单细胞RNA测序对原代细胞毒性T细胞的特异性研究

单细胞RNA测序原则上提供了独特的机会，以提高现代T细胞免疫治疗癌症的效果。使用高质量的单细胞数据将有助于我们不完全理解决定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分化和功能异质性的分子程序，从而实现最佳的治疗设计。到目前为止，对CTL进行高深度单细胞分析的一个主要障碍是可用RNA的微小量，导致捕获效率低下。为了克服这一问题，我们设计了一种基于液滴的高通量分析方法(tDrop-seq)和一种基于平板的高性能深度CTL分析方法(tSCRB-seq)。与基于液滴的技术相比，后者平均每个基因捕获的转录本数量高出15倍。改进的基因检测动态范围使tSCRB-seq在分辨率敏感的下游应用，如梯度高置信度、基因表达和聚类表征等方面具有优势。我们通过揭示协同抑制和共刺激受体靶点在免疫治疗中的亚群体特异性表达来证明tSCRB-seq的作用。

单细胞RNA测序(scrna-seq)发展成为一种选择的方法，以获得用于单个细胞的特设基因表达程序的无偏高分辨率快照。与大规模群体测序相比，单细胞分辨基因表达谱(ScGEPs)有几个关键优势。这些能力包括解除混合群体中细胞异质性的能力，提取基因表达网络，以及根据同一细胞内真正发生的共表达来识别基因之间的调节关系。此外，scGEPs还提供了一个独特的机会来跟踪细胞间的分化轨迹和祖-子关系。1。总之，这对于提高我们对具有不同功能和表型的T细胞群体的发育和分化的理解至关重要。迫切需要对组织这一复杂分化过程的机制有更深入的了解，以指导下一代的免疫治疗方法。

在免疫反应中，具有独特抗原受体的单个幼稚T淋巴细胞识别其同源抗原并激活，迅速产生1000-10,000个克隆扩张的子代细胞。2,3。由此产生的细胞子代具有相同的抗原特异性受体，但发育成具有特殊发育和功能潜力的异质亚群体。4。迄今为止，已证实活化的T细胞群至少包含两个不同的亚群--终末分化的效应细胞(控制持续感染)和维持增殖能力和可塑性的祖细胞。后者表达转录因子Tcf 1，可用于鉴定。5。在由免疫系统解决的感染中，祖细胞分化为记忆性T细胞。如果抗原持续存在(例如慢性感染)，则祖细胞通过不断提供新产生的短期效应细胞来服务于水库功能。6,7,8,9,10,11。因此，祖细胞被认为是治疗干预的关键群体，因为有效靶向和激活这一子集似乎是在慢性感染或癌症中安装保护性免疫或治疗免疫的先决条件。此外，一些功能潜力不同的效应T细胞群体已经在慢性感染中被确认。12,13,14,15。因此，免疫治疗最重要的是确定有选择地操纵特定T细胞亚群动态的有效靶点和策略。单细胞基因表达谱在这方面提供了独特的机会。尽管scRNA-seq在免疫学领域有着广泛的应用，但一个关键的限制是，典型的治疗方案与T细胞的特殊性相斗争，与其他细胞相比，T细胞只含有极少量的RNA。因此，迫切需要开发具有更好的mRNA捕获效果的T细胞量身定制的解决方案。

在本工作中，我们使用一个完善的相关实验系统来获得幼稚或分化的T细胞群，并对经典的液滴测序(Drop-seq)进行了一系列优化。16单细胞RNA条形码和测序(scrb-seq)17。因此，我们建立了T细胞定制的两个协议的变体指定为tDrop-seq和tSCBR-seq(T来自T细胞)。TDrop-seq是一种低成本、高通量的细胞毒性T细胞转录谱分析工具，对初步的探索性分析有很高的价值。TSCBR-seq是一种在转录相似的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)群体之间描述精细转录差异的工具。后一种方法之所以强大，是因为与常用的基于液滴的方法相比，它具有更好的mRNA捕获效率(分别比tDrop-seq和10 x基因组铬分别检测到17倍和12倍的转录本)。最后，我们用tSCBR-seq鉴定了室间隔特异性调节受体，这些受体可用于选择性靶向祖细胞、功能性和功能失调的细胞毒性T细胞。

实验系统和设置

Drop-seq和SCBR-seq是目前最著名的两种scRNA-seq方法.前者具有成本效率高、吞吐量高等优点。后者具有较高的检测差异表达基因的能力，因为每个基因捕获的转录本数量较多。18。这两种方法都包含了独特的分子标识符(UMIS)，它允许通过有效消除PCR引入的偏差来对基因表达进行绝对量化。1C)19,20,21。为了优化原代T细胞的两种方案，我们使用了一个高度标准化的实验系统来获得原始或体内分化的T细胞群体。该系统依赖于P14T细胞受体(TCR)转基因CD8 T细胞，其识别gp 33表位是小鼠感染淋巴细胞性脉络膜炎病毒(LCMV)常用的抗原表位。1A)。在一个典型的实验中，从转基因供体小鼠中获得幼稚的P14T细胞，并将其少量转移到受体小鼠中。P14细胞携带由特异性抗体识别的同源标记。这样可以方便地识别和分离宿主鼠体内转移的细胞。接受者小鼠随后感染一株LCMV，引起急性感染(阿姆斯特朗株)或慢性感染(克隆株13)，导致P14活化和急性或慢性感染特异性分化。在感染前，P14T细胞在生物学上和转录上都是均一的，由于细胞大小和内容的一致性，这对于评估这两种方案之间的技术性能及其优化是很有用的。在急性感染LCMV阿姆斯特朗时，P14T细胞发展出一种功能完备的效应表型，能够清除感染。这种状态对于评估CTL功能所必需的关键免疫基因的检测效果特别有用。在长期感染LCMV第13克隆后，P14 T细胞发展出一种功能降低和控制病毒感染能力有限的表型，这一现象被称为T细胞衰竭。这一状态对了解抑制T细胞效应功能的机制具有重要意义，可用于询问具有免疫治疗潜力的相关受体的亚群体特异性表达。

基于微滴技术的原始CD8 T细胞的mRNA捕获效率很低。

由于分析所需的细胞数量很多，在混合种群中识别稀有细胞需要一种成本效益高、高通量的scRNA-seq协议。这些要求由Drop-seq满足。16它的商业模拟物是10 x基因组学中的铬系统，这两种技术都是用于scRNA-seq的微滴技术，它们依赖于将单细胞封装成独特条形码珠，形成微小的液滴(补充图)。1B)16。液滴是由水和油流精确组合成一个微流控装置，最终目标是捕获单个细胞和单个条形码珠形成一个液滴，以保持单细胞分辨力而形成的水滴。由于它的开源性质，我们决定评估滴-seq是否适合于高呼吸ctl分析。最初，我们对小鼠和人类细胞进行了典型的对照混合实验，但没有使用培养的细胞，而是使用人和小鼠的淋巴细胞(见图)。1A-C)。数据显示，小鼠与人淋巴细胞的分离是成功的，其双倍率表明含有小鼠和人类细胞的液滴保持在零(图1)。1C)。因此，在这种设置中，降-seq的单细胞分辨率可与基于将单个单元划分为聚合酶链反应板(例如SCRB-seq)的单个单元进行排序的协议相媲美，在该协议中，通过选通策略消除了单元的双重效应。接下来，我们重点评估了最初发布的Drot-seq协议的敏感性。因此，我们从幼稚的P14 CD8 T细胞中构建了单细胞基因表达谱。我们能够检测到每个细胞的1607个基因和2235个转录本(UMIS)，平均每个细胞检测到一个基因，捕获的转录本为1.4(图1)。1D)。我们预计，与平板替代方案相比，未修改的Drop-seq协议对T细胞分析的敏感性更低，但我们惊讶地看到，CTL的低RNA含量对未经修改的Drot-seq协议的产量产生了负面影响。

裁剪液滴-seq的化学，适度地提高了它对初级ctl的敏感性。

我们的数据表明，基于微滴的技术，如液滴-seq，其对原代细胞毒性T细胞的mRNA捕获效率本来就很低，因此我们试图通过改变化学来提高产量和提高性能。为此，我们修改了裂解条件和杂交条件。此外，我们测试了3种不同的逆转录酶(RTS)和PCR扩增在4%FicollPM-400作为大分子拥挤剂存在下。如UMIS/基因比率所示。1E(1)用0.1%Igepal CA-630取代原来用于裂解Sarkosyl洗涤剂的方法；(2)用0.5 M NaCl补充裂解缓冲液，以增加杂交；(3)用锁定核酸碱(3‘LNA)取代模板开关寡糖(TSO)中的3’最大rg，以稳定TSO-二聚体。我们观察到，平均检测到一个基因，平均为1.5(使用Igepal CA-630)、1.6(添加NaCl)和1.7(使用3‘LNA TSO)UMIS，PCR扩增后也伴随着cDNA产量的增加(补充图)。2A)。在三个RTS中，极大值H-RT(热Fisher)和SuperScript IV RT(热Fisher)在PCA扩增后的cDNA产量方面表现良好(附图)。2B)，所以我们决定保留最初使用的MaximaH减去RT。我们还观察到，用分子拥挤剂FicollPM-400补充PCR扩增反应，可提高cDNA的产量(附图)。2C)。总之，我们设计了一个T细胞调整的下降-seq协议(tDrop-seq)，它增加了对主CTL的敏感性.

Ctl优化的tscrb-seq具有较好的mRNA捕获效果。

虽然成本效益和高吞吐量能力是tDrop-seq协议的主要优点，但是用这种方法检测单个基因的低拷贝数大大限制了利用这些数据进行生物信息分析的能力。事实上，描述基因表达精细动态差异的高分辨率数据对于分子网络生成、发育轨迹分析和密切相关子集之间的细微区别等几种生物信息学方法都是必不可少的。由于这些类型的分析是界定T细胞分化机制的关键，掌握一种具有高mRNA捕获效率的方法将有助于研究急性和慢性感染形成的祖细胞之间的转录特性，以及在功能性和衰竭性T细胞反应中形成的不同效应细胞亚群。因此，我们决定评估SCRB-seq的适用性。17用于敏感的CTL分析。SCRB-seq是一种基于平板的单细胞rna测序协议，它依赖于使用荧光激活细胞分类(Fcs)对单个细胞进行分类，使其进入PCR平板的单个井中(补充图)。1B)。为了评价原SCRB-seq方案的敏感性，我们尝试从幼稚的P14CD8 T细胞中获得cDNA，但未能用生物分析仪检测到成功的扩增。2A)。我们认为这是因为在最初的协议中使用了硅基自旋柱来对已经条形码的单细胞转录序列进行反转录池。在我们的经验中，用于提取RNA和DNA的自旋柱具有较低的回收率和较高的污染率，并且得到的RNA完整性数低于磁珠法纯化的RNA。为了克服这一问题，我们采用Agencourt RNA清洁XP磁珠(贝克曼库尔特)进行逆转录前RNA纯化。这一步骤不仅保证了反转录的最佳条件，而且排除了潜在的基因组污染。为了防止有价值的转录本丢失，我们选择了在cdna扩增之前汇集已经条形码的单细胞反应，这将需要额外的一步基于珠的纯化来减少反应量。因此，我们进行了细胞分离cDNA扩增。扩增后，用Agencourt AMPure XP磁珠聚合纯化cDNA。上述策略从原代细胞毒性T细胞中扩增出高质量的cDNA。2B)。经过库的准备和测序后，SCRB-seq的这种修饰检测到的UMIS基因数量比原始的Drop-seq协议高出近18倍。2C和1D)，强调其优越的敏感性。由于逆转录前的RNA纯化允许使用更苛刻的裂解条件，我们用含0.2%TritonX-100洗涤剂或TCL缓冲液(加1%β-巯基乙醇)的更严格的裂解液取代原来使用的Phusion HF缓冲液(1：500稀释)。我们观察到，在三种裂解条件下，添加1%β-巯基乙醇的奇根TCL缓冲液对其捕获效果的提高最为显著(图一)。二维空间)。检测到的基因从1350个增加到1641个，转录本从34,657个增加到87,037个。伴随着每一个基因检测到的UMIS的中位数从26增加到53(如图所示)。2E)。此外，与3‘LNA TSO联合使用TCL可使检测到的基因、转录本(UMIS/基因)和转录本(UMIS/基因)的中位数分别增加到1936、127、963和65。我们采用了这个CTL优化版本的SCBR-seq协议，我们称之为tSCRB-seq(来自T细胞)。TSCRB-seq具有较高的mRNA捕获效率，可以在CTL中检测到更广泛的基因表达动态范围。

Tscrb-seq具有较高的mRNA产量和较低的非信息性核糖体转录本的特征。

下一步，我们直接测试tDrop-seq、tSCRB-seq和10 x基因组铬并肩解读免疫反应的能力。为此，我们用tDrop-seq和tscrb-seq建立了p14细胞在急性lcmv Armstrong后第8天恢复的单细胞基因表达谱，并将其与已发表的10 xchrom数据集进行了比较。22。此时，回收的细胞具有明显的效应表型，其特征是表达了一组对细胞毒性T细胞功能至关重要的明确的效应分子。4。与tDrop-seq相比，10 xCr显示出更高的mRNA捕获效率(表)1)。而tSCRB-seq检测到的单个基因转录本分别是tDrop-seq和10 xCr的17倍和12倍，从而获得了更好的mRNA捕获效果。有趣的是，10 x铬和tDrop-seq的特点都是高比例的非信息核糖体转录本，从而浪费了测序读取(表)。1和补充图。3)。与富含转录本的tSCRB-seq文库相比，tDrop-seq和10 xChrom的转录缺陷文库确保了每个细胞碱基中检测到高数量的基因。然而，这并不影响对这个时间点免疫基因的关键的检测，这些基因在所有方法中生成的细胞中的相似部分中被检测到(补充表)。1)。接下来，我们观察了测序深度对每个细胞平均检测到的转录本的影响。3A)。TDrop-seq和10 xCr在相对较低的测序深度(每个细胞约有40,000个映射读)饱和，而tSCRB-seq在较高的测序深度达到转录饱和(每个细胞约有12万个映射读)。这一观察结果与10x基因组的推荐测序深度相吻合，即每个细胞对外周血单个核细胞(其中一部分是CD8 T细胞)的50,000读码。我们建议对tSCBR-seq生成的转录序列进行测序，其测序深度至少为每个细胞200,000条.有趣的是，即使在相同的测序深度，tSCBR-seq也比tDrop-seq和10 xCr捕获更多的细胞转录本。接下来，我们要评估tSCBR-seq所观察到的转录本的增益是否与免疫标记的检测相关(如图所示)。3B)。与tDrop-seq和10 xCr相比，tSCBR-seq捕捉到的关键免疫基因，包括转录和表观遗传调控因子的每个细胞转录本的数量显著增加。此外，tscbr-seq检测到那些在细胞间的标准差较高的基因，即使采样到每细胞读取40,000条，这表明基因表达的动态范围更高(补充表)。2)。综上所述，我们预计，tSCRB-seq检测到的每一个基因转录本的动态范围将对所有需要高精度的下游应用产生关键影响。

Tscrb-seq使关键的共抑制和共刺激受体目标的室间分辨表达成为可能。

在抑制性受体阻断后，干细胞样祖细胞群对T细胞的增殖起着至关重要的作用。7,23，但这些群体所表达的调控受体仍然含糊不清。此外，最近的研究认识到，一种高效的免疫治疗需要的不仅仅是简单的效应细胞的扩张，而效应细胞随后会产生衰弱的耗竭的表型(仅在程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)阻断的情况下)，而是一种确保产生和维持功能后代的方法。24,25。这可以通过将PD-1阻断与二次治疗相结合来实现，其目的是促进祖细胞或效应T细胞的健康。因此，在ctl上识别协同抑制和共刺激受体的间隔特异性表达将极大地有利于日益增长的免疫治疗领域，该领域已经发展成为全世界数百万患有恶性疾病和慢性病毒感染的人的一种严重的治疗选择。为了提供这种ctl室特异性表达的共抑制和共刺激受体的治疗策略，我们利用tscrb-seq生成的数据集，由1700个p14 T细胞转录子在慢性lcmv克隆13感染后第40天从对照组(860个细胞)和CD4亏损动物(860个细胞)中恢复。12。为了根据转录组的相似性对细胞进行无偏分组，我们首先使用了非线性降维方法(t分布式随机邻域嵌入(TSNE)，旨在将具有相似局部邻域的细胞放置在高维空间中。然后，我们使用seurat构建基于图形的簇-单元颜色，它与tsne集群-单元定位(图1)共同定位。4)。我们鉴定出5个簇，一个代表树干样祖细胞(表达tcf 7)和四个效应群(gzma、gzmb、gzmk和Fasl的表达)，其中一个具有功能(tbx 21和cx3cr1表达)，三个有不同程度的功能异常表型(nr4a2、pdcd 1和cd 160)。7,26,27。此外，我们还能识别出选择性靶向祖细胞(CD 9、Icos和Tnfrsf 4)、功能(IL18r、Klrc 1、Klrd 1和Klrk 1)和功能失调(CD 244和Tnfrsf 9)CD8 T细胞的特异性调节受体。与p14相比，T细胞转录子从类似的实验装置中恢复，用10 xCr生成。13，tSCRB-seq生成的转录序列在簇间提供了更为详细和分级的关键免疫基因的差异表达(补充图)。4)。这尤其影响关键转录因子(如Tbx 21和IRF 7)和衰竭标记物(Pdcd 1、Cd160和Entpd1)。这表明tSCRB-seq作为高效的mRNA捕获方案，在治疗性关键的CTL亚群体之间描述精细基因表达差异的能力。

总之，我们强调了优化和考虑方法的重要性，认为这是成功应用scRNA-seq策略解决健康和疾病中细胞毒性T细胞亚群复杂关系的先决条件。必须预先做出的一个关键决定是，高吞吐量、低成本还是高分辨率是分析的重点。在这项工作中，我们提供了满足这两种需求的工具。具有成本效益的tDrop-seq是一种基于液滴的协议，可应用于需要对大量T细胞进行成本效益分析的环境，例如识别稀有细胞群体。TDrop-seq的主要缺点是检测单个基因的拷贝数很低，限制了它在需要高功率生物信息学分析的环境中的使用。与微滴技术相比，tSCRB-seq是一种基于平板的方法，具有更好的mRNA捕获效果。这使得能够检测到更广泛的基因表达动态范围，这使得tSCRB-seq非常适合于高深度的ctl分析。这是以有限的吞吐量和更高的劳动强度为代价的。然而，像tscrb-seq这样的高敏感性方法有可能更好地揭示健康和疾病中T细胞分化的过程，并增强针对具有挑战性的免疫疾病的新策略。这表现在CTL上关键的共抑制和共刺激受体靶点的室间分辨表达.最后，我们为未来的scRNA-seq协议优化提供了一个框架，以解决困难但与生物相关的主要细胞类型。