调节性B细胞抑制IL-23介导的银屑病样炎症

银屑病是一种由T细胞依赖性免疫反应介导的炎症性皮肤病，但B细胞也发挥重要作用。调节性B细胞(Bregs)通过白细胞介素-10(IL-10)的产生负调节免疫应答.本研究旨在探讨Bregs在IL-23介导的小鼠银屑病样炎症中的作用.B细胞特异性磷酸酶和张力素同系物(PTEN)缺乏小鼠，Bregs明显扩张，对照组每隔16d，每隔一天皮下注射含0.5μg rmIL-23的20μL磷酸缓冲液生理盐水，诱发银屑病样炎症。IL-23介导的银屑病样炎症在B细胞特异性PTEN缺乏的小鼠体内受到抑制，第15天耳朵厚度和表皮厚度减少。此外，B1 B细胞过继转移可抑制IL-23介导的银屑病样炎症。RmIL-23注射的B细胞特异性PTEN缺陷小鼠脾脏和引流淋巴结中的调节性T细胞(Tregs)随着Bregs的增加而增加。此外，B细胞特异性PTEN缺陷小鼠rmIL-23耳蜗中T助手(Th)17的分化受到抑制.总之，这些结果表明Bregs的增加通过Treg的扩张和抑制Th17的分化来抑制IL-23介导的银屑病样炎症。因此，针对Bregs治疗银屑病是一种可行的治疗策略。

银屑病是一种慢性的、免疫介导的、炎症性皮肤病，可引起红斑、清晰的椭圆形斑块和附着的银色鳞片.它影响到大约2%的普通人口。1。由于银屑病的皮肤状况，对患者的生活质量有负面影响。2。根据组织学表现，如角化过度和棘皮病，银屑病以前被认为是一种异常的角质形成细胞增殖和分化的疾病。然而，T细胞的抑制因子环孢霉素治疗成功，表明银屑病是一种T细胞介导的自身免疫性疾病。3。虽然其发病机制尚不清楚，但最近的研究表明白细胞介素(IL)-23/T助手(Th)17信号通路在银屑病的发展中起着关键作用。4。活化抗原提呈细胞(APC)(包括树突状细胞(DC))产生的IL-23能刺激和促进Th17细胞的分化。Th17细胞产生IL-17A和IL-22，它们是银屑病发病过程中的主要细胞因子。针对多种免疫相关细胞因子的生物制品在其发病机制的基础上，极大地改善了银屑病的治疗。然而，T细胞在银屑病发病机制中的作用一直受到关注。相比之下，利妥昔单抗(Rituximab)是一种B细胞消耗型单克隆抗体(MAb)，据报道可诱发人银屑病样皮肤病。5,6。这一发现表明，B细胞在银屑病的发展中具有负性调节作用，尽管其表现为T细胞介导的自身免疫紊乱。

B细胞是体液免疫反应的核心，产生抗抗原抗体。B细胞还具有免疫稳态所必需的多种功能，如抗原呈递、T细胞活化和细胞因子生成等。7。众所周知，B细胞对免疫反应有积极的调节作用，也有负的调节作用。产生IL-10的调节性B细胞(Bregs)是免疫应答的负调节因子。8,9,10,11。Bregs的缺失或缺失加重了实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)等几种小鼠模型的疾病症状。12,13、慢性结肠炎14胶原诱导性关节炎(CIA)15，接触性超敏反应(CHS)16,17红斑狼疮18,19硬皮病20，以及过敏21。此外，Bregs在人类各种自身免疫性疾病中也发挥着重要作用。22,23。由于其在酿酒抑制中的重要作用，IL-10的产生是Bregs的主要鉴定标志。24。最近的一项研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt通路是B细胞抗原受体(Bcr)信号的重要下游效应，促进B细胞产生IL-10。25。磷酸酶和张力素同源酶(PTEN)的缺失，是Akt活性的抑制剂，导致Akt的过度激活，促进IL-10的产生。我们先前证实了PTEN在B细胞中的特异性失活，使用CRE-氧氟沙星系统会导致Breg的膨胀.B细胞特异性PTEN缺陷小鼠外周血、脾脏和腹膜中Bregs显著增加(Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星(老鼠)25。已在小鼠中描述了多个Breg亚群体。据报道，小鼠脾Bregs存在于CD1d中。嗨CD5+边缘区(MZ)B细胞亚群17。然而，另一项研究表明，小鼠脾Bregs存在于mz内以及B细胞特异性pten缺陷小鼠的B1 B细胞亚群中。25.

Bregs在银屑病中的作用尚不清楚。然而，最近发现了磷酸二酯酶-4(PDE 4)抑制剂阿普拉司特(Apremilast)通过Breg扩张对银屑病的治疗作用。26。因此，阐明Bregs在银屑病中的作用有助于其治疗的发展。因此，在本研究中，我们评估了Bregs在IL-23介导的B细胞特异性PTEN缺乏小鼠银屑病模型中的作用。

IL-23介导的银屑病样炎症在B细胞特异性PTEN缺陷小鼠中的作用

我们治疗野生型小鼠，Cd19Cre+/−老鼠和Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星将20μL PBS/0.1%牛血清白蛋白加或不加0.5μg rmIL-2 3皮内注射于小鼠右耳内，隔日1次，共16天。WT小鼠和Cd19Cre+/−老鼠与对照组在Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠，其中Bregs显著增加。注射rmIL-23耳的组织病理学观察显示，rmIL-23可引起角化过度、角化旁、棘突和单个核细胞浸润。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星与WT小鼠相比，小鼠有明显的角化病和棘皮病。Cd19Cre+/−老鼠(图1.1a)。与PBS对照组相比，rmIL-23注射液可显著增加耳廓厚度和表皮厚度(P<0.01)。P < 0.05, P < 0.01 and P < 0.001; Fig. 1b)。第15天耳朵厚度更大Cd19Cre+/−小鼠相比较Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠(P < 0.05; Fig. 1b)。第15天的表皮厚度在WT小鼠中也更大。Cd19Cre+/−小鼠相比较Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠(P < 0.05 and P < 0.001; Fig. 1b)。这些发现表明IL-23介导的银屑病样炎症在Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠与对照组小鼠比较。

B细胞特异性PTEN缺陷小鼠rmIL-23细胞浸润减少

免疫组织化学(IHC)染色显示rmIL-23耳细胞浸润CD4减少。+T细胞与F4/80+巨噬细胞Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠与Cd19Cre+/−老鼠(P < 0.05; Fig. 2A，D)。CD8数+T细胞在两组间无显着性差异(图二)。2b)。注射rmIL-23的耳朵中有少量B细胞。Cd19Cre+/−和Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠，但在这些组之间没有显着性差异(图)。2c)。因此，Bregs的增加似乎抑制了CD4。+T细胞和F4/80细胞+巨噬细胞在rmIL-23注射耳中的浸润。

RmIL-23注射可增加CD4的数量。+B细胞特异性PTEN缺陷小鼠脾脏T细胞和引流淋巴结T细胞及引流淋巴结B细胞

测定rmIL-23注射液是否影响CD4的组成。+T细胞，CD8+T细胞，B细胞，从脾中提取单细胞悬液，引流淋巴结。Cd19Cre+/−和Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠注射前分别于注射前第0天和第15天进行流式细胞术分析。RmIL-23注射可显著增加CD4细胞的数量。+两组脾脏T细胞(P < 0.05; Fig. 3a)。RmIL-23注射显著增加CD8细胞数。+脾T细胞和B细胞Cd19Cre+/−老鼠(P < 0.01; Fig. 3(A)鉴于CD8的增加+RmIL-23-注射T细胞和B细胞Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠无显着性差异。RmIL-23注射可显著增加CD4细胞的数量。+引流淋巴结中的T细胞和B细胞Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠(P < 0.05 and P < 0.01; Fig. 3b)。放液淋巴结注射rmIL-23前B细胞数减少。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠与Cd19Cre+/−老鼠(P < 0.05; Fig. 3b)。因此，rmIL-23注射增加了CD4的数量。+两组脾脏T细胞，CD8+脾T细胞和B细胞Cd19Cre+/−小鼠和CD4+引流淋巴结中的T细胞和B细胞Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠。

RmIL-23注射的B细胞特异性PTEN缺陷小鼠脾脏和引流淋巴结中的Tregs和Bregs增加。

我们接着分析了Bregs和Tregs在脾脏和引流淋巴结的频率。Cd19Cre+/−和Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠于第0、7、15天进行流式细胞术分析。脾脏中产生IL-10的B细胞频率明显增加。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠与Cd19Cre+/−小鼠在IL-23介导的银屑病样炎症过程中(P < 0.05 and P < 0.001; Fig. 4a)。第7天，rmIL-23注射组脾内产生IL-10的B细胞数显著增加，而产生IL-10的B细胞数在第7天显著增加。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠与Cd19Cre+/−老鼠在第7天和第15天(P < 0.01 and P < 0.001; Fig. 4a)。在脾脏中，CD 25的频率嗨Foxp 3+CD4+Tregs显著增加Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠与Cd19Cre+/−第0天和第15天的老鼠(P < 0.05 and P < 0.01; Fig. 4b)。CD 25的数目嗨Foxp 3+CD4+脾内Tregs显著升高。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠与Cd19Cre+/−小鼠在白介素-23介导的银屑病样炎症过程中，在疾病进展过程中相对于Bregs逐渐增加。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠(P < 0.05 and P < 0.01; Fig. 4b)。在引流淋巴结中，白细胞介素10产生B细胞的频率显著增加。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠与Cd19Cre+/−第0天和第15天的老鼠(P < 0.05 and P < 0.01; Fig. 4c)。RmIL-23注射显著增加引流淋巴结中产生IL-10的B细胞的数量。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠(P < 0.05; Fig. 4c)。RmIL-23注射可显著提高CD 25的表达频率。嗨Foxp 3+CD4+疾病进展过程中引流淋巴结的TregsCd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠(P < 0.05 and P < 0.01; Fig. 4d)。CD 25频率嗨Foxp 3+CD4+引流淋巴结中的Tregs也显著增加。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠与Cd19Cre+/−老鼠在第15天(P < 0.01; Fig. 4d)。RmIL-23注射显著增加CD 25的数量。嗨Foxp 3+CD4+两组第7天引流淋巴结的Tregs(P < 0.05; Fig. 4d)。因此，我们的数据表明，在rmIL-23注射的B细胞特异性PTEN缺乏小鼠脾脏中Bregs明显膨胀，在第7天显著扩张，在第15天出现收缩，同时保持较高水平。在另一只手上，rmIL-23注射的B细胞特异性PTEN缺陷小鼠脾脏和引流淋巴结中的Tregs明显膨胀，在IL-23介导的银屑病样炎症晚期随Bregs的增加逐渐增加。

B细胞特异性PTEN缺陷小鼠rmIL-23的Th17分化受抑制

IL-23刺激的Th17细胞通过IL-17A和IL-22的产生在银屑病的发生发展中起核心作用。据报道，IL-17A是产生IL-23介导的银屑病样炎症所必需的。27。评估Bregs增加是否抑制Th17细胞分化，CD4的组成+T细胞，CD8+T细胞、B细胞、Tregs和产生CD4的IL-17A+流式细胞术检测rmIL-23耳内T细胞的表达.CD4数+注射rmIL-23的耳中T细胞和B细胞明显减少。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠与Cd19Cre+/−老鼠(图1.5a)。CD 25频率嗨Foxp 3+CD4+RmIL-23注射耳的Tregs在两组间无显着性差异(图二)。5b)。IL-17A产生CD4的频率+注射rmIL-23的耳中T细胞明显减少。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星与Cd19Cre+/−老鼠(图1.5c)。在IL-23介导的银屑病样炎症过程中，耳内未见Breg浸润.我们的数据表明，脾脏和引流淋巴结中Bregs的增加抑制了rmIL-23注射的耳朵中Th17细胞的分化。

B1 B细胞过继转移抑制IL-23介导的银屑病样炎症

接下来，我们通过过继转移实验来评估Bregs是否能抑制IL-23介导的银屑病样炎症。小鼠脾Bregs主要存在于B1 B细胞亚群中Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠25。因此，脾脏B细胞Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星分离小鼠，检测CD1d、CD5和CD 19的表达，并将其分为3组，CD1d。INTCD5+B1 B细胞，CD1d嗨CD5+MZB细胞和CD1dINTCD5-卵泡B细胞。用脂多糖(LPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMA)、放线菌素(Iomycin)和布列菲林-A(brefeldin-A)对B1 B细胞和滤泡B细胞体外刺激5h，结果显示B1 B细胞占IL-10的60%以上。+B细胞，而滤泡B细胞只占IL-10的1%以下。+B细胞(图1.6a)。其次，在rmIL-23注射前，将分离的B1 B细胞、滤泡B细胞和PBS对照组过继转移到WT小鼠体内。滤泡B细胞过继转移和PBS对照对IL-23诱导的角化、角化旁和棘皮病无影响，而B1 B细胞过继转移则可减轻IL-23介导的银屑病样炎症。6b)。与卵泡B细胞过继转移和PBS对照相比，B1 B细胞过继转移15天后，耳厚度和表皮厚度显著降低(P<0.0 5)。P < 0.05, P < 0.01 and P < 0.001; Fig. 6c)。因此，B1 B细胞过继转移直接影响了IL-23介导的银屑病样炎症的抑制.此外，我们还评估了Bregs如何通过阻断抗IL-10受体的mAb来抑制IL-23介导的银屑病样炎症。阻断IL-10受体功能可增加rmIL-23的耳厚。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠与对照组相比，差异无统计学意义(补充图)。1)。因此，Bregs对IL-23介导的银屑病样炎症的抑制可能主要是依赖IL-10的.

据我们所知，这项研究是第一次评估Bregs在IL-23介导的银屑病样炎症中的作用。注射rmIL-23耳的组织病理学检查显示：Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠有明显的角化病和棘皮病比Cd19Cre+/−控制老鼠。此外，B1 B细胞过继转移可直接抑制IL-23介导的银屑病样炎症症状.RmIL-23耳细胞浸润的IHC表现为CD4减少。+T细胞与F4/80+巨噬细胞Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠。Tregs在脾内扩张，并引流rmIL-23-23的淋巴结。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星与Bregs增加有关的小鼠。此外，rmIL-23-注射的耳中Th17分化受到抑制。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星老鼠。总之，这些结果表明Bregs的增加通过Treg的扩张和抑制Th17的分化来抑制IL-23介导的银屑病样炎症。因此，针对Bregs治疗银屑病是一种可行的治疗策略。

先前的一项研究表明，IL-23基因在人银屑病皮损中的表达增加。28。此外，直接给小鼠皮肤注射白介素-23可诱发银屑病样炎症。29,30,31。虽然rmIL-23注射液的组织学表现在第4天是最大的。29、Hedrick等人著。报道称，眼内脓疱在第5天早期就逐渐加重，并在第15天增加了皮肤炎症。这一组织学特征的时间进展表明，从T细胞独立到rmIL-23诱导的反应的T细胞依赖性阶段的进展。32。在本研究中，rmIL-23注射可在第15天引起银屑病样炎症，并伴有明显的棘皮炎和真皮炎症。目前的研究表明，rmIL-23介导的银屑病样炎症在Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠与Cd19Cre+/−小鼠，提示增加的Bregs抑制IL-23介导的银屑病样炎症.此外，通过过继转移的B1 B细胞可直接抑制IL-23介导的银屑病样炎症症状.因此，Bregs在抑制IL-23介导的银屑病样炎症中起着至关重要的作用.在小鼠模型的imiquimod诱导的银屑病样炎症，Bregs也发挥了重要作用。Yanaba等人有报道称缺乏bregs的CD 19缺陷小鼠增加了imiquimod诱导的银屑病样炎症的严重程度。33。Alrefai等人也有报道称，咪喹莫德诱导的银屑病样炎症在小鼠体内表现为B细胞缺失或白细胞介素10缺乏的B细胞。34。提示Bregs在不同小鼠银屑病模型中发挥其抑制作用。与这一发现相一致的是，使用一种消耗B细胞的mAb rituximab治疗在没有银屑病病史的人身上诱发了银屑病样皮肤病。5,6。银屑病是一种免疫介导的疾病，T细胞在银屑病皮损中起着重要作用；事实上，许多生物疗法被批准用于治疗银屑病，其靶点是T细胞或细胞因子。我们的结果提示Bregs通过抑制T细胞反应来抑制IL-23介导的银屑病样炎症.

Bregs通过多种机制发挥其对免疫应答的负调节作用。Bregs通过抑制Th1和Th17细胞分化促进Treg增殖调节T细胞反应35。由于Tregs在调节免疫耐受和预防自身免疫性疾病中起着重要的作用，在几种自身免疫性疾病中，Treg功能的缺陷或Tregs数量的减少已经被报道。同样，Tregs的抑制功能在银屑病中也被报道为缺乏。36。此外，几种治疗银屑病的方法增加了Tregs的数量，或恢复了他们的功能，以改善人类的临床状况。以前的研究表明bregs主要调节早期疾病，而tregs则反过来减轻晚期疾病。17,37。我们目前的研究表明，rmIL-23注射的B细胞特异性PTEN缺陷小鼠在第15天脾脏和引流淋巴结中的Tregs显著增加，在IL-23介导的银屑病样炎症晚期随Bregs的增加而逐渐增加。IL-23诱导的炎症从T细胞独立发展为T细胞依赖期.这些发现提示Bregs通过晚期疾病Treg扩张抑制IL-23诱导的银屑病样炎症。目前的研究还表明，在rmIL-23注射前，B1 B细胞过继转移可显著减轻炎症的严重程度，提示Bregs在触发银屑病发病中起着重要作用。因此，这一结果提示Bregs在早期抑制IL-23介导的银屑病样炎症中起主要作用，而Bregs可抑制晚期银屑病样炎症。我们目前的结果还表明，rmIL-23-注射的耳朵中Th17的分化受到抑制。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠，提示Bregs抑制IL-17A产生CD4。+RmIL-23耳内的T细胞。总之，Bregs有能力将CD4分化从Th17细胞转移到Tregs。以前的一项研究表明人类CD 19+CD 24嗨CD 38嗨B细胞抑制天真T细胞向Th1和Th17细胞分化并转化CD4+CD 25−T细胞转化成Tregs，部分通过产生IL-10。38。在本研究中，阻断IL-10受体功能有增加rmIL-23-注射时耳厚的趋势。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠与对照组相比，差异无统计学意义。Bregs对IL-23介导的银屑病样炎症的抑制可能主要是依赖IL-10的.

我们目前的研究表明，脾脏和引流淋巴结中的Bregs显著增加。Cd19Cre+/−PTEN氧氟沙星/氧氟沙星小鼠，而我们没有直接观察到Bregs向发炎的皮肤迁移。这些结果提示Bregs通过在脾脏和引流淋巴结等淋巴组织中产生IL-10来发挥其负性调节作用。然而，我们不能排除Bregs直接抑制炎症反应的可能性.进一步的研究将需要进一步的研究，以确认Bregs迁移到发炎的皮肤。

总之，我们的结果证明了Bregs在小鼠银屑病中的关键作用。

利妥昔单抗治疗引起人银屑病样皮肤病5,6。另一方面，也有报道说利妥昔单抗在人体内成功地治疗了银屑病性关节炎。39。这一差异表明B细胞在银屑病中的作用是复杂的。然而，最近的研究表明，牛皮癣和脓疱性银屑病患者外周血中bregs祖细胞显著增加，而bregs显著减少。40,41。这些结果表明，Bregs祖细胞增加是由于Bregs减少作为负反馈机制，而Bregs在银屑病和脓疱性银屑病患者中功能受损。现在有越来越多的证据表明Bregs在银屑病的发病机制中起着至关重要的作用，不仅在小鼠身上，而且在人类身上。我们的研究表明Bregs通过Treg的扩张和抑制Th17的分化来抑制IL-23介导的银屑病样炎症。因此，啤酒靶向治疗银屑病可以提供一种可行的治疗策略，需要进一步的研究来开发这种方法。