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CTLA-4在B-1a B细胞中的表达与免疫耐受的关系

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发表时间:2021-01-25 13:13作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

CTLA-4是T细胞功能的重要调节因子.在这里,我们报告了这种免疫调节剂在小鼠B-1a细胞中的表达,通过调节这些早期发育中的B细胞来维持自我耐受性,这些B细胞表达了丰富的自我反应能力。从B细胞中选择性缺失CTLA-4可使小鼠自发产生自身抗体、脾脏T滤泡辅助细胞(Tfh)和生发中心(GCs),并在生命后期产生自身免疫病理。这种免疫平衡受损是由于CTLA-4的丢失导致B1a细胞功能障碍所致.因此,CTLA-4缺陷的B-1a细胞上调了表观遗传和转录激活程序,并表现出增强的自我补充能力.这些激活的细胞进一步内化表面IgM,分化为抗原提呈细胞,并在正常异基因同种异体小鼠中重组,诱导GCs和Tfh细胞表达高度选择性的库。这些结果表明CTLA-4对B-1a细胞的调节是一种重要的免疫调节机制。

导言

B细胞参与免疫防御和维持免疫稳态。在小鼠中,卵泡B(FOB)、边缘区B(MZB)和CD5。+B细胞(B-1a)是主要的成熟B细胞亚群,从发育起源、表型、解剖位置和功能等方面相互区别。1,2,3。B-1a细胞主要在胎儿发育过程中产生.作为个体发育过程中最早出现的B细胞,B-1a细胞在脾脏中的出现早于FOB和MZB细胞。在发育停止后,B-1a细胞通过自我补充维持在成年动物体内,在成体动物体内,B-1a细胞由脾脏中的一小部分B细胞组成,但在腹腔等体腔中是占主导地位的B细胞亚群。1,2,3.

研究表明,B-1a和常规B细胞(如FOB)起源于在个体发育过程中不同时期出现的独特的祖细胞。4。早期的移植研究表明,胎肝中的B细胞祖细胞能够有效地支持B-1a代,而成体骨髓(BM)中的祖细胞尽管具有很强的支持传统B-细胞生成的能力,但其生成B1a细胞的能力却很差。3,5,6。后来的研究进一步阐明了在胎儿和成体bm B细胞发育途径,即lin28b中运作的独特的基因程序。+莱特-7内格B-细胞前体产生B-1a细胞,而Lin28b产生B-1a细胞。内格莱特-7+前体支持常规B细胞发育7,8。最近的研究表明,B-1a细胞来源于卵黄囊和主动脉旁裂软骨细胞中E8.5-E9.5周围的前体,与造血干细胞无关。9,10,11.

根据这些发育差异,我们先前的研究表明,b-1a igh细胞库与所表达的fob和mzb细胞库有很大的不同。12。也就是说,在新世代的头几周之后,B-1a IgH剧目经历了有力的V(D)J选择,从而产生了比FOB和MZB细胞表达的序列更少随机和更重复的序列,并包含所有成年动物共享的高度选择的V(D)J序列。此外,随着动物年龄的增长,B-1a IgH库会积累由激活诱导的胞苷脱氨酶(Aid)介导的高突变和类切换引起的变异。12。重要的是,B-1a曲线图V(D)j的选择和多样化在无菌条件下是比较有效的,排除了微生物源抗原作为这些过程的驱动力。12.

我们的研究发现,在无菌小鼠中,B-1a IgH库的选择过程正常进行,这一发现支持了这样的观点,即B-1a细胞的产生反映了bcr介导的自身抗原的阳性选择。12,13。Hayakawa等人14通过证明Thy-1特异性B-1a细胞的产生及其抗Thy-1天然抗体的产生需要Thy-1抗原,从而巩固了这一概念。B-1a代对bcr信号的依赖性在研究中更加明显。研究表明,破坏bcr信号的突变导致B-1a细胞减少甚至消失,而bcr信号负调控因子的缺失则增加了它们的数目。1,2.

B1a细胞产生抗体反应的基础是独特的汇辑和曲线图的定义机制。B-1a细胞产生天然抗体,即不受外界抗原刺激而分泌的循环抗体。2,15。有趣的是,许多天然抗体识别低亲和力的自身抗原,并履行重要的内务功能,如清除细胞碎片或代谢废物。16,17,18。由于这些保守的部分也是由病原体表达的,这些预先存在的天然抗体也提供了抵御病原体入侵的第一线。2,19,20,21.

然而,使B-1a细胞产生广泛的功能上重要的自身反应天然抗体的机制提出了一个问题,即B1a自身抗体的产生是如何被调控的。这一调控过程必须将bcr介导的自身抗原呈递和高亲和力自身抗体产生的GC形成的风险降到最低。研究发现B-1a细胞的CTLA-4表达是这一控制过程中的关键因素,并证明当B-1a细胞失去CTLA-4时,它们就会失去功能,并能诱导Tfh细胞和GC反应。

CTLA-4是一个关键的T细胞检查点调节器.自然发生Foxp 3+调节性T(Treg)细胞构成性表达CTLA-4并要求其抑制作用22,23。活化后,非Treg T细胞也能诱导ctla-4的产生,从而对其增殖和细胞因子的产生产生负调节作用。24,25。CTLA-4在负调节T细胞功能方面的极端作用已在CTLA-4缺乏的情况下得到了很好的证明。CTLA 4−/−)小鼠和ctla-4 Treg基因敲除小鼠,所有这些小鼠都是死于致命的淋巴增生性自身免疫。22,26,27.

在此,我们展示了CTLA-4在B-1a细胞中的表达,这是一种从胎儿发育而来的B细胞亚群,并表达了为自身反应性而丰富的Ig库。我们的研究还表明CTLA-4通过调节这些B细胞在维持免疫稳态方面的关键作用。

结果

B-1a细胞构成性表达CTLA-4

CTLA-4通常被认为是一种T细胞特异性调节因子.然而,我们在此报告CTLA 4S在成年小鼠脾脏和Perc中也有B1a细胞表达(图一)。1A)。相反,在脾FOB、MZB和腹膜B-2细胞中不能检测到。1A)。我们的发现与免疫基因组计划(ImmGen)数据库中公布的微阵列数据吻合得很好。CTLA 4B细胞祖细胞、未成熟B细胞在骨髓和脾脏中表达最少(附图)。1A)。我们进一步证明CD 138+血浆细胞(Pc),来源于B-1a细胞和静息小鼠的秘密IgM。15,也表示CTLA 4(无花果)1A).

图1:CTLA-4在静息B细胞室内被B-1细胞选择性表达.

a CTLA 4用qRT-PCR法检测成熟B细胞亚群在2~3月龄C57BL/6J小鼠中的表达。B细胞亚群通常被定义为:B-1a,CD 19。+IGMIGDLO/−CD 21LO/−CD 43+CD5+;B-1b,CD 19+IGMIGDLO/−CD 43+CD5内格;MZB,CD 19+IGMIGDLO/−CD 21CD 43内格CD5内格;FOB和腹膜B-2,CD 19+IGM罗氏IGDCD 43内格CD5内格;PC,CD 19+IGD内格CD 138+CD 267+. CTLA 4表达式级别显示为相对于CTLA 4脾CD3表达水平+CD4+CD 25+Treg细胞(>90%Foxp 3)+)使用比较CT方法2-∆∆CT。每个点代表单个鼠标的数据,n=每子集5-9只小鼠。*p < 0.003, **p < 0.007, ***p < 0.001, ****p < 0.002. b CTLA 4用qRT-PCR法检测脾B-1a(SB-1a)和非B1a细胞在新生小鼠、幼鼠和成年小鼠中的表达.D,天,W,周,M,月份。FACS浇口如附图所示。1B. CTLA 4表达式级别显示为相对于CTLA 4成年SB-1a表达水平。n=每组5-7只小鼠,*p < 0.001, **p < 0.003, ***p < 0.006, ns, not significant (p < 0.5). c用细胞内CTLA-4流式细胞仪测定Sb-1a、腹腔B-1a(PB-1a)、FOB、MZB、腹膜B-2(PB-2)和脾Treg(STG)细胞的CTLA-4表达。FACS浇口如附图所示。1C. y轴显示B细胞亚群表面CD5的表达和sTreg细胞内Foxp 3的表达,xAXIS显示了藻红蛋白(PE)结合抗CTLA-4或同类型对照抗体染色的细胞数据.d总结独立外地资产管制系统分析的数据(n=6),每个点表示单个鼠标的数据。y轴向显示用PE结合抗CTLA-4抗体染色的B细胞亚群的中荧光强度比值(MFI)值与同工型对照抗体的比值。*p < 0.0001, **p < 0.03, ***p < 0.01, ****p < 0.05, *****p < 0.007, ns, not significant (p < 0.6). Box plots in a, b, d:方框绘制75%(上)、50%(中线)和25%(向下)四分位数,最大值和极小值分别显示为上线和底线。统计学意义采用非参数Wilcoxon单向检验。

胎儿发育过程中出现B-1a细胞。它们很容易在新生儿脾脏中检测到,而FOB和MZB细胞在这个年龄还没有产生(补充图)。1B)。通过监测从新生儿到成人的脾脏B-1a细胞,我们发现B-1aCTLA 4在个体发育早期,表达逐渐增加。因此,它是可以检测到的,虽然在很低的水平,脾B1a细胞从第5-7天新生儿,并逐渐增加,直到成年(至少2个月)(图二)。1B).

细胞内荧光激活细胞分选(Fcs)分析表明ctla-4在脾脏和腹膜B-1a细胞中均有表达,尽管其表达水平低于Foxp 3。+Treg细胞(图1.1C,d)。与CTLA 4基因表达数据显示,CTLA-4在脾B1a中的表达水平低于腹膜中CTLA-4的表达水平(图1)。1C,d)。相比之下,脾FOB、MZB和腹膜B-2细胞均未检测到CTLA-4(如图所示).1C、d)。CTLA-4在T细胞缺乏的脾脏和腹膜B-1a细胞中也容易检测到CTLA-4的表达。Tcrb−/− TCRD−/−)小鼠(图1.1C,d),排除B-1a细胞从CTLA-4-表达T细胞中获得CTLA-4的想法.

Ctla-4在人CD5中的表达已有报道。+B型慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)28,29。与上述结果相一致,我们检测到Eμ-TCL 1转基因小鼠脾细胞和腹膜B-1a细胞CTLA-4表达增加。1C,d),小鼠B-CLL模型,其中B-1a细胞发育为CLL样肿瘤。30,31,32。重要的是,尽管在Eμ-TCL 1小鼠的B-1a细胞中CTLA-4的表达增加,但在这些小鼠的FOB和腹膜B-2细胞中仍未检测到CTLA-4的表达(如图1所示)。1C,d)。这些发现表明,与CD5的表达一样,CTLA-4的表达选择性地标记了静息B细胞室中的B-1a细胞。

CTLA-4结合B7配体(CD 80和CD 86)具有较高的亲和力和亲和力。33。这些配体主要在抗原提呈细胞上表达。33。我们发现脾脏和腹膜B1a细胞都表达CD 80和CD 86(附图)。1D,E)。值得注意的是CD 80,它与ctla-4有着最强的亲和力。33,在B-1a细胞上的表达水平比在FOB、mzb和脾CD11c上的表达水平高得多。+树突状细胞(DC)(附图)1D,E)。因此,尽管B-1a细胞表达的CTLA-4水平较低,但B7配体(尤其是CD 80)的共同表达提示B-1a细胞表达的CTLA-4可能唯一地具有更大的与其配体的连接。

CTLA-4B细胞CKO小鼠体内B-1a细胞活性增强

为了研究CTLA-4对B-1a细胞的作用,我们通过产生CTLA-4 B细胞条件基因敲除(CKO)小鼠,选择性地消耗B细胞中的CTLA-4。CTLA 4fl/fl CD 19CRE/+)22,34。在这些CKO小鼠中,T细胞亚群(如Treg细胞)表达浮动。CTLA 4基因型,而B-1a细胞已经丢失CTLA 4由于CRE介导的重组(补充图。2A)。因此,CTLA-4在B-1a细胞中失去表达,但在这些动物的Treg细胞中仍保持正常(补充图)。2B、C).

溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入研究表明,CKO小鼠B1a细胞自我补给增加.CKO小鼠脾和腹腔B-1a细胞均含有更多BrdU(BrdU)+CTLA 4+/+ CD 19CRE/+)(图1.2A)。结果,CKO小鼠的B-1a室扩大了(补充图)。二维空间)。值得注意的是,在每只动物中,脾脏B-1a细胞中的BrdU含量总是高得多。+B-1a细胞比腹膜B-1a细胞。2A),支持脾是B-1a细胞自我补充的主要部位的观点。12,35,36.

图2:CKO小鼠B1a细胞的自补量增加,激活基因程序上调.

a对照组或CKO小鼠用含BrdU的水喂养6天,并加入BrdU(BrdU)。+)用流式细胞仪(FACS)测定小鼠脾脏和腹腔B-1a细胞。B-1a细胞为CD 19。+IGMIGDLO/NEGCD 21LO/NEGCD 43+CD5+。数据综述BrdU的百分比+在Sb-1a或PB1a细胞中分别进行了5个独立实验。每个点表示单个鼠标的数据。*p < 0.01, **p < 0.006, nonparametric Wilcoxon one-way test. bSB-1a、PB-1a和GC B(CD 19)+CD 95+CD 38内格)对对照组或CKO小鼠的细胞进行分类,并对其进行测序,获得其IgH转录本。每一个群体的IgH转录本包含>5个核苷酸变化的百分比和突变率,n=4-5个生物独立样本,每个样本来自一只小鼠,*p < 0.01, **p < 0.02, nonparametric Wilcoxon one-way test. c圆形可视化图显示了在对照组和CKO小鼠脾B1a细胞间差异表达基因的选择GO术语。外圆中的每个点代表一个单独的上调(红色)或下调(蓝色)基因。同一功能术语的基因被组合在一起,每一组的细节都显示在正确的表中。内圆的有色条概括了相同功能术语的基因的中间褶皱变化。d热图显示用rna-seq测量列出的基因的表达水平。每一行代表单个基因的数据。具有相同功能术语的基因被聚在一起。每一列代表单个脾IgM的数据。对照组或CKO小鼠的B-1a细胞标本。所有小鼠均在2-3个月大。方格a, b:方框绘制75%(上)、50%(中线)和25%(向下)四分位数,最大值和极小值分别显示为上线和底线。

CTLA-4缺陷B1a细胞在CKO小鼠中也上调主要组织相容性Ⅱ类(MHCⅡ)和信号淋巴细胞活化分子(SLAM)的表面表达,后者是GC B细胞中高水平表达的标记物(附图)。2E)。与这种增加的激活相一致,CKO小鼠的B-1a IgH序列在IGV中含有更高水平的体细胞高突变(Shm)。H比他们的对照对手(图一)。2B).

CKO小鼠B1a周转和活化的增加是由于CTLA-4缺乏的B-1a细胞上调表观和转录激活程序所致。Rna-seq分析表明,在10种病毒中,4检测到的转录本,130个基因在CKO小鼠的B1a细胞与对照组的B1a细胞之间存在差异表达。其中约90%的基因在CTLA-4缺乏的B1a细胞中被上调.值得注意的是,对参与染色质甲基化和乙酰化的基因来说,最显著的上调转录本是丰富的,包括Tet3催化DNA胞嘧啶脱甲基;Kmt2d, Kmt2b,和组1b催化组蛋白H3 Lys-4甲基化;EP300,EP400,Kat6a,和BRD 4,可催化组蛋白乙酰化。2C,d,补充图。2F),都是转录激活的表观遗传标记。

与这种表观遗传激活相一致的是,CTLA-4-1缺乏的B1a细胞转录激活因子、PI3K/Jak-Stat BCR信号通路和细胞周期通路被上调(图一)。2C,d)。特别是细胞周期成分Cyclin D2基因,即,CCND2,这已被证明是B-1a代所必需的。37,实质上是升高的(图二)。二维空间)。在此基础上,我们认为CTLA-4具有抑制B-1a细胞活化的功能,这种负调控是由表观和转录再编程介导的。

CTLA-4 CKO小鼠脾脏中自发产生Tfh细胞和GCs

在CKO小鼠B1a细胞活化的同时,GC反应在脾脏中自发出现。因此,IgM内格IGD内格B细胞急剧增加(图1)。3A,补充图。3A这些细胞中有60%以上表达了GC B细胞的特征,即它们增殖(Ki 67)+),关闭CD 38,上调CD 95,PNA-糖胶,GL7,Bcl 6和AID(补充图)。3B、C)。此外,很大一部分IgM内格IGD内格B细胞表达表面IgG 1,因此经历了类转换。3A)。胃癌B细胞(CD 95)的IgH序列分析+CD 38内格)证实高水平的SHM。大约40%的IgH转录本中含有5个以上的取代核苷酸。H从互补决定区2(CDR 2)到CDR 3的区域。这意味着SHM的频率为每10次25次。3碱基对(图1)2B).

图3:CKO小鼠脾脏中T依赖性GC反应和Tfh细胞自发产生.

a用流式细胞仪(FACS)对小鼠脾细胞进行分析。活髓内格CD3内格CD 19+脾B细胞门控以显示IgM内格IGD内格B细胞被进一步封闭以揭示IgG 1+细胞。bGC B细胞(CD 19)数量综述+CD 38内格CD 95+)对照组、杂合子小鼠和CKO小鼠经指示抗体处理后的脾脏。每个点代表单个鼠标的数据,n=4~6只小鼠/只。*p < 0.01, ns, not significant (p < 0.1), nonparametric Wilcoxon one-way test. c活髓内格CD 19内格CD3+CD4+用门控法检测小鼠脾T细胞PD-1、CXCR 5、ICOS和细胞内Foxp 3的表达。荧光负一(FMO)染色是用荧光抗CXCR 5抗体从染色鸡尾酒中省略的染色方法来定义CXCR 5表达细胞。右侧FACS直方图显示tfh(pd-1)细胞内bcl 6的表达。CXCR 5+,红线)和非tfh细胞(pd-1)内格CXCR 5内格,蓝线)在CKO小鼠中。dTfh细胞(CD3)数据综述+CD4+Pd-1CXCR 5+)在每一组小鼠的脾脏中,n=每组5-9只小鼠,*p < 0.001, **p < 0.003, ns, not significant (p < 0.1), All mice are 2–3 months old. Box plots in c, b:方框绘制75%(上)、50%(中线)和25%(向下)四分位数,最大值和极小值分别显示为上线和底线。

耗尽CD4 T细胞或阻断CD 40信号通路可阻止CKO小鼠GC的形成(如图所示)。3B类似于外源抗原诱导的GC反应,自发的GC反应依赖于CD4 T细胞和CD 40信号。与这一结论一致,CD4 tfh细胞(pd-1)CXCR 5+ICOS+Foxp 3内格BCL 6+),在T依赖的GC反应中起关键作用的T效应细胞。38,39,40,41,自发地出现在CKO小鼠的脾脏中(见图)。3C,d).

值得注意的是,出现在CKO小鼠脾脏中的Tfh细胞在这些小鼠的淋巴结(LN)中几乎无法检测到(补充图)。三维空间)。与脾脏相比,LN含有更少的GC B细胞(补充图)。3E)。这些结果表明,脾脏是支持CKO小鼠Tfh细胞生成和GC反应的主要淋巴器官。

Ctla-4 CKO小鼠产生自身抗体和迟发型自身免疫

CKO小鼠的GC反应可在出生后6周的脾脏中检测到,此后持续(附图)。4A)。因此,随着动物年龄的增长,类切换B细胞的数量和血清IgG和IgE水平逐渐上升(补充图)。3A、图1.4A)。重要的是,CKO小鼠血清中含有与双链DNA(DsDNA)、核抗原和类风湿因子(RF)反应的IgG和IgE自身抗体。4B,c,补充图。4B)。这些抗体随年龄增长而增加,但在年龄匹配的对照组小鼠中检测到的抗体最少(图1)。4B,c,补充图。4B).

图4:CKO小鼠血清中含有抗dsDNA、核抗原和糖基自身抗原的自身抗体。

a用ELISA法测定年龄指示的对照组和CKO小鼠血清中IgG和IgE水平。n=每组6-8只小鼠,*p < 0.03, **p < 0.001, ***p < 0.006, ****p < 0.002, ns, not significant (p < 0.2), nonparametric Wilcoxon one-way test. b采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定了年龄指示性CKO小鼠和对照组小鼠血清中抗dsDNA IgG和IgE水平。n=每组5-8只小鼠,*p < 0.05, **p < 0.03, ***p < 0.02, nonparametric Wilcoxon one-way test. c检测7~14月龄CKO和对照组小鼠血清中抗核抗原(ANA)自身抗体。n=每只小鼠8只。显示了每组四只小鼠的代表性数据。对照组小鼠0/8和CKO小鼠5/8 ANA阳性。d用碳水化合物微阵列法检测对照组和CKO小鼠血清中抗糖链IgG和IgM自身抗体。本文给出了4只对照鼠(>7月龄)血清抗-糖聚糖自身抗体IgG(上)和IgM(下)谱的重叠图。每个符号代表对单个小鼠血清中的单个糖胶抗原作出反应的IgG或IgM的数据。yx-轴:相应的甘氨酸抗原ID。寡糖甘露糖(#8-34),亚沙洛-糖聚糖(#3-6),O-糖基自身抗原(#43-44),Man1Gn2Asn(#8),Man9Gn2Asn(#24),Glc1Man9(#32),GlcNAc-RB(#36)。每种甘露聚糖抗原的信息见补充表。6。每种染色的背景微斑点(Bg)的平均值显示在每种染色的最右边。X每个图中的轴。方格a, b:方框绘制75%(上)、50%(中线)和25%(向下)四分位数,最大值和极小值分别显示为上线和底线。

此外,与正常小鼠相似,对照组小鼠的血清中很少含有IgG抗甘氨酸自身抗体(如图所示)。4D)。相反,CKO小鼠血清有自身反应性IgG与N-糖聚糖,例如,寡糖甘露聚糖、亚沙洛甘露聚糖和阿格拉克托糖聚糖,以及O-糖基核心自身抗原(图1)。4D)。这些糖基在凋亡细胞表面表达,可作为天然抗体的靶点。与此相一致的是,对照组和CKO小鼠血清都含有天然IgM,与这些自身抗原(如Man1Gn2Asn、Man9Gn2Asn、Glc1Man9和GlcNAc-Rb)反应。4D)。在本质上,虽然对照组和CKO小鼠的血清具有相似的天然IgM抗糖聚糖谱,但它们的IgG谱有所不同,因为只有CKO小鼠的血清中含有对这些糖聚糖的自身反应性IgG。

不同于完全CTLA-4缺陷(CTLA 4−/−CTLA-4Treg基因敲除小鼠,全部在较早的年龄死亡,CTLA-4B细胞CKO小鼠活得更长(超过1年),并且直到他们超过7个月大时才表现出显著的疾病,例如,一些年龄较大的CKO小鼠会出现瘙痒和其他免疫疾病(补充图1)。4C4D)。此外,一些小鼠有不同程度的皮肤和表皮内的清除和溃疡,这是一些人类自身免疫性疾病(如天疱疮科)的共同特征(补充图)。4D)。最后,其中一些小鼠在小肠(2/3)、耳朵(1/3)和肝脏(1/3)(补充图1/3)等不同器官中存在炎症浸润(中性粒细胞和/或淋巴细胞)。4E).

活化CTLA-4缺陷B1a细胞分化为APC

似IgM内格IGD内格B细胞,IgMINTIGD内格CTLA-4B细胞CKO小鼠脾脏B细胞也增加.令人惊讶的是,这两个种群都包含一个B-1a子集(CD5)。+CD 43+B 220罗氏)(图1.5A)。因此,与表达高表面IgM(IgM)的典型的B-1a细胞不同。在CKO小鼠中检测到这两个B-1a亚型表达中间体(IgM)。INT)无法检测到的表面IgM(IgM)内格)。重要的是,尽管表面IgM呈阴性,但IgM内格B-1a细胞表达胞内IgM,其表达水平明显低于分泌IgM的细胞(图1)。5A)。这表明在IgM中检测到了细胞内的IgM。内格B-1a细胞来源于内化的表面IgM,而不是分泌的细胞内IgM。

图5:IGMCKO小鼠B-1a细胞内化表面IgM,并开始表达前GC APC表型。

a活髓内格CD3内格CD 19+正常对照组和CKO小鼠脾B细胞检测IgM和IGD的表达。IGMIGDLO/NEG、IgMINTIGD内格,和IgM内格IGD内格CKO小鼠B细胞门控显示IgM、IgMINT,和IgM内格B1a细胞,基于CD5和CD 43的表达。用两种FMO染色鉴定IgM和CD5阳性细胞。左侧FACS直方图显示IgM细胞内IgM水平内格B-1a细胞(红线)和IgM分泌细胞(IGD)内格CD 138+)(灰色线)。蓝线显示IgM表面的IgM染色水平内格B-1a细胞在固定和渗出前用抗IgM抗体染色。b流式细胞术显示细胞表达分化的CD 95+CD 38罗氏GL7+CD 150+IgM表型、IgMINT,和IgM内格CKO小鼠B-1a细胞。c总结CD 95所占百分比的数据+CD 38罗氏GL7+CD 150+IgM细胞、IgMINT和IgM内格B1a细胞来自对照组和CKO小鼠。每个点代表单个鼠标的数据,n=每子集7-10只小鼠,*p < 0.001, **p < 0.002, ns, not significant (p < 0.2), nonparametric Wilcoxon one-way test. dIGMB-1a和IgM内格对CKO小鼠的B-1a细胞进行分类并测序,获得其IgH转录本。数据总结了包含>5个核苷酸变化的IgH序列的频率和每个样本的突变率。n=每组7个样本,每个样本来自单个老鼠。IgM数据B-1a和IgM内格来自同一只老鼠的B-1a细胞连接在一起。*p < 0.001, nonparametric Wilcoxon one-way test. All mice are 2 months old. Box plots in c, d:方框绘制75%(上)、50%(中线)和25%(向下)四分位数,最大值和极小值分别显示为上线和底线。

重要的是,超过15%的IgM内格B-1a细胞表达分化表型,即CD 95。+CD 38罗氏GL7+CD 150+(无花果)5B,c)。相比之下,这些分化的细胞在对照小鼠中几乎没有检测到(补充图)。5A、图1.5C)。与这种分化相吻合,CD 95+CD 38罗氏GL7+CD 150+IGM内格B-1a细胞表面表达类切换Ig(CsIG)+)和下调CD5(补充图)。5B)。引人注目的是,这种分化的表型(CD 95)+CD 38罗氏GL7+CD 150+CSIG+)也由IgM表达。内格IGD内格胸腺中的B细胞(附图)5C),胸腺B细胞,最近被报道是有效的APC,向发育中的胸腺细胞呈现自身抗原。42.

我们进一步发现大部分IgM内格IGD内格胸腺B细胞CD5+CD 43+(补充图。5D),支持以前关于许多胸腺B细胞是B-1a细胞的报道。43,44,45。我们发现CD 95+CD 38罗氏GL7+CD 150+IGM内格CKO小鼠B-1a与胸腺IgM表达相同的表型内格IGD内格胸腺中的APC--B-1a细胞提示这些分化的IgM内格CKO小鼠的B-1a细胞为APC。符合这一观点,这些细胞表达增加的表面MHCⅡ和细胞内H2-DM(补充图)。5E),一种在MHCⅡ分子抗原负载中起核心作用的伴侣46.

CD 95+CD 38罗氏GL7+PNA+CD 150+IGM内格然而,CKO小鼠脾脏中发现的B-1a细胞尚未完全分化为GC B细胞(CD 95)。+CD 38内格GL7PNACD 150+),进一步下调CD 38的表达,上调GL7和PNA(补充图)。5F)。我们称之为CD 95+CD 38罗氏GL7+PNA+CD 150+IGM内格B-1a细胞在GC形成前,即GC形成前的APCs,以区别于已完全发育的GC中的APC。然而,它们表达的胞内h2-dm及其抑制剂h2do的水平与cxcr 4相当。罗氏CD 86光区GC B细胞(附图)5G),通过将抗原呈递给GC中的T细胞进行抗原选择的APC。

相比之下,与IgM相比内格B-1a细胞,IgM相同CKO小鼠中的B-1a细胞含有较少的CD 95。+CD 38罗氏GL7+CD 150+细胞(图1.5B,c)和不表达CSIG+表面(附图)5B)。与这些发现相一致,IgH对IgM进行了测序。内格和IgM来自同一只CKO小鼠的B-1a细胞显示,在IgM中很容易检测到类切换IgG、IgA和IgE的转录本。内格B-1a曲线图,而IgM是IgM的优势Ig(>98%)。B-1a细胞(表)1)。此外,IgM内格B-1a细胞不仅表现为类转换,而且具有较高的IGV水平。HSHM比他们的IgMB-1a对应物(图1.5D).

表1 IgM表示的IgH曲线图内格

重要的是,IgM内格和IgMB-1a细胞比CD5细胞共享更多+CD 43+B 220罗氏表型在给定的CKO动物中,它们表现出广泛的IgH序列共享,也就是说,这两个序列都包含一系列相同的V(D)J序列,我们以前已经证明这些序列在C57BL/6B-1a IgH序列中是非常保守的。12。其中包括卵磷脂酰胆碱(PTC)编码的IgH 11和磷酰胆碱(PC)特异的T15独特型IgH(补充表)。1)。最重要的是,在这些原型B-1a V(D)J序列中,IgM始终是IgM中占主导地位(~99%)的同工型。B-1a,而类切换IgG、IgA和IgE在IgM中很容易检测到。内格同一CKO小鼠的B-1a细胞(补充表)2)。其中一些从IgM中调出的Ig转录本内格B-1a细胞已经显示出SHM(补充图)。5H).

加在一起,我们得出结论内格B-1a细胞。在本质上,CKO小鼠活化的CTLA-4-缺陷B-1a细胞经过进一步的分化,即它们内化表面IgM,并开始表达前gc抗原(CD 95)的表型。+CD 38罗氏GL7+PNA+CD 150+CSIG+).

IGM内格CKO小鼠B-1a细胞表达APC基因的研究

随着表面bcr的内化和APCs的表型变化,IgM内格CKO小鼠B-1a细胞下调转录激活程序,但同时启动基因程序,这表明它们的功能从促进增殖的转录激活转向抗原的加工和呈递。Rna-seq分析表明,~1400个基因在IgM之间有差异表达。B-1a和IgM内格CKO小鼠B-1a细胞。其中约60%的差异表达基因在IgM中被下调。内格B-1a细胞与IgM的比较B-1a细胞,包括参与表观遗传和转录激活、细胞周期进展和bcr信号传递的基因(补充图)。6)。因此,与CKOIgM形成鲜明对比。B-1a细胞,上调表观遗传重组和转录激活程序。2C,d),IgM内格CKO小鼠的B-1a细胞可以关闭这些程序。6A).

内格在CKO小鼠中,B-1a表达高度协调的基因程序,表明向APC的功能转移。

a热图显示rna-seq测量所选基因的表达水平。行层标准化是为了可视化目的而进行的。每一行代表单个基因的数据。相同功能术语的基因被聚在一起。每一列代表每个指示的B-1a样本的数据。b圆形可视化图显示了从对照组和CKO小鼠的SB-1a差异表达基因选择的GO术语。外圆中的每一个点代表一个单独的上调基因。同一功能术语的基因被组合在一起,每一组的细节都显示在正确的表中。在内部圈中,彩色条形图概括了具有相同功能术语的基因的中位折叠变化。

然而,与此同时,这些IgM内格CKO小鼠的B-1a细胞启动与抗原处理和呈递相关的基因程序。因此,与抗原转运和加工相关的基因在IgM中被上调。内格B-1a细胞,如参与泛素和蛋白酶降解的细胞,内质网中的蛋白质折叠,以及早期内胚体、溶酶体和高尔基体内由囊泡介导的转运(图)。6a,b)。因此,通过mhc途径表达抗原的基因在IgM中也被上调。内格B-1a细胞,包括H2-DM的基因,这是从MHC II中去除剪接肽的关键因素,它允许携带抗原肽(如图所示)。6a,b).

综合上述研究结果,我们得出结论:内格CKO小鼠B-1a细胞表达高度协调的基因程序,作为转录激活的前体IgM起作用。

CKO小鼠B-1a细胞诱导野生型受体Tfh细胞和GCs的研究

与FOB和MZB细胞不同,b1a细胞是由bm中的淋巴祖细胞产生的。3,5,6。为了追踪野生型受体CTLA-4缺陷B1a细胞的长期功能,我们采用IgH异基因嵌合体的方法。这种方法是基于B-1a和传统B细胞独特的发育特性来产生B-细胞嵌合动物的。15,47,48。此外,与通常使用的以辐照成年动物为受体的转移系统不同,我们将B-1a细胞转移到未辐照的异基因异基因新生小鼠体内。这种方法允许转移的B-1a细胞在正常的宿主环境中通过个体发育发育,在个体发育过程中最接近于B1a细胞的产生。

为了做到这一点,我们通过治疗1天生的CB.17新生儿来消耗受体B细胞(IgH)。b)抗-IgMb单克隆抗体。在第2天,我们从成年同种异体BALB/c小鼠(IgH)中重建接受B-1a细胞处理的CB.17新生受者。a)。抗IgMb抗体治疗持续6周,受体休息2~3个月,形成B细胞嵌合体,宿主常规B细胞(IgH)。b)由内源性bm产生,而B-1a细胞(Igh)生成。a)由转移的、异型标记的、自补的B-1a(补充图)重组而成.7A)15,47,48。用此方法,我们从CKO小鼠中转移ctla-4缺乏的腹膜B-1a细胞(Igh)。a)进入B细胞缺乏同系物2日龄CB.17新生儿(IgH)。b)。作为对照组,我们从ctla-4杂合子小鼠(Igh)移植了同样数量的ctla-4表达的腹膜B-1a细胞的CB.17新生儿。a).

当受体变成嵌合成体后,我们发现两者都是CD4 Tfh(PD1)。ICOS+GL7+CXCR 5+BCL 6+)和胃癌B细胞(CD 95)+CD 38内格GL7+)在用CTLA-4缺乏的腹膜B-1a细胞重组的受体的脾脏中被诱导(如图所示)。7a,b,补充图。7b)。相反,Tfh细胞和GC B细胞在CTLA-4表达的腹膜B1a细胞重组后均未被诱导(如图所示)。7a,b),即使像CTLA-4缺乏的腹膜B-1a细胞一样,这些细胞也能有效地重建受体脾脏和Perc中的B-1a群体(补充图1)。7C)。实质上,Tfh细胞和GCs的诱导只有在受体接受不表达CTLA-4的B-1a细胞时才能进行。

图7:CTLA-4缺陷B1a细胞及其IgM内格在同种异体受体中,死者可诱导Tfh细胞和GCs。

a活CD4++用门控门控法检测小鼠脾脏B细胞表达pd-1的tfh(pd-1)。ICOS+)和GC B(CD 95)CD 38内格)细胞。b总结了小鼠脾脏中Tfh和GC B细胞的数量。n=每组7~10只小鼠。每个点表示单个鼠标的数据,*p < 0.003, **p < 0.0002, ***p < 0.002, ****p < 0.0003, *****p < 0.004, ns, not significant (p < 0.2), nonparametric Wilcoxon one-way test. About 5 × 106B-1a(PB-1a)和2×105IgM内格转染脾B-1a(SB-1a)细胞。cTCRβCDR 3树状图(上)展示了非Tfh T和Tfh细胞表达的CDR 3核苷酸序列。从四个或六个独立的T细胞样本中显示了一个有代表性的图.给定树状图中的每个矩形表示唯一的CDR 3核苷酸序列,每个矩形的大小表示单个CDR 3序列的相对频率。盒图总结了D50度规分析,该分析量化TCR,β,CDR 3核苷酸序列多样性,每个T细胞样本来自指示的小鼠组。每个点代表来自单个鼠标的T细胞样本的数据,n=每组4-6个T细胞样本,*p < 0.006, ns, not significant (p < 0.2), nonparametric Wilcoxon one-way test. Low D50 values are associated with less TCRβ CDR3 diversity. Sequence information for each T-cell sample is summarized in supplementary Table 3. d活髓内格CD3内格CD 19+以CB.17小鼠脾脏B细胞为研究对象,观察胃癌B细胞(CD 19)的表达。+CD 95+GL7+),进一步显示IgG 1、IgG1b和IgG1a的表面表达。五个独立实验的统计摘要见补充表5。方格b, c:方框绘制75%(上)、50%(中线)和25%(向下)四分位数,最大值和极小值分别显示为上线和底线。

7C,补充表3),部分原因是Tfh序列优先使用TCR Vβ5、Vβ13和Vβ31基因(补充图)。7D)。此外,对于这些Vβ基因,某些编码特定CDR 3肽的Vβ-Dβ-Jβ重组序列被CKO和嵌合小鼠的tfh序列所共有(补充表)。4)。我们的研究发现,在嵌合受体中诱导的Tfh细胞表达的TCRβ序列与Tfh细胞在CKO小鼠中的表达相似,这一发现强烈地表明,与CTLA-4缺陷B1a重组的嵌合小鼠所诱导的Tfh细胞一样,在CKO小鼠中自发产生的Tfh细胞也是由CTLA-4缺陷B1a细胞诱导的。

腹膜IgMB-1a细胞,脾IgMCKO小鼠的B-1a在转至CB.17受体后也能诱导Tfh细胞和GC反应(补充图)。7E)。如上文所示,这些ctla-4缺乏IgM。B-1a细胞内化表面IgM及其分化IgM内格B-1a不仅表达APC表型,而且还表达APC功能的基因程序。这些分化的IgM内格B-1a细胞可能是诱导Tfh细胞分化的APC。支持这个想法,我们发现转移只有105IGM内格CKO小鼠的B-1a细胞能有效地诱导受体脾脏中的Tfh细胞和GC的形成(图1)。7b,补充图。7F).

此外,在与CTLA-4缺陷B1a细胞重组的受体的脾脏中,约40%的GC B细胞表达表面IgG 1(如图1所示)。7D,补充表5)。使用单倍型小鼠IgG 1的单克隆抗体,但不与IgHb单倍型发生反应。49,我们进一步证明了这些gg1表达的gcb细胞表达供体。a-单倍型(IgG1a),表明其来源于转移的CTLA-4缺陷B1a细胞(IgH)。a),而不是来自CB.17受体的内源性B细胞(IgH)。b)(图1.7D)。因此,CTLA-4-1缺乏的B1a细胞不仅诱导GC反应,而且直接引起受体中的GC B细胞。

重组CTLA-4缺陷B1a细胞与FDC的关系

B-1a细胞发育发生在胎儿和新生儿早期,此后基本停止。13,50。虽然B-1a细胞最早出现在脾脏,但在成年脾脏中仅占脾脏B细胞的一小部分。51。它们的数量较少,缺乏唯一的标记物,因此很难确定它们在正常脾脏中的位置。然而,通过使用vh 11敲入转基因小鼠,Hardy和Hayakawa小组发现B-1a细胞集中于脾脏卵泡,在个体发育过程中与滤泡树突状细胞(Fdc)一起扩展。51.

我们的研究结果证实并扩展了这些发现。因此,当ctla-4缺陷IgMa转移到非辐照受体并在其中重组时,ctla-4缺乏IgMa。+B-1a细胞位于比宿主IGD更集中的位置。卵泡中的fob细胞,它们与FDC网络密切相关(如图所示)。8,补充图。8A)。与正常脾脏一样,Hardy组在VH 11基因敲除小鼠脾脏中未见GC形成。相反,我们发现当用CTLA-4缺陷的B-1a细胞重组时,GCs是在受体的脾脏中形成的(如图所示)。8)。此外,一些捐献者伊格马+B-1a细胞与GC重叠,与Tfh细胞相互作用。8,补充图。8B、C).

图8:CTLA-4-1缺乏的B1a细胞定位于移植物脾脏中与FDC密切相关.

用免疫荧光共聚焦显微镜对CTLA-4B细胞CKO小鼠腹腔B1a细胞进行免疫荧光共聚焦显微镜观察。有代表性的免疫荧光图像显示在上面,二色或三色复合材料的图像显示在底部,用所指示的个别试剂染色的切片。

讨论

CD5+B-1a细胞被认为是进化本原B细胞。这些B细胞在胎儿发育过程中出现,为自身反应性免疫球蛋白表达丰富的功能,在免疫系统中发挥重要和非多余的作用。1,2,3,12,17,18,52,53,54。我们在此报道CTLA-4,一种关键的T细胞调节因子,也由B-1a细胞表达,并负调控这些细胞的功能。我们进一步证明,这种调节对于维持免疫稳态是必不可少的。本质上,我们的发现揭示了CTLA-4免疫功能作为这一独特B细胞亚群的调节因子的一个新方面,并将其作为一种重要的免疫调节机制加以介绍。

B-1a细胞产生有用的自身反应天然抗体55,56。正如我们前面所展示的,这个功能是由他们独特的Ig库所启用的,这些Ig是在个体发育过程中由自身抗原选择的。12。然而,曲线图的定义机制必须防止bcr介导的自身抗原表达和高亲和力抗体产生的GC形成.我们的研究发现CTLA-4是这一控制过程中的一个重要参与者.

我们发现B-1细胞在静息B细胞室内选择性表达CTLA-4.通过在CKO小鼠中特异性地从B细胞中删除CTLA-4,我们证明CTLA-4缺乏的B-1a细胞功能失调.也就是说,它们上调表观遗传和转录程序,显示出更多的自我补充,并表达更多的激活标记物,如mhcⅡ。此外,这些激活的细胞将表面IgM内化并分化为APC。最重要的是,这些激活的B-1a细胞及其分化的APC细胞在移入异基因异基因受体并在同种异体受体中重组时,能够诱导受体脾脏中的Tfh细胞和GCs。

B-1a细胞来源于胎儿的发育,在脾脏中的出现早于FOB和mzb,在它们停止发育后进行选择和自我补充。12。通过对新生儿和成人脾脏B-1a细胞的监测,我们发现B-1aCTLA 4表达逐渐增加。这种模式让人想起在个体发育早期,B-1a IgH序列中重复出现的V(D)J序列逐渐增多。12在B1a细胞中诱导CTLA-4表达是否是B1a细胞在正常发育或肿瘤转化过程中选择的结果。与这一观点相一致,我们发现转化的B-1a细胞在Eμ-tcl 1转基因小鼠中ctla-4表达增强,其中B-1a细胞发育为cll样肿瘤。30,31,32.

自然发生的Treg细胞构成性地表达高水平的CTLA-4,而其他T细胞在激活后诱导CTLA-4。CTLA-4作为一种关键的辅助抑制剂,在负调控T细胞功能方面显示出极强的作用.两者都有CTLA-4缺陷(CTLA 4−/−)和ctla-4 Treg基因敲除小鼠早期发展致命的自身免疫,即,CTLA 4−/−老鼠在3-4周龄时死亡。26,27,而ctla-4 Treg基因敲除小鼠则不活跃~7周。22。与T细胞CTLA-4缺乏小鼠不同,CTLA-4B细胞CKO小鼠存活1年以上,不发生大量淋巴增殖和多器官组织破坏.相反,它们产生自发的GC反应,主要发生在脾脏,随着动物年龄的增长,自身抗体的产生也随之增加。在以后的生命中(超过7个月),这些老鼠中有一些表现出自身免疫病理。CTLA-4 T细胞与B细胞缺乏症的巨大差异强调了这些免疫细胞在免疫系统中所起的独特作用。

未经操纵的CTLA-4B细胞CKO小鼠产生的GC反应依赖于CD4 T细胞和CD 40信号,类似于外源抗原诱导的GC反应。一直以来,tfh细胞在gc反应的发展中起着至关重要的作用。39,57,在CKO小鼠中自发出现。在外源抗原诱导的GC反应中,DC等APC通常捕获抗原并呈现给幼稚的CD4 T细胞。这个最初的接触指示幼稚的T细胞分化为tfh细胞。39。未将外源抗原导入CKO小鼠。始终如一地,我们发现CKO小鼠的脾DC室仍然不活跃。我们的研究表明,与外源抗原诱导的GC反应不同,CKO小鼠的Tfh细胞是由活化的B-1a细胞诱导的,其诱导作用很可能是由分化的APC介导的。

我们发现CKO小鼠B1a细胞上调表观遗传和转录激活程序,激活的B1a细胞进一步分化为APC。它们内化了表面的IgM,以及由此产生的IgM。内格B1a细胞开始表达APC表型(CD 95)+CD 38罗氏GL7+PNA+CD 150+CSIG+)。引人注目的是,这个表型也是由IgM表达的。内格IGD内格胸腺B细胞,我们在这里展示了B-1a的表型,并且已经有报道说它是向胸腺中发育的T细胞呈现自身抗原的APC。42。这些区分IgM的想法内格B-1a细胞是APC进一步支持的发现,他们上调MHCⅡ和表达类似水平的H2-DM和H2-DO,这是MHC II处理和呈现的关键参与者,即广为人知的GC中的APC,即光区GC B细胞。此外,不仅表达APC表型,RNA-seq分析表明,它们也表达了APC功能的基因程序。

值得注意的是CD 95+CD 38罗氏GL7+PNA+CD 150+CSIG+IGM内格B-1a细胞是GC形成前的APC。虽然它们有一些gc B细胞表型(CD 95)+CD 38内格GL7PNACD 150+CSIG+)它们尚未完全分化为GC B细胞,后者进一步下调CD 38,上调GL7和PNA。我们称这些细胞为GC前的APC,以区别于向GC中的T细胞呈现抗原的APC。从本质上说,我们鉴定了一个apc群体,它是从ctla-4缺陷IgM衍生而来的。具有内化表面IgM但尚未关闭表面CD5表达的B-1a细胞。这些APC与胸腺IgM具有相同的表型。内格IGD内格B-1a细胞,胸腺中的APC,但在发育完全的GCs中尚未分化为APC。

在BCR介导的抗原内化后,B细胞成为强有力的APC。虽然它们在非特异性的情况下向CD4 T细胞呈递抗原的能力不如DC或巨噬细胞有效,但它们的抗原提呈效率提高了10。4通过bcr识别抗原时的褶皱58。我们在IgM中检测到的细胞内IgM内格CKO小鼠的B-1a细胞不是IgM分泌细胞分泌的IgM,很可能是从表面内化的IgM(BCR)。因此,rna-seq显示内格B-1a细胞不表达PC信号,而是表达与APC功能相关的基因程序。

最重要的是,在功能分析中,我们发现当转移到正常的同种异体受体并重组时,ctla-4缺乏IgM。B-1a及其特异性IgM内格死亡可诱导受体脾脏Tfh细胞和GC反应。此外,这些细胞不仅诱导GC的形成,而且直接发展为类切换的GC B细胞。由于B-1a库是为自反应型Ig而丰富的,因此可以想象,在IgM中内化的bcr是可以想象的。内格B-1a细胞可能促进向幼稚的CD4 T细胞迁移、处理和呈现自身抗原,从而诱导其分化为Tfh细胞。

此外,我们还发现,在受体中诱导的Tfh细胞表达类似选择的TCRβ库,即在CKO小鼠中自发产生的Tfh细胞。与非Tfh T细胞序列相比,这两个序列的随机性和重复性要小得多,并与编码特定CDR 3肽的某些Vβ-Dβ-Jβ重组序列共享。我们的研究发现,不同实验环境下不同小鼠(CKO和嵌合小鼠)的Tfh细胞表达相似选择的TCRβ序列,这不仅强调了CTLA-4缺陷B1a细胞诱导Tfh细胞的共同机制,而且提示这些Tfh细胞是由一些共同的自身抗原诱导的。

这些tfh细胞是从幼稚的CD4 T细胞中衍生出来的,这就提出了这样的问题:这些自我反应的CD4 T细胞是如何产生并释放到外围的?人们普遍认为,胸腺中的自身反应性T细胞是通过负性选择而被删除的,称为中枢耐受。有趣的是,新出现的研究表明胸腺B细胞也参与了中枢耐受的诱导。43,44,45。IGM内格IGD内格特别是胸腺B细胞,最近被证明具有向胸腺细胞表达自身抗原的功能。42。我们进一步证明大部分IgM内格IGD内格胸腺B细胞表达CD5+CD 43+B-1a表型。胸腺B-1a细胞是否在T细胞库的选择中发挥作用仍是一个悬而未决的问题。

在CKO和嵌合小鼠中,脾是Tfh细胞和GC反应的主要淋巴器官。然而,我们发现CTLA-4的丢失对CKO小鼠的脾细胞和腹膜B1a细胞都有影响。两个种群的BrdU结合细胞(BrdU)的比例都有所增加。+),表示与对照相比,自补量增加了。结果表明,CKO小鼠脾细胞和腹腔B-1a细胞的百分率和数量均增加。最重要的是,当移植到正常的同种异体受体中并重新组合时,脾和腹腔IgM。CKO小鼠的B-1a细胞在受体中表现出类似的功能效应。也就是说,每个群体不仅在脾脏和受体的脾中重建B1a细胞,而且在这些小鼠的脾脏中诱导Tfh细胞和GC反应。

因此,虽然脾B1a表达的CTLA-4水平低于腹膜B1a细胞,但CKO小鼠的这两个群体功能失调,因为它们能够在正常的同种异体受体中诱导Tfh细胞和GC反应。有趣的是,ctla-4在其他小鼠的脾和腹膜B-1a细胞中也有表达。Tcrb−/− TCRD−/−Eμ-TCL1TG小鼠。脾B1a细胞与腹膜B1a细胞CTLA-4表达的差异是否反映了其明显的活化状态尚不清楚。这与B-1a细胞在脾脏中自我补充的观点是一致的。12,35,36我们体内的Brdu掺入研究表明,在CKO和对照组小鼠中,脾脏B-1a细胞中BrdU的比例都要高得多。+B-1a细胞比腹膜B-1a细胞。

1,2可以想象,B-1a自身补血是由脾脏中的自身抗原与BCR的不断接触所推动的。有趣的是,Hardy和Hayakawa等人。51据报道,PTC特异性B1a细胞位于脾滤泡中央,与FDC一起扩展。与这一关键发现相一致的是,当CTLA-4缺陷B1a细胞在受体脾脏中重组时,在卵泡中的定位比FOB细胞更集中,后者与FDC密切相关。

作为抗原库,FDC在观察原始卵泡时向原始B细胞和在GCs内竞争抗原的GC B细胞提供抗原。59。我们假设在正常静息状态下,B1a细胞受到由FDC负载的自身抗原构成的刺激。这种相互作用足以刺激B-1a细胞进行自我补充;然而,它应该受到严格控制,以避免过度激活这些细胞。B-1a细胞CTLA-4的表达可能通过调节BCR与FDC负载的自身抗原的相互作用而发挥作用。事实上,我们发现当B-1a细胞失去CTLA-4时,它们经历了转录激活因子、细胞周期和PI3K/Jak-Stat BCR信号通路的表观遗传和转录重编程,并上调了转录激活因子基因。因此,他们表现出增加自我补充和表达激活标记。

对T细胞的研究表明,CTLA-4与其配体的结合会产生一种负信号。25。CTLA-4是否通过这一细胞内禀机制来调节B-1a的功能,在本研究中仍未解决。我们发现脾脏和腹膜B1a细胞均表达CD 80和CD 86。尤其是最强的CTLA-4配体CD 80在B-1a细胞上的含量高得惊人。B-1a细胞共表达CTLA-4及其配体,特别是CD 80,提示CTLA-4-B7相互作用可能以多种方式发生,即在单个B1a细胞中发生,或可能需要CTLA-4-表达B-1a细胞与另一种表达B7-1a细胞进行双细胞相互作用。因此,虽然B-1a细胞表达较低水平的CTLA-4,但它们的CTLA-4与其配体有密切的通路,这可能与CTLA-4调节B-1a细胞活化状态有关,例如通过微调bcr信号。

综上所述,本文的研究阐明了CTLA-4在维持免疫稳态中的作用的一个新方面。正如我们所证明的那样,这一功能是通过调节B-1a细胞来实现的,B1a细胞是在胎儿发育过程中产生的一种B细胞群,它表达了一种为自我反应而丰富的Ig库。此外,我们的发现提供了与“ctla-4阻断”癌症免疫治疗相关的自身免疫不良的潜在洞见。60,61。抗CTLA-4抗体阻断T细胞CTLA-4信号转导在晚期癌症患者中的应用前景60。然而,临床研究也可能发现与此疗法相关的严重自身免疫性疾病。基本机制尚未得到充分理解。然而,由于CTLA-4可能由人B-1a细胞表达,我们的研究表明,如果人B-1a失去CTLA-4的调节,则其功能障碍可能有助于CTLA-4阻断免疫治疗的患者观察到的自身免疫功能。


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