3I14与H6和H10感染人的结合
最近出现的H10N8禽流感病毒7(A/江西-东湖/346/2013)(第2组)和H6N18(A/台湾/2/2013)(第1组)感染导致我们调查mAb 3I14和3I14D93N可以用类似于我们观察到的其他HA毒株的结合亲缘关系从每种病毒中结合HA。27。虽然我们研究了H6(如H1和H5)和H10(如H7和H9)的系统发生相似的病毒，但这两种病毒都没有包括在我们最初的3I14的特性中。27。这株H6的残基是Glu39。HA2，这在H5导致了3I14的工程D93N和增强的结合亲和力，因此，我们假设3I14D93N也可能与H6结合，提高亲和力。3I14和3I14D93N具有相似平衡结合常数的束缚H10(KD)为~0.4NM(表)1和补充图。1)。与此形成对比的是，野生型3I14在KD调至H6，而3I14D93N保持与H6(野生型3I14~3NM和3I14 0.4NM)的强结合能力D93N)(表)1和补充图。1).
以确定改进的3I14的结合亲和力D93N突变体是由于稳定了3I14的IgG，我们测量了熔化温度。TM)第3I14型和第3I14型D93NIgG我们发现TM每例均为78°C(附图)。2)，表明轻链Asp93Asn突变对IgG的热稳定性没有影响。相反，抗体脱落率降低了大约五倍，而在速率上几乎没有变化，这表明这一残留物在结合HA中起着直接作用。
与第1组和第2组配合物3I14 Fab的结构
探讨3I14异亚型识别IAV的结构基础，并确定3I14增强结合亲和力的分子细节。D93N到H6，3I14和3I14的晶体结构D93N从H6组(A/台湾/2/13)、第2组H3(A/Victoria/361/2011)和H10组(A/江西/IPB 13/2013)解决了与HAS的复合纤维。总共有四个复杂的结构使我们对3I14和3I14有了一个全面的理解。D93N-约束模式：H3：3I14，H3：3I14D93N，H6：3I14D93N，和H10：3I14分别在第3.5次、第3.2次、第3.5次和第4.2次会议上通过(表)2)。每个复合物中HA蛋白的结构与以前报道过的apo结构相似(补充图)。3)28,29。在HA：Fab界面上，H3和H6配合物的电子密度是清晰和有序的，使得3I14的互补决定区(CDRs)可以人工构建到H3结合结构中(补充图)。4)。H10结构对HA和FAB部分的C-α主链具有清晰的密度，但侧链残基未被很好地解决，在融合肽附近缺失了一些密度。因此，我们对分子间接触的描述仅仅是基于H3和H6结构。
3I14认识到第1组和第2组的茎以与发现一致的方式阻止HA前体的蛋白裂解。27在一个重叠的区域，就像其他报道的茎定向bnbs一样。22,24,25,26,30,31,32(无花果)1A和补充图。5)。该3I14表位跨越第二个HA原生质体，从而使HA上的总界面面积为980个。2，与高结合亲和力一致(图1)。1B，c)。重链相互作用仅通过与HCDR 3的接触发生，HCDR 3埋有481个表面2在疏水沟，在Helix A的中、下部之间，融合肽和HA1之间。
图1：3I14对第1组和第2组HA蛋白的识别。aFab 3I14结合H3血凝素的X线结构。一个HA原生质体在卡通中用HA1色橙色和HA2色红色显示。另外两个HA原生质体在表面表示和彩色白色或灰色。3I14的表面表现为重链色蓝色和轻链色绿色。b在从a显示H3-3I14界面和HA的主要结构元素，这是公认的。螺旋A呈红色，融合肽为彩色青色，HA1为橙色，第二个HA原生质体为灰色。3I14 CDR以卡通形式显示。HA1第38位的2组特异性糖残基标记为NAG 38*。c类似的观点b显示H6-3I14D93N接口。第二个HA原生质体上的1组特异性糖与3I14相互作用，标记为NAG 33*。
HCDR 3有23个残基，有5个残基(Tyr 99，Tyr 100，Trp100G，Val100H和Ala100J)(Kabat编号)，产生了广泛的范德华(VDW)和氢键相互作用(图)。2A，b)。依赖hcdr3识别疏水沟槽，这与其他使用重链或重链或重链和轻链cdr结合与HA上类似部分相互作用的茎定向bnbs形成了对比。18,22,23,24。HCDR 3形成一个六残留环，从疏水槽延伸，由残基Phe100A通过Val100F组成。在环的中心，Arg100D沿融合肽突起，可与第18(第2组)或Ile 18(第1组)的主链氧发生极性相互作用。影响3I14中和宽度的一个因素是第1组和第2组之间的氨基酸差异的调节能力(图1)。2A-d)。例如，Tyr 100HCDR 3与Leu 38进行vdWs交互。HA2(第2组)或Arg 38的脂肪侧链HA2(第1组)和Trp100GHCDR 3VDW与Trp 21的联系方式HA2和Ile 45HA2关于螺旋A，以及主链氧与Asn 49之间的氢键HA2(第2组)或Thr 49HA2(第1组)。Val100H与大众联络Ile 48HA2和Trp 21HA2，而Ala100J则与Leu 52进行了VDW的接触。HA2(第2组)或Val52HA2(第1组)。Ala100J的主链氧源HCDR 3和Ser97HCDR 3每个氢键分别与保守残基Asn 53和Gln 42形成氢键。另一个有效中和第1组和第2组病毒的因素是hcdr3在trp 100 G上的局部灵活性，这与trp 21的群特异性方向保持了~3-4的距离。哈(补充图。6)。合在一起，HCDR 3在每个复合物中有六种氢键相互作用和类似的VDW接触.
图2：3I14和3I14的绑定比较D93N第2组和第1组。a, b3I14 HCDR3与第2组H3之间的相互作用(a)或第1组H6(b)有。3I14 HCDR3是蓝色的，残基会产生极性或vdWs的相互作用，显示为棒状，并标记为蓝色。HA螺旋A呈卡通色和红色，融合肽呈色青色，HA1呈橙色，2组特异性糖聚糖呈黄色球状。使极性相互作用的残基是黄色的，而vdWs的接触则是红色的。虚线表示氢键。第1组和第2组之间存在差异的残基用星号表示。c, d3I14 LCDR 2和FR3相互作用，突出交叉原生质体接触。3I14轻链是彩色绿色，并显示为卡通绿色标签。HA着色和标签遵循(a, b)，除1组特有的糖聚糖以黄色棒状显示外.原生质体2被FR3掩埋，呈灰色。
3I14轻链在结合和掩埋医管局总表面积的一半以上(499个)中起着重要作用。2)，通过LCDR 2、LCDR 3和LFR 3进行联系。特别是，LFR 3是负责近一半的轻链掩埋面积，通过中介接触相邻的原生质体(图1)。2C，d)。轻链的这个巨大的埋地表面积是不常见的，因为通常重链比轻链对束缚的贡献更大。33。3I14轻链还能容纳第1组和第2组HAs之间的氨基酸替换，例如Arg 54。LCDR 2，它与asp 32的侧链形成了交叉的原氢键。HA1(第2组)或Lys 32HA1(第1组)。此外，Ser63LFR 3侧链Gln 33的氢键HA1(第2组)或Asn 33HA1(第1组)关于原生质体2和Ser67LFR 3含谷氨酸35侧链的氢键HA1(第2组)，而Ser65LFR 3能与Gln 25形成氢键吗？HA1(第1组)。尽管3I14表位的跨度很大，但沿着LFR 3的丝氨酸残基能够容纳位于Asn 33上的第1组糖胶。HA1在第二个HA原生质体中，LFR 3上的大量残基可能会导致立体冲突，从而阻止这种广泛的交叉原基相互作用，并可能限制3I14结合的能力。
体细胞突变在HCDR 3形成中的作用
3I14由IGHV 3-30*18和IGLV 1-44*01生殖系基因。HCDR 3使用IGHD3-22*01在vh和vh两侧都有大量N元素添加的dh片段。IGHJ 4*02接合点27。我们以前曾报道过，体细胞高突变(Shms)对重链(13 Shms)或轻链(7 Shms)的生殖线逆转导致与h3和h5的结合亲和力降低了2至7倍，而这两条链同时向生殖线的逆转则使结合亲和力降低了大约14倍。27。7个轻链SHM中有6个位于LCDR 2和LFR 2中，并在结构上进行了映射，结果表明它们聚集在重链的界面上(图1)。3A，b)。例外是Gly 30LCDR 1，它是从种系中的丝氨酸突变而来的，似乎可以防止立体碰撞或极性丝氨酸侧链指向脂肪侧链Lys 39。HA2(第2组)或Glu39HA2(第1组)(附图)7)。由于大多数SHM的位置，一个可能的结果是3I14重轻链界面的稳定，这已被证明是抗体亲和力成熟的一个关键特征。34,35.
图3：3I14体细胞高突变形成HCDR 3。a3I14重链和轻链野生型和生殖系的序列。体细胞高突变(SHMS)以粗体表示。b在3I14重型和轻链上的SHMs显示为白色的棍子和标签。c在盒子里放大b将围绕HCDR 3的SHM显示为白色透明表面和棒。HCDR 3显示为卡通和棍子。HCDR 3是由与围绕它的SHM交互作用形成的。
重链SHMs分布于HCDR 1、HCDR 2、FR3和HCDR 3(图1)。3A，b)。虽然HCDR 1和HCDR 2不直接与HA相互作用，但SHM发生在看似“模压”HCDR 3到识别疏水沟槽中的大面积所需的构象的位置上(如图所示)。3C)。当与轻链shm一起观察时，hcdr3被夹在7个总突变之间，包括由轻链体变异残基His34形成的一个口袋。LFR 2和Phe 36LFR 2，可以用来锚定Pro96。HCDR 3。因此，重链或轻链菌系回复突变体所获得的结合亲和力的大幅度下降可能是由于HCDR 3的可塑性所致，这种可塑性可能是由于缺乏某些或全部这些相互作用所致。
提高3I14结合亲和力的分子基础D93N调至H6
3I14D93N根据我们以前的研究，突变体与重组H6的结合能力增强，而与h3和h10的结合亲和力保持相似。27。在H6键合结构中，Asn 93附近的电子密度LCDR 3被很好的解析，并显示出一个氢键正在与Arg 38形成。HA2(无花果)4A)。表位表位表面电位均相对中性，局部环境为3I14。D93N尽管有正电荷的Asn 93替代，但仍有轻微的负值(见图)。4A)。此外，HA上接近Arg 38的残留物HA2，即Glu39和Asp37，减少了Arg 38所携带的正电荷，从而促进了与3I14的更好的电荷互补。D93N并解释了改进的结合特性。
图4：3I14和3I14D93N与H6和H3结合。aH6-3I14D93N复杂；bH3-3I14D93N复杂；cH3-3I14野生型配合物。左面板显示LCDR 3为绿色卡通和棍棒，HA显示为红色卡通和棍子。一σ 2Fo–Fc电子密度用蓝色表示。氢键被描绘成黄色虚线。右边的面板是左边图像的静电表面表示。
在H3-3I14D93N结构，Asn 93LCDR 3与Lys 39形成氢键哈，符合H6-3I14D93N结构，显示LCDR 3的负电荷接触表面，而在这种情况下，H3表面带正电(图1)。4B)。在H3-3I14野生型结构中，Asp93LCDR 3不与Lys 39氢键哈，可见于每条侧链周围的清晰电子密度(如图所示)。4C)。确切地说，Lys 39哈假设另一种旋转剂，其侧链延伸至3I14 lcdr 1，并与Asn 32形成氢键。LCDR 1。这个方向扩展了Lys 39哈ASPS 93负片中心侧链LCDR 3和Asn 31LCDR 1。Lys的能力39哈采用多个轮调器，用于3I14和3I14D93N为了在这两种情况下保持氢键相互作用，每种抗体与第2类抗体的结合亲和力是相似的。
3I14与其他V结合的比较H3-30衍生bnbs
3I14是第四个利用VH3-30生殖系基因，以及mAb 3.1、39.39和FI6v3(稳定版本的FI6)24,25,26。噬菌体展示筛选出的MAb 3.1对H1 A亚型(H1、H2、H5、H6)和某些H9亚型均表现出异亚型中和作用，而39.39和FI6v3分别中和第1和2组病毒。以更好地理解这些VH3-30BNAbs导致HA的广泛识别，HCDR 3的长度，重链和轻链中进行SHM的残余物的百分比，以及附近的掩埋表面积进行了比较。这项分析显示，除了3I14、FI6v3和39.29之外，几乎没有什么不同的特征，每一个都有200-600的贡献。2副轻链埋地面积(补充图)。8)。然而，每个抗体接近HA干细胞的角度不同。关于3I14，第五条H39.29，FI6v3和3.1的域被旋转到~42o, 49o，和62o分别用FI6v3和3.1逆时针旋转，39.29顺时针旋转。5A-d、顶部)。此外，FI6v3以垂直的方式接近HA，而其他抗体的角度都是20-45。o朝向医管局的头域。入路角度在HA茎上形成明显但重叠的脚印，覆盖HA1和HA2区域。MAB 39.29掩埋~11002关于HA，而FI6v3埋葬~8202和3.1掩埋~9202(无花果)5A-d、底部)。单抗3.1的角度导致HA掩埋表面在HA1和HA2之间几乎均匀分布，但在Asn 32处与保守的第2组糖聚糖发生潜在的冲突可能导致第1组的选择性。FI6v3与相邻的原生质体有接触，但程度比3I14(230)要小。23I14诉902(第六财政年度)。
图5：朝向医管局的角度VH3-30Bnbs。a–d顶部：每个VH3-30抗体(H3-39.29，PDB)4KVN；H3-FI6v3，PDB3 ZTJ；H1-3.1，PDB4PY8)。HA在表面表现为HA1和HA2，分别来自原生质体颜色为橙色和红色。每个Fab是用3I14颜色的卡通表示，如图所示。4，39.29，FI6v3和3.1颜色根据标签。数字所示的程度b–d是否需要旋转来叠加VH该抗体在V上的结构域H在Coot中确定的3I14域。底部：从顶板上为每个复合体的ha部分，旋转~45。o。每种抗体的掩埋面积在HA上呈彩色青色。黑箭a和c指示交叉原生质体相互作用。
虽然从不同的角度接近，但每一抗体确实在HA疏水沟内进行了广泛的接触。这些相互作用可以通过与五个子口袋的接触来概括，从螺旋A的顶端开始，从膜近端的远端开始，被编号为1到5(如图所示)。6A-d)。值得注意的是，每种抗体都有相同的VH-JH基因片段使用(VH3-30, JH4)24,25,26和变量DH段，从而产生HCDR 3，用于绑定口袋2和3，以与Trp 21的接触为中心。哈(无花果)6E)。与剩余的口袋的互动是不保守的，并采取多种形式。例如，3I14专门利用HCDR 3与五个口袋中的每一个进行交互，而FI6v3和39.39则包含轻链CDR和3.1连接HCDR 1。
图6：VH3-30-向医管局绑定的衍生bnbs。aH3-3I14；bH3-FI6v3；cH3-39.29；dH1-3.1.全VH3-30-衍生抗体识别螺旋A与融合肽之间的疏水沟。CDR以卡通片的形式显示，残余物与子口袋相互作用(标记为1到5)，以棍棒显示。融合肽为彩色青色，Trp 21呈棒状，螺旋A呈红色，HA1呈橙色。e抗体CDR序列，其中至少有一个与子口袋相互作用的残基.突出的残基与HA子口袋的相互作用相吻合：口袋1-红色；口袋2-青色；口袋3-绿色；口袋4-黄色；口袋5-紫色。
3I14的另一个显著特点是HCDR 3被翻转~180。o与另一个相比VH3-30抗体，反映不同的进场角度(如图所示)。6A)。虽然FI6v3最接近3I14，主要利用HCDR 3(残基Arg 99、Leu100A、Phe100D和Trp100F)作为第一至第四口袋，但与FI6v3的交互作用需要招募具有躯体变异的残基Arg 93。LCDR 1(无花果)6B)。一个arg93ser基因逆转突变体与第2组的结合亲和力降低了44倍，从而证明了在fi 6成熟过程中这种特殊相互作用的重要性。25.
与其他生殖细胞的直接抗体比较
接下来，疏水槽之间的相互作用VH3-30-与属于特定抗体类别的生殖细胞中的抗体进行比较(图1)。7A-d). VH1-69-衍生抗体，如CR 911418和27F323，包含由位于位置98或99的HCDR 3酪氨酸(Y)与HCDR 2残基Ile 54(I)和Phe 55(F)组成的ify基序(图1)。7b)。与所有干细胞导向抗体一样，CR 9114和27F3使用hfr 3和hcdr2进行疏水槽内的大部分接触，并且没有与任何一种分子有广泛的相似之处。VH3-30抗体。与3I14的唯一相似性是HCDR 3酪氨酸用于结合口袋4。
图7：3I14 HA茎疏水沟与其他茎结合抗体的相互作用比较。a VH3-30与疏水沟槽的相互作用用重链和轻链CDRs显示，如图所示。6。HA茎以表面表现形式显示，并通过静电(红-负，蓝-正，白色-中性)着色.与口袋1-5相互作用的残基被一条虚线所包围，并被标记。b抗体CR 9114(PDB)4 FQI)和27F3(PDB)5 WKO)从VH1-69生殖线显示。c抗体介导8852(PDB)5JW4)和56.a.09(PDB)5K9K)从VH6-1细菌系。d VH1-18抗体31.b.09(PDB)5K9O)，S9-3-37(PDB)6E3H)和16.g.07(PDB)5KAN). e这个VH3-331.a.83抗体(PDB)5 KAQ)。为b–e重链CDR呈蓝色，轻链CDR呈绿色.分子签名在每个数字下面表示，如果没有标识，则表示为唯一的。
这个VH6-1-和VH1-18另一方面，衍生抗体利用由39.29和FI6v3共享的分子标记。Medi8852和56.a.09代表VH6-1 + HD3-3使用与39.29相同的FGV/I基序的抗体类，其中HD3-3编码的苯丙氨酸识别口袋2，或者是细菌编码的缬草碱或SHM改变的异亮氨酸结合口袋3(图3)。7C)。这个VH1-18Germline包含多个类，包括HD3-9类，例如s9-3-37抗体，它包含一个lxyfxwl基序。22(无花果)7D)。FI6属于这一类，这导致Tyr和Phe分别放在第二和第三个口袋中。MAB3.1虽然没有严格地包含这个母题，但确实共享Tyr和Phe交互。抗体31.b.09(图1)7D)还利用HD3-9基因(与S9-3-37和FI6不同的阅读框中翻译)，携带一个ILTG基序，将Leu放在第三个口袋中，而不是一个PHE。MAB 16.g.07(VH1-18, D2-15, JH2)是一个共享shm派生的thr 52的多捐助者类。HCDR 2和一个HCDR 3 QXXV基序22(无花果)7D)。16.g.07的结合与mAb 31.a.83最为相似(VH3-23, D3-9, JH6)(图1.7E)，它目前被描述为一个独特的谱系。22并主要通过HCDR 3结合疏水沟槽(图3)。7E).
总之，这一全面的比较表明，V(D)J的安排VH3-30抗体可以形成多个标记来针对HA干细胞。在某些情况下，这些HCDR 3签名集中在其他V所使用的类似结构解决方案上。H生殖细胞片段。3I14是唯一的能力解决这一景观问题，通过反向定位的HCDR 3，并在这样做，使所有五个疏水口袋。此外，3I14轻链促进交叉原生质体结合和正确定位HCDR 3到茎槽。目前，3I14属于一个没有特征的类，它代表了VH3-30-衍生的bnbs。
