B-1a细胞构成性表达CTLA-4
CTLA-4通常被认为是一种T细胞特异性调节因子.然而，我们在此报告CTLA 4S在成年小鼠脾脏和Perc中也有B1a细胞表达(图一)。1A)。相反，在脾FOB、MZB和腹膜B-2细胞中不能检测到。1A)。我们的发现与免疫基因组计划(ImmGen)数据库中公布的微阵列数据吻合得很好。CTLA 4B细胞祖细胞、未成熟B细胞在骨髓和脾脏中表达最少(附图)。1A)。我们进一步证明CD 138+血浆细胞(Pc)，来源于B-1a细胞和静息小鼠的秘密IgM。15，也表示CTLA 4(无花果)1A).
图1：CTLA-4在静息B细胞室内被B-1细胞选择性表达.a CTLA 4用qRT-PCR法检测成熟B细胞亚群在2~3月龄C57BL/6J小鼠中的表达。B细胞亚群通常被定义为：B-1a，CD 19。+IGM嗨IGDLO/−CD 21LO/−CD 43+CD5+；B-1b，CD 19+IGM嗨IGDLO/−CD 43+CD5内格；MZB，CD 19+IGM嗨IGDLO/−CD 21嗨CD 43内格CD5内格；FOB和腹膜B-2，CD 19+IGM罗氏IGD嗨CD 43内格CD5内格；PC，CD 19+IGD内格CD 138+CD 267+. CTLA 4表达式级别显示为相对于CTLA 4脾CD3表达水平+CD4+CD 25+Treg细胞(>90%Foxp 3)+)使用比较CT方法2-∆∆CT。每个点代表单个鼠标的数据，n=每子集5-9只小鼠。*p < 0.003, **p < 0.007, ***p < 0.001, ****p < 0.002. b CTLA 4用qRT-PCR法检测脾B-1a(SB-1a)和非B1a细胞在新生小鼠、幼鼠和成年小鼠中的表达.D，天，W，周，M，月份。FACS浇口如附图所示。1B. CTLA 4表达式级别显示为相对于CTLA 4成年SB-1a表达水平。n=每组5-7只小鼠，*p < 0.001, **p < 0.003, ***p < 0.006, ns, not significant (p < 0.5). c用细胞内CTLA-4流式细胞仪测定Sb-1a、腹腔B-1a(PB-1a)、FOB、MZB、腹膜B-2(PB-2)和脾Treg(STG)细胞的CTLA-4表达。FACS浇口如附图所示。1C. y轴显示B细胞亚群表面CD5的表达和sTreg细胞内Foxp 3的表达，xAXIS显示了藻红蛋白(PE)结合抗CTLA-4或同类型对照抗体染色的细胞数据.d总结独立外地资产管制系统分析的数据(n=6)，每个点表示单个鼠标的数据。y轴向显示用PE结合抗CTLA-4抗体染色的B细胞亚群的中荧光强度比值(MFI)值与同工型对照抗体的比值。*p < 0.0001, **p < 0.03, ***p < 0.01, ****p < 0.05, *****p < 0.007, ns, not significant (p < 0.6). Box plots in a, b, d：方框绘制75%(上)、50%(中线)和25%(向下)四分位数，最大值和极小值分别显示为上线和底线。统计学意义采用非参数Wilcoxon单向检验。
胎儿发育过程中出现B-1a细胞。它们很容易在新生儿脾脏中检测到，而FOB和MZB细胞在这个年龄还没有产生(补充图)。1B)。通过监测从新生儿到成人的脾脏B-1a细胞，我们发现B-1aCTLA 4在个体发育早期，表达逐渐增加。因此，它是可以检测到的，虽然在很低的水平，脾B1a细胞从第5-7天新生儿，并逐渐增加，直到成年(至少2个月)(图二)。1B).
细胞内荧光激活细胞分选(Fcs)分析表明ctla-4在脾脏和腹膜B-1a细胞中均有表达，尽管其表达水平低于Foxp 3。+Treg细胞(图1.1C，d)。与CTLA 4基因表达数据显示，CTLA-4在脾B1a中的表达水平低于腹膜中CTLA-4的表达水平(图1)。1C，d)。相比之下，脾FOB、MZB和腹膜B-2细胞均未检测到CTLA-4(如图所示).1C、d)。CTLA-4在T细胞缺乏的脾脏和腹膜B-1a细胞中也容易检测到CTLA-4的表达。Tcrb−/− TCRD−/−)小鼠(图1.1C，d)，排除B-1a细胞从CTLA-4-表达T细胞中获得CTLA-4的想法.
Ctla-4在人CD5中的表达已有报道。+B型慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)28,29。与上述结果相一致，我们检测到Eμ-TCL 1转基因小鼠脾细胞和腹膜B-1a细胞CTLA-4表达增加。1C，d)，小鼠B-CLL模型，其中B-1a细胞发育为CLL样肿瘤。30,31,32。重要的是，尽管在Eμ-TCL 1小鼠的B-1a细胞中CTLA-4的表达增加，但在这些小鼠的FOB和腹膜B-2细胞中仍未检测到CTLA-4的表达(如图1所示)。1C，d)。这些发现表明，与CD5的表达一样，CTLA-4的表达选择性地标记了静息B细胞室中的B-1a细胞。
CTLA-4结合B7配体(CD 80和CD 86)具有较高的亲和力和亲和力。33。这些配体主要在抗原提呈细胞上表达。33。我们发现脾脏和腹膜B1a细胞都表达CD 80和CD 86(附图)。1D，E)。值得注意的是CD 80，它与ctla-4有着最强的亲和力。33，在B-1a细胞上的表达水平比在FOB、mzb和脾CD11c上的表达水平高得多。+树突状细胞(DC)(附图)1D，E)。因此，尽管B-1a细胞表达的CTLA-4水平较低，但B7配体(尤其是CD 80)的共同表达提示B-1a细胞表达的CTLA-4可能唯一地具有更大的与其配体的连接。
CTLA-4B细胞CKO小鼠体内B-1a细胞活性增强
为了研究CTLA-4对B-1a细胞的作用，我们通过产生CTLA-4 B细胞条件基因敲除(CKO)小鼠，选择性地消耗B细胞中的CTLA-4。CTLA 4fl/fl CD 19CRE/+)22,34。在这些CKO小鼠中，T细胞亚群(如Treg细胞)表达浮动。CTLA 4基因型，而B-1a细胞已经丢失CTLA 4由于CRE介导的重组(补充图。2A)。因此，CTLA-4在B-1a细胞中失去表达，但在这些动物的Treg细胞中仍保持正常(补充图)。2B、C).
溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入研究表明，CKO小鼠B1a细胞自我补给增加.CKO小鼠脾和腹腔B-1a细胞均含有更多BrdU(BrdU)+CTLA 4+/+ CD 19CRE/+)(图1.2A)。结果，CKO小鼠的B-1a室扩大了(补充图)。二维空间)。值得注意的是，在每只动物中，脾脏B-1a细胞中的BrdU含量总是高得多。+B-1a细胞比腹膜B-1a细胞。2A)，支持脾是B-1a细胞自我补充的主要部位的观点。12,35,36.
图2：CKO小鼠B1a细胞的自补量增加，激活基因程序上调.a对照组或CKO小鼠用含BrdU的水喂养6天，并加入BrdU(BrdU)。+)用流式细胞仪(FACS)测定小鼠脾脏和腹腔B-1a细胞。B-1a细胞为CD 19。+IGM嗨IGDLO/NEGCD 21LO/NEGCD 43+CD5+。数据综述BrdU的百分比+在Sb-1a或PB1a细胞中分别进行了5个独立实验。每个点表示单个鼠标的数据。*p < 0.01, **p < 0.006, nonparametric Wilcoxon one-way test. bSB-1a、PB-1a和GC B(CD 19)+CD 95+CD 38内格)对对照组或CKO小鼠的细胞进行分类，并对其进行测序，获得其IgH转录本。每一个群体的IgH转录本包含>5个核苷酸变化的百分比和突变率，n=4-5个生物独立样本，每个样本来自一只小鼠，*p < 0.01, **p < 0.02, nonparametric Wilcoxon one-way test. c圆形可视化图显示了在对照组和CKO小鼠脾B1a细胞间差异表达基因的选择GO术语。外圆中的每个点代表一个单独的上调(红色)或下调(蓝色)基因。同一功能术语的基因被组合在一起，每一组的细节都显示在正确的表中。内圆的有色条概括了相同功能术语的基因的中间褶皱变化。d热图显示用rna-seq测量列出的基因的表达水平。每一行代表单个基因的数据。具有相同功能术语的基因被聚在一起。每一列代表单个脾IgM的数据。嗨对照组或CKO小鼠的B-1a细胞标本。所有小鼠均在2-3个月大。方格a, b：方框绘制75%(上)、50%(中线)和25%(向下)四分位数，最大值和极小值分别显示为上线和底线。
CTLA-4缺陷B1a细胞在CKO小鼠中也上调主要组织相容性Ⅱ类(MHCⅡ)和信号淋巴细胞活化分子(SLAM)的表面表达，后者是GC B细胞中高水平表达的标记物(附图)。2E)。与这种增加的激活相一致，CKO小鼠的B-1a IgH序列在IGV中含有更高水平的体细胞高突变(Shm)。H比他们的对照对手(图一)。2B).
CKO小鼠B1a周转和活化的增加是由于CTLA-4缺乏的B-1a细胞上调表观和转录激活程序所致。Rna-seq分析表明，在10种病毒中，4检测到的转录本，130个基因在CKO小鼠的B1a细胞与对照组的B1a细胞之间存在差异表达。其中约90%的基因在CTLA-4缺乏的B1a细胞中被上调.值得注意的是，对参与染色质甲基化和乙酰化的基因来说，最显著的上调转录本是丰富的，包括Tet3催化DNA胞嘧啶脱甲基；Kmt2d, Kmt2b，和组1b催化组蛋白H3 Lys-4甲基化；EP300，EP400，Kat6a，和BRD 4，可催化组蛋白乙酰化。2C，d，补充图。2F)，都是转录激活的表观遗传标记。
与这种表观遗传激活相一致的是，CTLA-4-1缺乏的B1a细胞转录激活因子、PI3K/Jak-Stat BCR信号通路和细胞周期通路被上调(图一)。2C，d)。特别是细胞周期成分Cyclin D2基因，即，CCND2，这已被证明是B-1a代所必需的。37，实质上是升高的(图二)。二维空间)。在此基础上，我们认为CTLA-4具有抑制B-1a细胞活化的功能，这种负调控是由表观和转录再编程介导的。
CTLA-4 CKO小鼠脾脏中自发产生Tfh细胞和GCs
在CKO小鼠B1a细胞活化的同时，GC反应在脾脏中自发出现。因此，IgM内格IGD内格B细胞急剧增加(图1)。3A，补充图。3A这些细胞中有60%以上表达了GC B细胞的特征，即它们增殖(Ki 67)+)，关闭CD 38，上调CD 95，PNA-糖胶，GL7，Bcl 6和AID(补充图)。3B、C)。此外，很大一部分IgM内格IGD内格B细胞表达表面IgG 1，因此经历了类转换。3A)。胃癌B细胞(CD 95)的IgH序列分析+CD 38内格)证实高水平的SHM。大约40%的IgH转录本中含有5个以上的取代核苷酸。H从互补决定区2(CDR 2)到CDR 3的区域。这意味着SHM的频率为每10次25次。3碱基对(图1)2B).
图3：CKO小鼠脾脏中T依赖性GC反应和Tfh细胞自发产生.a用流式细胞仪(FACS)对小鼠脾细胞进行分析。活髓内格CD3内格CD 19+脾B细胞门控以显示IgM内格IGD内格B细胞被进一步封闭以揭示IgG 1+细胞。bGC B细胞(CD 19)数量综述+CD 38内格CD 95+)对照组、杂合子小鼠和CKO小鼠经指示抗体处理后的脾脏。每个点代表单个鼠标的数据，n=4~6只小鼠/只。*p < 0.01, ns, not significant (p < 0.1), nonparametric Wilcoxon one-way test. c活髓内格CD 19内格CD3+CD4+用门控法检测小鼠脾T细胞PD-1、CXCR 5、ICOS和细胞内Foxp 3的表达。荧光负一(FMO)染色是用荧光抗CXCR 5抗体从染色鸡尾酒中省略的染色方法来定义CXCR 5表达细胞。右侧FACS直方图显示tfh(pd-1)细胞内bcl 6的表达。嗨CXCR 5+，红线)和非tfh细胞(pd-1)内格CXCR 5内格，蓝线)在CKO小鼠中。dTfh细胞(CD3)数据综述+CD4+Pd-1嗨CXCR 5+)在每一组小鼠的脾脏中，n=每组5-9只小鼠，*p < 0.001, **p < 0.003, ns, not significant (p < 0.1), All mice are 2–3 months old. Box plots in c, b：方框绘制75%(上)、50%(中线)和25%(向下)四分位数，最大值和极小值分别显示为上线和底线。
耗尽CD4 T细胞或阻断CD 40信号通路可阻止CKO小鼠GC的形成(如图所示)。3B类似于外源抗原诱导的GC反应，自发的GC反应依赖于CD4 T细胞和CD 40信号。与这一结论一致，CD4 tfh细胞(pd-1)嗨CXCR 5+ICOS+Foxp 3内格BCL 6+)，在T依赖的GC反应中起关键作用的T效应细胞。38,39,40,41，自发地出现在CKO小鼠的脾脏中(见图)。3C，d).
值得注意的是，出现在CKO小鼠脾脏中的Tfh细胞在这些小鼠的淋巴结(LN)中几乎无法检测到(补充图)。三维空间)。与脾脏相比，LN含有更少的GC B细胞(补充图)。3E)。这些结果表明，脾脏是支持CKO小鼠Tfh细胞生成和GC反应的主要淋巴器官。
Ctla-4 CKO小鼠产生自身抗体和迟发型自身免疫
CKO小鼠的GC反应可在出生后6周的脾脏中检测到，此后持续(附图)。4A)。因此，随着动物年龄的增长，类切换B细胞的数量和血清IgG和IgE水平逐渐上升(补充图)。3A、图1.4A)。重要的是，CKO小鼠血清中含有与双链DNA(DsDNA)、核抗原和类风湿因子(RF)反应的IgG和IgE自身抗体。4B，c，补充图。4B)。这些抗体随年龄增长而增加，但在年龄匹配的对照组小鼠中检测到的抗体最少(图1)。4B，c，补充图。4B).
图4：CKO小鼠血清中含有抗dsDNA、核抗原和糖基自身抗原的自身抗体。a用ELISA法测定年龄指示的对照组和CKO小鼠血清中IgG和IgE水平。n=每组6-8只小鼠，*p < 0.03, **p < 0.001, ***p < 0.006, ****p < 0.002, ns, not significant (p < 0.2), nonparametric Wilcoxon one-way test. b采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定了年龄指示性CKO小鼠和对照组小鼠血清中抗dsDNA IgG和IgE水平。n=每组5-8只小鼠，*p < 0.05, **p < 0.03, ***p < 0.02, nonparametric Wilcoxon one-way test. c检测7~14月龄CKO和对照组小鼠血清中抗核抗原(ANA)自身抗体。n=每只小鼠8只。显示了每组四只小鼠的代表性数据。对照组小鼠0/8和CKO小鼠5/8 ANA阳性。d用碳水化合物微阵列法检测对照组和CKO小鼠血清中抗糖链IgG和IgM自身抗体。本文给出了4只对照鼠(>7月龄)血清抗-糖聚糖自身抗体IgG(上)和IgM(下)谱的重叠图。每个符号代表对单个小鼠血清中的单个糖胶抗原作出反应的IgG或IgM的数据。yx-轴：相应的甘氨酸抗原ID。寡糖甘露糖(#8-34)，亚沙洛-糖聚糖(#3-6)，O-糖基自身抗原(#43-44)，Man1Gn2Asn(#8)，Man9Gn2Asn(#24)，Glc1Man9(#32)，GlcNAc-RB(#36)。每种甘露聚糖抗原的信息见补充表。6。每种染色的背景微斑点(Bg)的平均值显示在每种染色的最右边。X每个图中的轴。方格a, b：方框绘制75%(上)、50%(中线)和25%(向下)四分位数，最大值和极小值分别显示为上线和底线。
此外，与正常小鼠相似，对照组小鼠的血清中很少含有IgG抗甘氨酸自身抗体(如图所示)。4D)。相反，CKO小鼠血清有自身反应性IgG与N-糖聚糖，例如，寡糖甘露聚糖、亚沙洛甘露聚糖和阿格拉克托糖聚糖，以及O-糖基核心自身抗原(图1)。4D)。这些糖基在凋亡细胞表面表达，可作为天然抗体的靶点。与此相一致的是，对照组和CKO小鼠血清都含有天然IgM，与这些自身抗原(如Man1Gn2Asn、Man9Gn2Asn、Glc1Man9和GlcNAc-Rb)反应。4D)。在本质上，虽然对照组和CKO小鼠的血清具有相似的天然IgM抗糖聚糖谱，但它们的IgG谱有所不同，因为只有CKO小鼠的血清中含有对这些糖聚糖的自身反应性IgG。
不同于完全CTLA-4缺陷(CTLA 4−/−CTLA-4Treg基因敲除小鼠，全部在较早的年龄死亡，CTLA-4B细胞CKO小鼠活得更长(超过1年)，并且直到他们超过7个月大时才表现出显著的疾病，例如，一些年龄较大的CKO小鼠会出现瘙痒和其他免疫疾病(补充图1)。4C4D)。此外，一些小鼠有不同程度的皮肤和表皮内的清除和溃疡，这是一些人类自身免疫性疾病(如天疱疮科)的共同特征(补充图)。4D)。最后，其中一些小鼠在小肠(2/3)、耳朵(1/3)和肝脏(1/3)(补充图1/3)等不同器官中存在炎症浸润(中性粒细胞和/或淋巴细胞)。4E).
活化CTLA-4缺陷B1a细胞分化为APC
似IgM内格IGD内格B细胞，IgMINTIGD内格CTLA-4B细胞CKO小鼠脾脏B细胞也增加.令人惊讶的是，这两个种群都包含一个B-1a子集(CD5)。+CD 43+B 220罗氏)(图1.5A)。因此，与表达高表面IgM(IgM)的典型的B-1a细胞不同。嗨在CKO小鼠中检测到这两个B-1a亚型表达中间体(IgM)。INT)无法检测到的表面IgM(IgM)内格)。重要的是，尽管表面IgM呈阴性，但IgM内格B-1a细胞表达胞内IgM，其表达水平明显低于分泌IgM的细胞(图1)。5A)。这表明在IgM中检测到了细胞内的IgM。内格B-1a细胞来源于内化的表面IgM，而不是分泌的细胞内IgM。
图5：IGM嗨CKO小鼠B-1a细胞内化表面IgM，并开始表达前GC APC表型。a活髓内格CD3内格CD 19+正常对照组和CKO小鼠脾B细胞检测IgM和IGD的表达。IGM嗨IGDLO/NEG、IgMINTIGD内格，和IgM内格IGD内格CKO小鼠B细胞门控显示IgM嗨、IgMINT，和IgM内格B1a细胞，基于CD5和CD 43的表达。用两种FMO染色鉴定IgM和CD5阳性细胞。左侧FACS直方图显示IgM细胞内IgM水平内格B-1a细胞(红线)和IgM分泌细胞(IGD)内格CD 138+)(灰色线)。蓝线显示IgM表面的IgM染色水平内格B-1a细胞在固定和渗出前用抗IgM抗体染色。b流式细胞术显示细胞表达分化的CD 95+CD 38罗氏GL7+CD 150+IgM表型嗨、IgMINT，和IgM内格CKO小鼠B-1a细胞。c总结CD 95所占百分比的数据+CD 38罗氏GL7+CD 150+IgM细胞嗨、IgMINT和IgM内格B1a细胞来自对照组和CKO小鼠。每个点代表单个鼠标的数据，n=每子集7-10只小鼠，*p < 0.001, **p < 0.002, ns, not significant (p < 0.2), nonparametric Wilcoxon one-way test. dIGM嗨B-1a和IgM内格对CKO小鼠的B-1a细胞进行分类并测序，获得其IgH转录本。数据总结了包含>5个核苷酸变化的IgH序列的频率和每个样本的突变率。n=每组7个样本，每个样本来自单个老鼠。IgM数据嗨B-1a和IgM内格来自同一只老鼠的B-1a细胞连接在一起。*p < 0.001, nonparametric Wilcoxon one-way test. All mice are 2 months old. Box plots in c, d：方框绘制75%(上)、50%(中线)和25%(向下)四分位数，最大值和极小值分别显示为上线和底线。
重要的是，超过15%的IgM内格B-1a细胞表达分化表型，即CD 95。+CD 38罗氏GL7+CD 150+(无花果)5B，c)。相比之下，这些分化的细胞在对照小鼠中几乎没有检测到(补充图)。5A、图1.5C)。与这种分化相吻合，CD 95+CD 38罗氏GL7+CD 150+IGM内格B-1a细胞表面表达类切换Ig(CsIG)+)和下调CD5(补充图)。5B)。引人注目的是，这种分化的表型(CD 95)+CD 38罗氏GL7+CD 150+CSIG+)也由IgM表达。内格IGD内格胸腺中的B细胞(附图)5C)，胸腺B细胞，最近被报道是有效的APC，向发育中的胸腺细胞呈现自身抗原。42.
我们进一步发现大部分IgM内格IGD内格胸腺B细胞CD5+CD 43+(补充图。5D)，支持以前关于许多胸腺B细胞是B-1a细胞的报道。43,44,45。我们发现CD 95+CD 38罗氏GL7+CD 150+IGM内格CKO小鼠B-1a与胸腺IgM表达相同的表型内格IGD内格胸腺中的APC--B-1a细胞提示这些分化的IgM内格CKO小鼠的B-1a细胞为APC。符合这一观点，这些细胞表达增加的表面MHCⅡ和细胞内H2-DM(补充图)。5E)，一种在MHCⅡ分子抗原负载中起核心作用的伴侣46.
CD 95+CD 38罗氏GL7+PNA+CD 150+IGM内格然而，CKO小鼠脾脏中发现的B-1a细胞尚未完全分化为GC B细胞(CD 95)。+CD 38内格GL7嗨PNA嗨CD 150+)，进一步下调CD 38的表达，上调GL7和PNA(补充图)。5F)。我们称之为CD 95+CD 38罗氏GL7+PNA+CD 150+IGM内格B-1a细胞在GC形成前，即GC形成前的APCs，以区别于已完全发育的GC中的APC。然而，它们表达的胞内h2-dm及其抑制剂h2do的水平与cxcr 4相当。罗氏CD 86嗨光区GC B细胞(附图)5G)，通过将抗原呈递给GC中的T细胞进行抗原选择的APC。
相比之下，与IgM相比内格B-1a细胞，IgM嗨相同CKO小鼠中的B-1a细胞含有较少的CD 95。+CD 38罗氏GL7+CD 150+细胞(图1.5B，c)和不表达CSIG+表面(附图)5B)。与这些发现相一致，IgH对IgM进行了测序。内格和IgM嗨来自同一只CKO小鼠的B-1a细胞显示，在IgM中很容易检测到类切换IgG、IgA和IgE的转录本。内格B-1a曲线图，而IgM是IgM的优势Ig(>98%)。嗨B-1a细胞(表)1)。此外，IgM内格B-1a细胞不仅表现为类转换，而且具有较高的IGV水平。HSHM比他们的IgM嗨B-1a对应物(图1.5D).
重要的是，IgM内格和IgM嗨B-1a细胞比CD5细胞共享更多+CD 43+B 220罗氏表型在给定的CKO动物中，它们表现出广泛的IgH序列共享，也就是说，这两个序列都包含一系列相同的V(D)J序列，我们以前已经证明这些序列在C57BL/6B-1a IgH序列中是非常保守的。12。其中包括卵磷脂酰胆碱(PTC)编码的IgH 11和磷酰胆碱(PC)特异的T15独特型IgH(补充表)。1)。最重要的是，在这些原型B-1a V(D)J序列中，IgM始终是IgM中占主导地位(~99%)的同工型。嗨B-1a，而类切换IgG、IgA和IgE在IgM中很容易检测到。内格同一CKO小鼠的B-1a细胞(补充表)2)。其中一些从IgM中调出的Ig转录本内格B-1a细胞已经显示出SHM(补充图)。5H).
加在一起，我们得出结论内格嗨B-1a细胞。在本质上，CKO小鼠活化的CTLA-4-缺陷B-1a细胞经过进一步的分化，即它们内化表面IgM，并开始表达前gc抗原(CD 95)的表型。+CD 38罗氏GL7+PNA+CD 150+CSIG+).
IGM内格CKO小鼠B-1a细胞表达APC基因的研究
随着表面bcr的内化和APCs的表型变化，IgM内格CKO小鼠B-1a细胞下调转录激活程序，但同时启动基因程序，这表明它们的功能从促进增殖的转录激活转向抗原的加工和呈递。Rna-seq分析表明，~1400个基因在IgM之间有差异表达。嗨B-1a和IgM内格CKO小鼠B-1a细胞。其中约60%的差异表达基因在IgM中被下调。内格B-1a细胞与IgM的比较嗨B-1a细胞，包括参与表观遗传和转录激活、细胞周期进展和bcr信号传递的基因(补充图)。6)。因此，与CKOIgM形成鲜明对比。嗨B-1a细胞，上调表观遗传重组和转录激活程序。2C，d)，IgM内格CKO小鼠的B-1a细胞可以关闭这些程序。6A).
内格在CKO小鼠中，B-1a表达高度协调的基因程序，表明向APC的功能转移。a热图显示rna-seq测量所选基因的表达水平。行层标准化是为了可视化目的而进行的。每一行代表单个基因的数据。相同功能术语的基因被聚在一起。每一列代表每个指示的B-1a样本的数据。b圆形可视化图显示了从对照组和CKO小鼠的SB-1a差异表达基因选择的GO术语。外圆中的每一个点代表一个单独的上调基因。同一功能术语的基因被组合在一起，每一组的细节都显示在正确的表中。在内部圈中，彩色条形图概括了具有相同功能术语的基因的中位折叠变化。
然而，与此同时，这些IgM内格CKO小鼠的B-1a细胞启动与抗原处理和呈递相关的基因程序。因此，与抗原转运和加工相关的基因在IgM中被上调。内格B-1a细胞，如参与泛素和蛋白酶降解的细胞，内质网中的蛋白质折叠，以及早期内胚体、溶酶体和高尔基体内由囊泡介导的转运(图)。6a，b)。因此，通过mhc途径表达抗原的基因在IgM中也被上调。内格B-1a细胞，包括H2-DM的基因，这是从MHC II中去除剪接肽的关键因素，它允许携带抗原肽(如图所示)。6a，b).
综合上述研究结果，我们得出结论：内格CKO小鼠B-1a细胞表达高度协调的基因程序，作为转录激活的前体IgM起作用。嗨
CKO小鼠B-1a细胞诱导野生型受体Tfh细胞和GCs的研究
与FOB和MZB细胞不同，b1a细胞是由bm中的淋巴祖细胞产生的。3,5,6。为了追踪野生型受体CTLA-4缺陷B1a细胞的长期功能，我们采用IgH异基因嵌合体的方法。这种方法是基于B-1a和传统B细胞独特的发育特性来产生B-细胞嵌合动物的。15,47,48。此外，与通常使用的以辐照成年动物为受体的转移系统不同，我们将B-1a细胞转移到未辐照的异基因异基因新生小鼠体内。这种方法允许转移的B-1a细胞在正常的宿主环境中通过个体发育发育，在个体发育过程中最接近于B1a细胞的产生。
为了做到这一点，我们通过治疗1天生的CB.17新生儿来消耗受体B细胞(IgH)。b)抗-IgMb单克隆抗体。在第2天，我们从成年同种异体BALB/c小鼠(IgH)中重建接受B-1a细胞处理的CB.17新生受者。a)。抗IgMb抗体治疗持续6周，受体休息2~3个月，形成B细胞嵌合体，宿主常规B细胞(IgH)。b)由内源性bm产生，而B-1a细胞(Igh)生成。a)由转移的、异型标记的、自补的B-1a(补充图)重组而成.7A)15,47,48。用此方法，我们从CKO小鼠中转移ctla-4缺乏的腹膜B-1a细胞(Igh)。a)进入B细胞缺乏同系物2日龄CB.17新生儿(IgH)。b)。作为对照组，我们从ctla-4杂合子小鼠(Igh)移植了同样数量的ctla-4表达的腹膜B-1a细胞的CB.17新生儿。a).
当受体变成嵌合成体后，我们发现两者都是CD4 Tfh(PD1)。嗨ICOS+GL7+CXCR 5+BCL 6+)和胃癌B细胞(CD 95)+CD 38内格GL7+)在用CTLA-4缺乏的腹膜B-1a细胞重组的受体的脾脏中被诱导(如图所示)。7a，b，补充图。7b)。相反，Tfh细胞和GC B细胞在CTLA-4表达的腹膜B1a细胞重组后均未被诱导(如图所示)。7a，b)，即使像CTLA-4缺乏的腹膜B-1a细胞一样，这些细胞也能有效地重建受体脾脏和Perc中的B-1a群体(补充图1)。7C)。实质上，Tfh细胞和GCs的诱导只有在受体接受不表达CTLA-4的B-1a细胞时才能进行。
图7：CTLA-4缺陷B1a细胞及其IgM内格在同种异体受体中，死者可诱导Tfh细胞和GCs。a活CD4++用门控门控法检测小鼠脾脏B细胞表达pd-1的tfh(pd-1)。嗨ICOS+)和GC B(CD 95)嗨CD 38内格)细胞。b总结了小鼠脾脏中Tfh和GC B细胞的数量。n=每组7~10只小鼠。每个点表示单个鼠标的数据，*p < 0.003, **p < 0.0002, ***p < 0.002, ****p < 0.0003, *****p < 0.004, ns, not significant (p < 0.2), nonparametric Wilcoxon one-way test. About 5 × 106B-1a(PB-1a)和2×105IgM内格转染脾B-1a(SB-1a)细胞。cTCRβCDR 3树状图(上)展示了非Tfh T和Tfh细胞表达的CDR 3核苷酸序列。从四个或六个独立的T细胞样本中显示了一个有代表性的图.给定树状图中的每个矩形表示唯一的CDR 3核苷酸序列，每个矩形的大小表示单个CDR 3序列的相对频率。盒图总结了D50度规分析，该分析量化TCR，β，CDR 3核苷酸序列多样性，每个T细胞样本来自指示的小鼠组。每个点代表来自单个鼠标的T细胞样本的数据，n=每组4-6个T细胞样本，*p < 0.006, ns, not significant (p < 0.2), nonparametric Wilcoxon one-way test. Low D50 values are associated with less TCRβ CDR3 diversity. Sequence information for each T-cell sample is summarized in supplementary Table 3. d活髓内格CD3内格CD 19+以CB.17小鼠脾脏B细胞为研究对象，观察胃癌B细胞(CD 19)的表达。+CD 95+GL7+)，进一步显示IgG 1、IgG1b和IgG1a的表面表达。五个独立实验的统计摘要见补充表5。方格b, c：方框绘制75%(上)、50%(中线)和25%(向下)四分位数，最大值和极小值分别显示为上线和底线。
7C，补充表3)，部分原因是Tfh序列优先使用TCR Vβ5、Vβ13和Vβ31基因(补充图)。7D)。此外，对于这些Vβ基因，某些编码特定CDR 3肽的Vβ-Dβ-Jβ重组序列被CKO和嵌合小鼠的tfh序列所共有(补充表)。4)。我们的研究发现，在嵌合受体中诱导的Tfh细胞表达的TCRβ序列与Tfh细胞在CKO小鼠中的表达相似，这一发现强烈地表明，与CTLA-4缺陷B1a重组的嵌合小鼠所诱导的Tfh细胞一样，在CKO小鼠中自发产生的Tfh细胞也是由CTLA-4缺陷B1a细胞诱导的。
腹膜IgM嗨B-1a细胞，脾IgM嗨CKO小鼠的B-1a在转至CB.17受体后也能诱导Tfh细胞和GC反应(补充图)。7E)。如上文所示，这些ctla-4缺乏IgM。嗨B-1a细胞内化表面IgM及其分化IgM内格B-1a不仅表达APC表型，而且还表达APC功能的基因程序。这些分化的IgM内格B-1a细胞可能是诱导Tfh细胞分化的APC。支持这个想法，我们发现转移只有105IGM内格CKO小鼠的B-1a细胞能有效地诱导受体脾脏中的Tfh细胞和GC的形成(图1)。7b，补充图。7F).
此外，在与CTLA-4缺陷B1a细胞重组的受体的脾脏中，约40%的GC B细胞表达表面IgG 1(如图1所示)。7D，补充表5)。使用单倍型小鼠IgG 1的单克隆抗体，但不与IgHb单倍型发生反应。49，我们进一步证明了这些gg1表达的gcb细胞表达供体。a-单倍型(IgG1a)，表明其来源于转移的CTLA-4缺陷B1a细胞(IgH)。a)，而不是来自CB.17受体的内源性B细胞(IgH)。b)(图1.7D)。因此，CTLA-4-1缺乏的B1a细胞不仅诱导GC反应，而且直接引起受体中的GC B细胞。
重组CTLA-4缺陷B1a细胞与FDC的关系
B-1a细胞发育发生在胎儿和新生儿早期，此后基本停止。13,50。虽然B-1a细胞最早出现在脾脏，但在成年脾脏中仅占脾脏B细胞的一小部分。51。它们的数量较少，缺乏唯一的标记物，因此很难确定它们在正常脾脏中的位置。然而，通过使用vh 11敲入转基因小鼠，Hardy和Hayakawa小组发现B-1a细胞集中于脾脏卵泡，在个体发育过程中与滤泡树突状细胞(Fdc)一起扩展。51.
我们的研究结果证实并扩展了这些发现。因此，当ctla-4缺陷IgMa转移到非辐照受体并在其中重组时，ctla-4缺乏IgMa。+B-1a细胞位于比宿主IGD更集中的位置。嗨卵泡中的fob细胞，它们与FDC网络密切相关(如图所示)。8，补充图。8A)。与正常脾脏一样，Hardy组在VH 11基因敲除小鼠脾脏中未见GC形成。相反，我们发现当用CTLA-4缺陷的B-1a细胞重组时，GCs是在受体的脾脏中形成的(如图所示)。8)。此外，一些捐献者伊格马+B-1a细胞与GC重叠，与Tfh细胞相互作用。8，补充图。8B、C).
图8：CTLA-4-1缺乏的B1a细胞定位于移植物脾脏中与FDC密切相关.用免疫荧光共聚焦显微镜对CTLA-4B细胞CKO小鼠腹腔B1a细胞进行免疫荧光共聚焦显微镜观察。有代表性的免疫荧光图像显示在上面，二色或三色复合材料的图像显示在底部，用所指示的个别试剂染色的切片。
