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HSP GRP 94与巨噬细胞内补体C3相互作用及影响ER应激时M2谱的研究

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发表时间:2021-01-25 10:27作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

GRP 94是一种兼具促炎和抗炎作用的内质网应激蛋白,在巨噬细胞应激过程中未见报道。本研究以人单核细胞GRP 94为研究对象,研究ER钙缺乏的诱导剂thapsigargin(TG)和N-糖基化抑制剂(Tm)诱导的基底和ER应激条件下,M1/LPS+IFNγ和M2/IL-4原代巨噬细胞的GRP 94。GRP 94在M2膜上表达,而M1巨噬细胞不表达。在M2,TG,而非TM,膜中GRP 94含量降低的同时,还能诱导其分泌。这与诱导炎症相关,这是依赖于普遍定期审议IRE 1α手臂激活和功能GRP 94。正如我们先前报道的那样,GRP 94与补体C3在细胞外水平上相关,我们分析了C3,并证实了GRP94-C3在我们的实验模型中的相互作用。此外,TG增强了这种相互作用,在此条件下,在GRP 94与C3和C3b共沉淀的细胞外培养基中检测到C3b和组织蛋白酶L。最后,我们发现仅存在于非应激M2上的C3b灭活片段iC3b依赖于功能GRP 94,这使得GRP 94和iC3b都成为M2细胞的潜在标记。总之,我们的结果表明,在ER应激条件下,GRP 94与C3共同分泌,这可能促进组织蛋白酶L的切割,从而促进在应激的M2巨噬细胞中观察到的促炎作用。

导言

葡萄糖调节蛋白94(grp 94,又称gp 96)是热休克蛋白hsp 90家族的内质网(Erf)成员。1。GRP 94在细胞外培养基的生理或病理情况中也有报道。2,3,4以及肿瘤细胞表面(文献综述)。5)。胞内GRP 94调节炎症和免疫反应,因为它是大多数TLRs和整合素的分子伴侣。6,7。另一方面,它通过与转化生长因子-β(Garp)的对接受体(Garp)(以糖蛋白A重复为主)来调控调节性T细胞。8。此外,GRP 94还被证明与肠道微生物免疫耐受有关,它的表达在正常人单核细胞分化为肠巨噬细胞过程中被强烈诱导,而在克罗恩病患者中则没有。9。此外,华等人。10据报道,GRP 94是树突状CD11c细胞维持肠耐受所必需的。然而,GRP 94是如何诱导巨噬细胞耐受的,目前还不清楚。

巨噬细胞是多种多样的,并根据不同的微环境,不同类型的诱导在体内。经典的促炎型(M1)和活化型(M2)巨噬细胞表型被认为是这个光谱的极致。11。尽管ER应激已被报道在许多涉及巨噬细胞的疾病(肥胖、动脉粥样硬化、神经炎症、关节炎、癌症、肺纤维化…)中。,其对巨噬细胞极化的影响尚不清楚。事实上,一些作者报告了ER应激诱导或扩增促炎m1型细胞因子的作用。12,13或阻断IRE1α后脂肪组织巨噬细胞M2极化增强14而在应激性肿瘤相关巨噬细胞中观察到M2样分布。15,16在肺巨噬细胞中,ER应激似乎有利于M2表型,并具有促纤维化作用。17.

为了更好地了解GRP 94在巨噬细胞中的作用,我们分析了在基础和ER应激条件下,GRP 94在正常人PBMC的M_1和M_2巨噬细胞中的胞内和细胞表面的表达此外,正如我们之前所发现的,胞外GRP 94与补体C3相联系4和Liszewski等人。据报道,T细胞刺激后胞内C3活化系统向细胞表面穿梭,可诱导促炎症细胞因子的产生。18分析巨噬细胞中GRP 94-C3的相互作用,并研究其在巨噬细胞极化中的潜在作用。

结果

ER胁迫对M2(IL-4)巨噬细胞GRP 94细胞膜表达的影响

巨噬细胞从健康志愿者的pbmc中分化而来,激活为促炎m1或活化的M2巨噬细胞。19。在激活过程中,ER应激由ER钙缺乏的诱导剂thapsigargin(Tg)或N-糖基化抑制剂衣霉素(Tm)诱导,其浓度为轻度ER应激。20.

我们首先分析了Bip的表达,发现在TG和TM治疗后,M1和M2巨噬细胞增加。1A)。然后分析细胞内和膜GRP 94。细胞内GRP 94在M1和M2之间没有差异,尽管在TG和/或TM治疗后24h有增加的趋势,但它没有明显改变(图1)。1B)也没有在任何较早的时间点测试(补充图.S1a)。这一结果可以解释为使用的低浓度的TG和TM。GRP 94在M2膜上表达,而在M1巨噬细胞中未表达。1C和补充图。S1B)。此外,TG降低了,但TM暴露后没有下降(图1)。1C, p治疗后48h分别为0.005和0.8122;补充图。S1C6、12和24小时)。

图1:m1(IFNγ-LPS)和M2(IL-4)巨噬细胞在TG或TM作用下GRP 94的表达。

在GM-CSF和M-CSF存在下,分别激活了正常人外周血单个核细胞(PBMC)的M_1和M_2巨噬细胞。Tg(25 NM)或TM(100 NM)在所有激活期均被添加到细胞培养中。A, BWesternblot分析(n=4)A)和GRP 94(B)在M_1和M_2激活的巨噬细胞(24 H)中,TG或TM处理或不处理。C流式细胞术(FACS)分析GRP 94膜在48 h活化的M1和M2上的表达;右侧面板,GRP 94膜在基底或TG或TM状态下M_1和M_2巨噬细胞表达的直方图(P<0.05)。n=14名捐赠者,但TM除外n=5)。DELISA法检测巨噬细胞M2细胞培养上清液中GRP 94的含量n=6)。

接下来,我们在上清中定量了GRP 94,发现TG(而不是TM)诱导了GRP 94的分泌。p=0.0148)。1D).

为了评价TG和TM对巨噬细胞表型的影响,我们分别分析了CD 80和CD 206和Dectin-1作为M1和M2标记。TG对M1无影响,而CD 80升高(p=0.0075),M2上CD 206和Dectin-1下降(p < 0.0001 and p分别=0.0224)(图1。2A),暗示诱导向炎症表型的转变。根据我们以前的研究结果,TM的效果不太明显。而M1则降低CD 80(p与TG相比,它对M2标记物几乎没有影响。MMP 9的活性形式在M2细胞中高表达,而在ER应激条件下,我们再次观察到TG和TM之间的差异,因为只有TG降低了MMP 9的表达(如图1所示)。2B)。值得注意的是,TM对MMP 9迁移有影响,其原因是N-糖基化降低。21.

图2:tg影响M2(IL-4)表型通孔普遍定期审议IRE1α途径。

A流式细胞术分析TG或TM对M1和M2巨噬细胞CD 80、CD 206和Dectin-1膜表达的影响n=6-9)。BMMP-9蛋白的westernblot分析n(3)M_1和M_2的巨噬细胞在24小时内被TG或TM处理或不处理。C信号蛋白pSTAT 1/STAT 1和pSTAT 6/STAT 6的Westernblot分析n(5)24h时,TG或TM处理或不处理M_1和M_2巨噬细胞。DPSTAT 1/STAT 1信号蛋白在TG、TM或卡巴胆碱(CCH,1μM)作用24 h激活的M2巨噬细胞中的表达n=3)。EATF 6抑制剂Capin A7、GSK 2606414和MKC 3946作用24 h活化M2巨噬细胞中信号蛋白pSTAT 1/STAT 1的Westernblot分析n=4)。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.005; ****p < 0.001).

我们还分析了pSTAT 1和pSTAT 6。22。随着CD 80的升高,CD 206和Dectin-1的降低,pSTAT 1在TG处理的M2中增加,而pSTAT 6则下降(图1)。2C)。在M1中,唯一的变化是pSTAT 1的微弱增加。相反,TM诱导M1细胞pSTAT 1显著下降,与CD 80的下降有关,虽然它降低了M2细胞的pSTAT 6,但未诱导pSTAT 1的表达。

由于TG和TM的差异可能与ER应激诱导的差异有关,我们分析了细胞死亡和3种普遍定期审议途径的激活。TG和TM在所用浓度下,在72h时没有引起明显的细胞死亡(附图)。S2A)。在普遍定期审议方面,TG和TM诱导M1和M2的IRE1α和PERK激活,但这种作用对TG(附图)更为重要。S2B)。这种差异在24小时的M2中尤为显著(补充图)。S2C)。TG或TM处理后的任何时间点均未观察到ATF 6激活产生的裂解片段(数据未显示),表明ATF 6在我们的模型中未被激活。我们还发现,作为ER IP 3受体激动剂的卡巴胆碱(CCH)不能诱导IRE1α或perk激活(补充图1),该激动剂可导致ER向胞浆释放钙。S2C)或pSTAT 1或CD 206-CD 80在M2巨噬细胞中的变化。二维空间和补充图。S2D),从而证实在TG治疗后M2中观察到的炎症前轮廓是必需的。最后,使用这三种途径的抑制剂,我们发现pIRE 1α的抑制剂MK-3946显著降低了pSTAT 1的表达。p在TG处理的M2巨噬细胞中=0.0185。2E).

结果表明,GRP 94表达于M2(IL-4)膜上,而非人原代巨噬细胞M1(IFNγ-LPS)在体外分化和激活。此外,在M2,TG下调膜GRP 94,这是与其分泌和切换到促炎症的轮廓,这与IRE 1α通路的激活相关。

功能GRP 94是调节M2对TG诱导的促炎作用所必需的。

为了研究grp 94在M2中的作用,我们使用了pu-ws 13。23,一种选择性抑制剂,能以封闭的形式抑制GRP 94,并与客户蛋白结合。PU-WS13在IFNγ+LPS或IL-4和TG前24 h加入,使GRP 94在激活前和激活期被抑制。

我们首先发现PU-WS13没有引起ER应激,这表现在Bip缺乏增加(补充图1)。S3A)和细胞毒性在72小时后,在所测试的浓度(补充图)。S3B).

然后分析细胞内和膜GRP 94。如预期24,PU-WS13不影响胞内GRP 94(图1)。3A)。对于膜GRP 94,PU-WS13对TG处理的M1无影响。而PU-WS13本身对M2无影响(附图)。S3C可明显防止TG所致膜GRP 94的下降(图1)。3B)以及它的分泌(如图所示。3C),再次发现膜结合与分泌GRP 94呈负相关。

图3:PU-WS13对GRP 94的抑制作用减弱了TG诱导的ER应激对M2巨噬细胞的影响。

分别在GM-CSF和M-CSF存在下激活PBMC中的M_1和M_2巨噬细胞。细胞培养48h后加入TG。细胞培养液中加入PU-WS13或DMSO,浓度为25μM,24 h后,在所有激活期内加入。A胞内GRP 94蛋白印迹分析(n=3)。B膜GRP 94表达的FACS分析(英文)n=6)。CELISA法检测活化M2细胞培养上清液中GRP 94的含量n=6)。D流式细胞仪分析CD 80和CD 206(n=4)。E, F活化M2巨噬细胞MMP 9蛋白的westernblot分析(英文)n=4)(E)和信号蛋白pSTAT 1/STAT 1、pSTAT 6/STAT 6和PIκB/IκB(n=4)(F). GM2细胞培养上清液中促炎和抗炎细胞因子的分析n=5-7)。IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α用多重™法定量,TGF-β用ELISA法定量(*)。p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.005; ****p < 0.001).

我们还分析了CD 206和CD 80的表达,结果表明,在25μM浓度下,PU-WS13对TG处理的M2中CD 80的升高和CD 206的降低均有抑制作用(图一)。三维空间)。PU-WS13在不存在TG的情况下,或不经TG处理或未处理的M1中,均未引起M2中这些标记物的改变。剂量依赖性的效应分析表明,PU-WS13在1μM时部分阻止CD 80的升高,而对CD 206的影响则需要更高的浓度(补充图)。S3D)。我们还分析了选择性HSP 90抑制剂NVP-BEP 800的作用,在50和500 NM浓度下,我们没有观察到CD 80和CD 206表达的变化(补充图)。S3D),浓度较高是有毒的(补充图。S3E)。这证实了pu-ws13对grp 94的特异性。23.

因此,我们把重点放在M2来分析MMP 9的表达和STAT 1、IKB和STAT 6的磷酸化。PU-WS13不能阻止MMP 9的减少(图1)。3E)或由TG引起的pSTAT 6的下降(如图所示)。3F)但能阻止TG诱导的pSTAT 1和pIKB的增加。

我们分析了上清液中的细胞因子,发现与未处理的M2相反,TG处理的M2产生干扰素γ、IL-6和肿瘤坏死因子α,以及较低但显著的IL-1β水平,而TGF-β则下降(如图所示)。第三代),证实了甘油三酯(TG)在M2中诱导的促炎作用。PU-WS13可降低γ、IL-6和α的分泌,但不能阻止TGF-β的下降,这与其对STAT 6磷酸化无影响(图1)。3F).

这些结果表明,在缺乏LPS或IFNγ等外源性诱导剂的情况下,GRP 94对TG诱导M2巨噬细胞产生促炎作用是必要的。在这种情况下,GRP 94可能有助于微调M2巨噬细胞的平衡PRO/抗炎曲线。

TG降低M2巨噬细胞CD11b表达

GRp 94分子中有促炎蛋白和抗炎蛋白,其中TLR 4、garp和整合素α和β链是C3失活的iC3b片段的CR3和CR4受体,已被证明能诱导巨噬细胞耐受。25。这些蛋白可能参与调节TG处理后观察到的M2剖面。

结果如图所示。4A表明M2(用TG治疗与否)不表达膜GARP,提示其可能与PU-WS13治疗后抗炎剖面恢复不佳有关。TG处理24h、48h和72h膜GARP分析(图1)。4B),用Westernblot法测定48h时的GARP总量(图1)。4C)证实了这一结果。相反,GARP在M1中表达,在TG治疗后,其中一部分表达GARP(p=0.0006)。PU-WS13治疗后M1上的GAP表达明显降低(附图)。S4).

图4:GAP和CD11b在M1和M2巨噬细胞上的表达。

ATG对M_1和M_2巨噬细胞GARP膜表达的FACS分析(英文)n=4)。BGARP在M_1和M_2巨噬细胞上表达的动力学研究n=3)。CM1和M2巨噬细胞经TG处理后的GAP分析(有代表性的图像);n=2)。DCD11b(n=8)和CD 18(n=4)TG(*)处理或未处理M1和M2巨噬细胞的膜表达p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.005; ****p < 0.001).

我们分析了cr3整合素αM链CD11b和iC3b受体CR3和CR4共有的整合素β2链CD 18,发现TG处理M2巨噬细胞后CD11b平均荧光强度下降,而M1巨噬细胞中CD11b平均荧光强度下降(p=0.0009)(图1。4D).

根据这些结果和我们以前的研究结果表明,胞外GRP 94与补体C3相互作用4我们决定研究巨噬细胞内GRP 94-C3的相互作用。

GRP 94与巨噬细胞内C3相互作用

为了研究GRP 94-C3的结合,我们首次用THP 1细胞共沉淀GRP 94和C3/C3b。GRP 94和C3的α链共沉淀如图所示。5A.

图5:GRP 94-C3相互作用在THP 1细胞以及从健康供者单核细胞衍生的M_1和M_2巨噬细胞中相互作用。

A抗C3d多克隆抗体在THP 1细胞中共沉淀C3和GRP 94的免疫印迹n=3)。GRP 4先显示,然后是C3,之前没有剥脱。BTG处理或未用PU-WS13或DMSO预处理或不处理的M1和M2巨噬细胞C3/C3b和GRP 94的近距离连接试验(Duolink™PLA)的染色和定量(英文)n3);方框图表示所分析的每个单元格的点数。最接近于零的框的边界表示第25百分位数,框内的黑线表示从0到第75百分位数的框的中位数和边界。方框下方和上方的晶须表示第5百分位数和第95百分位数。晶须下方和上方的点表示第5百分位数和第95百分位数以外的异常值(*)p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.005; ****p < 0.001). CTG对活化M2巨噬细胞C3/C3b和GM 130免疫荧光染色的影响n=3,有代表性的图像)。DGRP 94和C3/C3b免疫荧光染色(英文)n=3,有代表性的图像)。白色箭头表示每个标签的重叠区域。标尺=20μm。

然后,我们采用近距离连接试验(Duolink™PLA)证实了GRP 94-C3/C3b在M1和M2巨噬细胞中的相互作用。5B)。在m1中,grp 94-c3相互作用的定量与这里用作阳性对照的grp 94 tLR 4相似。7。在M2中,相互作用的次数低于M1(p结果表明,TG有利于GRP 94-C3/C3b的相互作用。最后,在PU-WS 13的存在下,TG处理的M1和M2的相互作用进一步增强(p=0.0038和p分别=0.0033)。复合物grp 94/pu-ws13对C3的固存是由于PU-ws13将伴侣保持在其封闭的形式上。24.

然后用免疫荧光法分析GRP 94和C3/C3b。由于GRP 94和C3分泌,我们也使用GM 130,一个高尔基体标记。如图所示。5C在M2中,C3/C3b与GM 130共定位,但与GRP 94无或几乎没有共定位。5D)。在TG处理的M2细胞中,GRP 94和C3明显共定位,C3/C3b仍与GM 130共定位,但有较多的弥漫性染色,GRP 94在C3/C3b高染色的胞浆区有广泛的重叠,特别是在假足顶端。这些结果表明TG可能有利于GRP 94和C3/C3b共定位,这与我们的PLA结果相一致。

未处理与TG处理的M2巨噬细胞的平衡iC3b/c3b不同。

由于GRP 94在TG处理的M2上清中分泌,并与C3/C3b共存,我们分析了上清中的C3/C3b。在所有条件下(MW 125 KD)均检测到C3的α−链,但TG处理条件下的α‘链(C3b,MW 115 kD)仅在TG处理的细胞上清液中检测到。6A)。接下来,我们在上清中进行了C3/C3b和GRP 94共沉淀实验,并证实了这些结果。有趣的是,只有在TG处理的上清液中才能检测到GRP 94-C3-C3b相互作用(图一)。6B).

图6:未处理和TG处理的M2巨噬细胞C3b/iC3b平衡。

ATG处理和不处理48h活化M2巨噬细胞培养上清液中C3/C3b的Westernblot分析(英文)n=3)。B用抗C3d多克隆抗体在M2巨噬细胞上清液中共沉淀C3/C3b和GRP 94n=2)。组织蛋白酶L在细胞上清液中的Westernblot分析(n=3)(C)和细胞裂解物(D)活化的M2巨噬细胞经TG处理或不处理。n=3)。E用聚合酶链反应(PCR)分析TG处理或未处理的M1和M2巨噬细胞CYT 1和CYT 2 CD 46亚型。n=3)。F三酰甘油处理或未处理M_1和M_2巨噬细胞iC3b膜结合FACS分析(英文)n=3)。G重组iC3b(10;100;1000 nm)作用于TG处理的M1巨噬细胞pSTAT 1/STAT 1信号蛋白的Westernblot分析n=3)。

然后,我们分析了细胞和分泌的组织蛋白酶L,该蛋白酶被描述为参与T细胞中C3被切割成C3b和C3a的蛋白酶。18。结果表明,组织蛋白酶L仅存在于TG处理的M2上清液中。6C),这与细胞裂解物的减少有关(见图)。6d).

CD 46既是将C3b切割成iC3b的第一因子的辅助因子,也是显示参与T细胞分化的CYT 1和CYT 2亚型的C3b受体,我们对CD 46 CYT 1和CYT 2亚型mRNA进行了分析。CYT 1和CYT 2亚型在M1和M2中表达差异(图2)。6E),M2主要表达CYT 2亚型。相反,TG处理使两种表型的CYT 1/CYT 2比值增加。

最后,我们分析了膜结合的iC3b,发现它存在于M2,而不是M1巨噬细胞,TG治疗后,iC3b明显降低(如图1所示)。6f)。然后,我们用重组的iC3b来观察它是否能调节TG诱导的M2的促炎表型。IC3b与IL-4和TG同时加入,我们使用pSTAT 1作为读出,因为它受到TG的强烈影响(图1)。2C)。如GRP 94抑制剂PU-WS13所示(如图所示)。3F),iC3b以剂量依赖性的方式阻断TG诱导的pSTAT 1的增加。6g).

这些结果提示C3b/iC3b可能参与调节TG处理的M2的促炎剖面,其与CYT 1/CYT 2 CD 46的比值有一定的相关性。

GRP 94对膜结合iC3b和细胞内组织蛋白酶L的影响

接下来我们分析PU-WS13是否影响膜结合的iC3b。如图所示。7A,PU-WS13降低了M2上的膜结合iC3b,提示GRP 94的参与。然后,我们分析了PU-WS13对组织蛋白酶L的影响,并观察到,在未处理的巨噬细胞中,其细胞内组织蛋白酶L呈上升趋势,PU-WS13可明显抑制TG诱导的组织蛋白酶L的下降(图1)。7b)。最后,我们用PLA分析了细胞内GRP 94与组织蛋白酶L之间的相互作用,结果表明GRP 94与组织蛋白酶L在TG治疗后明显升高。7C).

图7:GRP 94对细胞膜结合的iC3b和细胞内组织蛋白酶L的影响。

APu-WS 13存在或不存在时,tg处理或不处理48h活化M2巨噬细胞iC3b膜结合的FACS分析(n=4)。BTg处理和PU-WS13预处理前后M2巨噬细胞裂解液组织蛋白酶-L的westernblot分析(n=4)。CTG处理或不处理M2巨噬细胞组织蛋白酶L与GRP 94的近距离连接试验(Duolink™PLA)的染色与定量(英文)n=4)(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.005; ****p < 0.001).

GRP 94在TG处理的巨噬细胞中与细胞外介质中的C3和组织蛋白酶L一起分泌,可能通过组织蛋白酶L激活C3,并与所观察到的促炎症反应有关。

讨论

结果表明,GRP 94在M2膜上表达,而M1巨噬细胞不表达。此外,ER应激诱导剂thapsigargin在降低M2上GRP 94膜表达的同时,可诱导GRP 94分泌,并具有促炎作用。这些结果提示膜与分泌GRP 94呈负相关,膜GRP 94与M2的抗炎剖面呈负相关,而膜表达不足则与促炎相关。这种GRP 94依赖的促炎作用,在所用浓度下用TG观察到,而不是TM,与普遍定期审议激活的IRE1α途径有关。我们的结果与已发表的数据一致,表明grp 94分泌发生在tg之后,而不是tm治疗后。26,27。此外,他们也有足够的研究显示ire 1α与小鼠M2巨噬细胞的促炎作用有关。14,28.

由于TG是ER钙ATP酶的抑制剂,TG-GRP 94对巨噬细胞的依赖性作用可能与ER钙平衡有关。事实上,在巨噬细胞的TLR活化和炎症过程中,ER和/或细胞外间隙的钙含量增加。29,30,31,32巨噬细胞极化33。然而,单用ER膜IP3R受体激动剂卡巴胆碱对M2巨噬细胞的作用是不可缺少的。

据我们所知,这是第一次报告显示GRP 94存在于M2巨噬细胞表面。有趣的是,我们还发现了GRP 94与M2在体内的联系。我们分析了CD 206+巨噬细胞浸润小鼠三重阴性乳腺癌4T1活检,发现GRP 94存在于其膜上(如图所示)。S5)。我们认为膜GRP 94可能是M2(IL-4)细胞的一个特征。

为了更好地理解grp 94在M2中的作用,我们使用了它的特异性抑制剂pu-ws13。24...PU-WS13既不影响M2标记物,也不影响TGF-β水平,提示在我们的条件下,功能GRP 94可能不是维持M2表型在基础条件下所必需的。相反,PU-WS13通过阻止TG诱导的GRP 94分泌和促炎症标志物的增加,对TG处理的M2有明显的抑制作用。我们的结论是,分泌GRP 94可能起到促进炎症的作用。然而,PU-WS13抑制TG诱导的pSTAT 1表达,但不能恢复pSTAT 6或M2谱的抗炎标记物。GRP 94在M2中的作用不涉及其激活转化生长因子-β的客户蛋白GARP,因为GARP在M2中不表达。IC3b受体CD11b作为GRP 94的另一个客户,在M2中表达,TG诱导其表达降低。IC3b诱导巨噬细胞耐受25我们以前报道过GvHD患者血清GRP 94与补体C3/C3b相互作用。4。在这里,这种联系在巨噬细胞中得到证实。有趣的是,Dolink™PLA在M2中观察到的GRP 94-C3相互作用数低于M1,TG处理后增加。免疫荧光证实了我们的结果,表明在TG条件下,PLA中较高的C3/C3b水平和与GRP 94的共定位可以解释PLA中较多的相互作用。我们认为C3不太可能在ER中与grp 94发生相互作用,但在高尔基装置中亲C3断裂后与α链相互作用,这与gg治疗后GRP 94进入高尔基复合体的结果一致。27,34。虽然M2和TG处理的M2都分泌C3,但只有TG处理后才观察到一条与C3b相对应的条带。T淋巴细胞组织蛋白酶L切割C318。在这里,我们表明TG诱导了组织蛋白酶L的分泌,与已发表的结果一致。35,36。因此,在TG处理的条件下,C3可能主要被组织蛋白酶L细胞外裂解。此外,GRP 94与C3-C3b共沉淀于上清液中,证实了ELISA结果,提示GRP 94在裂解过程中可能与C3有关。GRP 94这样的伴侣最有可能的解释是,通过与C3的联系,它会影响组织蛋白酶的可及性。因此,我们推测在TG条件下,GRP 94是M2与C3和组织蛋白酶L共同分泌的,而组织蛋白酶-L则有利于C3的裂解,这可能是GRP 94促炎症作用的原因之一。有趣的是,我们之前发现的C3(AA 749-954)区域与GRP 94相互作用。4是结合因子H的区域,C3调节因子,也是组织蛋白酶L的辅助因子(补充图)。S6)37。此外,PU-WS13能抑制TG诱导的细胞组织蛋白酶L的减少,PLA结果表明TG有利于GRP 94与组织蛋白酶L的接近,从而证实了GRP 94与组织蛋白酶L之间的联系。

TG处理可增加CD46CYT1亚型,在Th1淋巴细胞分化中起主要作用,而CYT 2亚型主要在M2细胞上表达。TG诱导的C3裂解为C3b和C3a可能参与了所观察到的促炎症反应。事实上,c3b与CD46CYT1的结合对T细胞分泌干扰素γ的贡献是众所周知的。38并诱导小鼠巨噬细胞产生NO表达CYT 1,而不表达CYT 2。39。C3a诱导小鼠巨噬细胞产生pSTAT 1、pNFkB和TNFα,并在IL-4作用下降低M2标记物的表达。40.

最后,我们发现在M2巨噬细胞上存在iC3b,但TG处理后iC3b随CD11b的降低而降低。此外,PU-WS13处理后其含量下降,表明其存在依赖于GRP 94。

结论:GRP 94在M2(IL-4)膜上表达,而不是在TG处理的M2或M1巨噬细胞上表达,提示GRP 94可能是M2细胞的标志。膜结合的iC3b也是M2的一个标记,依赖于功能GRP 94。我们证明,TG诱导的M2内质网应激使其向促炎型转变,这既与IRE 1α的激活有关,又依赖于功能GRP 94,可能与其与C3共同分泌并促进其在细胞外介质中的激活有关。巨噬细胞在癌症、炎症和自身免疫性疾病中起着关键作用,而M2巨噬细胞抗炎功能的调节是这些疾病中的一个问题。我们的结果表明,膜GRP 94可能是M2的一个标志,它在ER应激中调节其抗炎功能的作用有助于开发新的治疗方法。在图中。8我们提出了一个整合GRP 94和补体C3参与基础条件和TG应激的M2巨噬细胞的假说模型。

图8:GRP 94和C3在基础和TG治疗的M2巨噬细胞中整合的假设方案。

上面板:IL-4/STAT 6信号转导激活M2巨噬细胞,表达膜GRP 94,CD11b/CD 18补体受体CR3高水平,主要为CYT 2 CD 46亚型。C3虽然存在于细胞外培养基中,但由于细胞内没有细胞外组织蛋白酶L而未被切割,组织蛋白酶L可能切割C3,从而产生C3b,而C3b则在其iC3b片段中失活。IC3b与受体CR3结合可能与M2表型有关。下面板:在TG诱导的ER应激下,IL-4/STAT 6信号传导受到抑制.GRP 94细胞表面表达明显降低,CD11b和膜结合iC3b表达明显降低。胞内GRP 94与C3有广泛的相互作用,两者均分泌。组织蛋白酶-L也能分泌,并能将C3细胞外切割成C3b和C3a。这两个片段均可诱导pSTAT 1+,C3b不再与CD 46 CYT 1亚型发生灭活和相互作用,而C3a可与其受体C3aR相互作用。


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