一阻断对PT+HS相关SIRS有什么好处需要进一步研究。在体外实验中也没有考虑到所收集的单核细胞的作用，这损害了对我们体内PT+HS模型中肺部局部发生的情况的整体理解。

因为HS已经被证明能驱动SIRS反应的严重性11,12，NoxD 21在HS诱导前给予PT+HS动物(图1)。1b)。为了确定两种C5a受体的缺失是否有明显的作用，我们使用了两种不同的敲除小鼠(图五)。6和7)。C5aR1和C5aR2的奇异效应和联合效应已在一系列生物反应中被阐明。44,45,46。在这方面，我们使用缺乏C5aR1或C5aR2的小鼠来区分它们的作用，因为NoxD 21实际上同时阻断了这两种受体的活性。C5aR2的缺失不仅减少了PMN的MPO分泌(图1)。7L-N)，但也减轻了PT+HS动物体内IL-6和IL-17水平(图1)。7A、B)。因此，与缺乏这两种受体活性相反(见图)。2克服C5aR2单独作用可能有助于解决创伤后局部肺部炎症。这在长期的屏障功能障碍反应中可能会产生什么影响，应在今后相应地加以解决。

这项研究确实引发了进一步的问题。首先，阻断上游补体因子及其激活产物(如C3和过敏毒素C3a)可进一步帮助解决它们如何影响PT+HS相关SIRS反应。其次，随后的SIRS和相应的补体激活产物的阻断可能会对每个器官产生不同的影响，并可能取决于损伤的类型。当C5aR2缺陷小鼠第一次被设计时，作者还描述了C5aR2活性丧失在肺免疫复合物损伤实验模型中帮助解决局部炎症的相关性。47。随后，Kovtun等人。结果表明，胸部创伤与骨折复合损伤可提高C5aR2 KO小鼠的BALF TNF-α、IL-10和Cxcl-1水平。48。C5aR1或C5aR2活性不改变BALF IL-6水平。48。正如本报告的结果所暗示的那样，肺部的炎症反应主要是由胸部创伤引起的，由于所监测的细胞因子以及损伤类型的不同，因此不能与我们的研究进行必要的比较，在我们的模型中包括HS的额外影响。第三，对PT+HS后补体阻断的早期效应与延迟效应进行了比较。这将有助于解决由于炎症反应而导致的屏障功能障碍的问题，以及这是否会导致创伤后期的脓毒症和MODS等并发症。第四，这些方法的结合有助于理解不同SIRS模型中C5a抑制策略显著差异的基础。这为确定在何种情况下补充封锁是有害的和(或)恢复提供了机会。49。据推测，这些发现可能有助于解释多发性创伤后肺部炎症特征的直接或间接改变以及随后发生的损害，有助于启动进一步的研究工作，以阐明这些尚未阐明的机制。