HSP GRP 94与巨噬细胞内补体C3相互作用及影响ER应激时M2谱的研究

GRP 94是一种兼具促炎和抗炎作用的内质网应激蛋白，在巨噬细胞应激过程中未见报道。本研究以人单核细胞GRP 94为研究对象，研究ER钙缺乏的诱导剂thapsigargin(TG)和N-糖基化抑制剂(Tm)诱导的基底和ER应激条件下，M1/LPS+IFNγ和M2/IL-4原代巨噬细胞的GRP 94。GRP 94在M2膜上表达，而M1巨噬细胞不表达。在M2，TG，而非TM，膜中GRP 94含量降低的同时，还能诱导其分泌。这与诱导炎症相关，这是依赖于普遍定期审议IRE 1α手臂激活和功能GRP 94。正如我们先前报道的那样，GRP 94与补体C3在细胞外水平上相关，我们分析了C3，并证实了GRP94-C3在我们的实验模型中的相互作用。此外，TG增强了这种相互作用，在此条件下，在GRP 94与C3和C3b共沉淀的细胞外培养基中检测到C3b和组织蛋白酶L。最后，我们发现仅存在于非应激M2上的C3b灭活片段iC3b依赖于功能GRP 94，这使得GRP 94和iC3b都成为M2细胞的潜在标记。总之，我们的结果表明，在ER应激条件下，GRP 94与C3共同分泌，这可能促进组织蛋白酶L的切割，从而促进在应激的M2巨噬细胞中观察到的促炎作用。

葡萄糖调节蛋白94(grp 94，又称gp 96)是热休克蛋白hsp 90家族的内质网(Erf)成员。1。GRP 94在细胞外培养基的生理或病理情况中也有报道。2,3,4以及肿瘤细胞表面(文献综述)。5)。胞内GRP 94调节炎症和免疫反应，因为它是大多数TLRs和整合素的分子伴侣。6,7。另一方面，它通过与转化生长因子-β(Garp)的对接受体(Garp)(以糖蛋白A重复为主)来调控调节性T细胞。8。此外，GRP 94还被证明与肠道微生物免疫耐受有关，它的表达在正常人单核细胞分化为肠巨噬细胞过程中被强烈诱导，而在克罗恩病患者中则没有。9。此外，华等人。10据报道，GRP 94是树突状CD11c细胞维持肠耐受所必需的。然而，GRP 94是如何诱导巨噬细胞耐受的，目前还不清楚。

巨噬细胞是多种多样的，并根据不同的微环境，不同类型的诱导在体内。经典的促炎型(M1)和活化型(M2)巨噬细胞表型被认为是这个光谱的极致。11。尽管ER应激已被报道在许多涉及巨噬细胞的疾病(肥胖、动脉粥样硬化、神经炎症、关节炎、癌症、肺纤维化…)中。，其对巨噬细胞极化的影响尚不清楚。事实上，一些作者报告了ER应激诱导或扩增促炎m1型细胞因子的作用。12,13或阻断IRE1α后脂肪组织巨噬细胞M2极化增强14而在应激性肿瘤相关巨噬细胞中观察到M2样分布。15,16在肺巨噬细胞中，ER应激似乎有利于M2表型，并具有促纤维化作用。17.

为了更好地了解GRP 94在巨噬细胞中的作用，我们分析了在基础和ER应激条件下，GRP 94在正常人PBMC的M_1和M_2巨噬细胞中的胞内和细胞表面的表达此外，正如我们之前所发现的，胞外GRP 94与补体C3相联系4和Liszewski等人。据报道，T细胞刺激后胞内C3活化系统向细胞表面穿梭，可诱导促炎症细胞因子的产生。18分析巨噬细胞中GRP 94-C3的相互作用，并研究其在巨噬细胞极化中的潜在作用。

ER胁迫对M2(IL-4)巨噬细胞GRP 94细胞膜表达的影响

巨噬细胞从健康志愿者的pbmc中分化而来，激活为促炎m1或活化的M2巨噬细胞。19。在激活过程中，ER应激由ER钙缺乏的诱导剂thapsigargin(Tg)或N-糖基化抑制剂衣霉素(Tm)诱导，其浓度为轻度ER应激。20.

我们首先分析了Bip的表达，发现在TG和TM治疗后，M1和M2巨噬细胞增加。1A)。然后分析细胞内和膜GRP 94。细胞内GRP 94在M1和M2之间没有差异，尽管在TG和/或TM治疗后24h有增加的趋势，但它没有明显改变(图1)。1B)也没有在任何较早的时间点测试(补充图.S1a)。这一结果可以解释为使用的低浓度的TG和TM。GRP 94在M2膜上表达，而在M1巨噬细胞中未表达。1C和补充图。S1B)。此外，TG降低了，但TM暴露后没有下降(图1)。1C, p治疗后48h分别为0.005和0.8122；补充图。S1C6、12和24小时)。

接下来，我们在上清中定量了GRP 94，发现TG(而不是TM)诱导了GRP 94的分泌。p=0.0148)。1D).

为了评价TG和TM对巨噬细胞表型的影响，我们分别分析了CD 80和CD 206和Dectin-1作为M1和M2标记。TG对M1无影响，而CD 80升高(p=0.0075)，M2上CD 206和Dectin-1下降(p < 0.0001 and p分别=0.0224)(图1。2A)，暗示诱导向炎症表型的转变。根据我们以前的研究结果，TM的效果不太明显。而M1则降低CD 80(p与TG相比，它对M2标记物几乎没有影响。MMP 9的活性形式在M2细胞中高表达，而在ER应激条件下，我们再次观察到TG和TM之间的差异，因为只有TG降低了MMP 9的表达(如图1所示)。2B)。值得注意的是，TM对MMP 9迁移有影响，其原因是N-糖基化降低。21.

我们还分析了pSTAT 1和pSTAT 6。22。随着CD 80的升高，CD 206和Dectin-1的降低，pSTAT 1在TG处理的M2中增加，而pSTAT 6则下降(图1)。2C)。在M1中，唯一的变化是pSTAT 1的微弱增加。相反，TM诱导M1细胞pSTAT 1显著下降，与CD 80的下降有关，虽然它降低了M2细胞的pSTAT 6，但未诱导pSTAT 1的表达。

由于TG和TM的差异可能与ER应激诱导的差异有关，我们分析了细胞死亡和3种普遍定期审议途径的激活。TG和TM在所用浓度下，在72h时没有引起明显的细胞死亡(附图)。S2A)。在普遍定期审议方面，TG和TM诱导M1和M2的IRE1α和PERK激活，但这种作用对TG(附图)更为重要。S2B)。这种差异在24小时的M2中尤为显著(补充图)。S2C)。TG或TM处理后的任何时间点均未观察到ATF 6激活产生的裂解片段(数据未显示)，表明ATF 6在我们的模型中未被激活。我们还发现，作为ER IP 3受体激动剂的卡巴胆碱(CCH)不能诱导IRE1α或perk激活(补充图1)，该激动剂可导致ER向胞浆释放钙。S2C)或pSTAT 1或CD 206-CD 80在M2巨噬细胞中的变化。二维空间和补充图。S2D)，从而证实在TG治疗后M2中观察到的炎症前轮廓是必需的。最后，使用这三种途径的抑制剂，我们发现pIRE 1α的抑制剂MK-3946显著降低了pSTAT 1的表达。p在TG处理的M2巨噬细胞中=0.0185。2E).

结果表明，GRP 94表达于M2(IL-4)膜上，而非人原代巨噬细胞M1(IFNγ-LPS)在体外分化和激活。此外，在M2，TG下调膜GRP 94，这是与其分泌和切换到促炎症的轮廓，这与IRE 1α通路的激活相关。

功能GRP 94是调节M2对TG诱导的促炎作用所必需的。

为了研究grp 94在M2中的作用，我们使用了pu-ws 13。23，一种选择性抑制剂，能以封闭的形式抑制GRP 94，并与客户蛋白结合。PU-WS13在IFNγ+LPS或IL-4和TG前24 h加入，使GRP 94在激活前和激活期被抑制。

我们首先发现PU-WS13没有引起ER应激，这表现在Bip缺乏增加(补充图1)。S3A)和细胞毒性在72小时后，在所测试的浓度(补充图)。S3B).

然后分析细胞内和膜GRP 94。如预期24，PU-WS13不影响胞内GRP 94(图1)。3A)。对于膜GRP 94，PU-WS13对TG处理的M1无影响。而PU-WS13本身对M2无影响(附图)。S3C可明显防止TG所致膜GRP 94的下降(图1)。3B)以及它的分泌(如图所示。3C)，再次发现膜结合与分泌GRP 94呈负相关。

我们还分析了CD 206和CD 80的表达，结果表明，在25μM浓度下，PU-WS13对TG处理的M2中CD 80的升高和CD 206的降低均有抑制作用(图一)。三维空间)。PU-WS13在不存在TG的情况下，或不经TG处理或未处理的M1中，均未引起M2中这些标记物的改变。剂量依赖性的效应分析表明，PU-WS13在1μM时部分阻止CD 80的升高，而对CD 206的影响则需要更高的浓度(补充图)。S3D)。我们还分析了选择性HSP 90抑制剂NVP-BEP 800的作用，在50和500 NM浓度下，我们没有观察到CD 80和CD 206表达的变化(补充图)。S3D)，浓度较高是有毒的(补充图。S3E)。这证实了pu-ws13对grp 94的特异性。23.

因此，我们把重点放在M2来分析MMP 9的表达和STAT 1、IKB和STAT 6的磷酸化。PU-WS13不能阻止MMP 9的减少(图1)。3E)或由TG引起的pSTAT 6的下降(如图所示)。3F)但能阻止TG诱导的pSTAT 1和pIKB的增加。

我们分析了上清液中的细胞因子，发现与未处理的M2相反，TG处理的M2产生干扰素γ、IL-6和肿瘤坏死因子α，以及较低但显著的IL-1β水平，而TGF-β则下降(如图所示)。第三代)，证实了甘油三酯(TG)在M2中诱导的促炎作用。PU-WS13可降低γ、IL-6和α的分泌，但不能阻止TGF-β的下降，这与其对STAT 6磷酸化无影响(图1)。3F).

这些结果表明，在缺乏LPS或IFNγ等外源性诱导剂的情况下，GRP 94对TG诱导M2巨噬细胞产生促炎作用是必要的。在这种情况下，GRP 94可能有助于微调M2巨噬细胞的平衡PRO/抗炎曲线。

TG降低M2巨噬细胞CD11b表达

GRp 94分子中有促炎蛋白和抗炎蛋白，其中TLR 4、garp和整合素α和β链是C3失活的iC3b片段的CR3和CR4受体，已被证明能诱导巨噬细胞耐受。25。这些蛋白可能参与调节TG处理后观察到的M2剖面。

结果如图所示。4A表明M2(用TG治疗与否)不表达膜GARP，提示其可能与PU-WS13治疗后抗炎剖面恢复不佳有关。TG处理24h、48h和72h膜GARP分析(图1)。4B)，用Westernblot法测定48h时的GARP总量(图1)。4C)证实了这一结果。相反，GARP在M1中表达，在TG治疗后，其中一部分表达GARP(p=0.0006)。PU-WS13治疗后M1上的GAP表达明显降低(附图)。S4).

我们分析了cr3整合素αM链CD11b和iC3b受体CR3和CR4共有的整合素β2链CD 18，发现TG处理M2巨噬细胞后CD11b平均荧光强度下降，而M1巨噬细胞中CD11b平均荧光强度下降(p=0.0009)(图1。4D).

根据这些结果和我们以前的研究结果表明，胞外GRP 94与补体C3相互作用4我们决定研究巨噬细胞内GRP 94-C3的相互作用。

GRP 94与巨噬细胞内C3相互作用

为了研究GRP 94-C3的结合，我们首次用THP 1细胞共沉淀GRP 94和C3/C3b。GRP 94和C3的α链共沉淀如图所示。5A.

然后，我们采用近距离连接试验(Duolink™PLA)证实了GRP 94-C3/C3b在M1和M2巨噬细胞中的相互作用。5B)。在m1中，grp 94-c3相互作用的定量与这里用作阳性对照的grp 94 tLR 4相似。7。在M2中，相互作用的次数低于M1(p结果表明，TG有利于GRP 94-C3/C3b的相互作用。最后，在PU-WS 13的存在下，TG处理的M1和M2的相互作用进一步增强(p=0.0038和p分别=0.0033)。复合物grp 94/pu-ws13对C3的固存是由于PU-ws13将伴侣保持在其封闭的形式上。24.

然后用免疫荧光法分析GRP 94和C3/C3b。由于GRP 94和C3分泌，我们也使用GM 130，一个高尔基体标记。如图所示。5C在M2中，C3/C3b与GM 130共定位，但与GRP 94无或几乎没有共定位。5D)。在TG处理的M2细胞中，GRP 94和C3明显共定位，C3/C3b仍与GM 130共定位，但有较多的弥漫性染色，GRP 94在C3/C3b高染色的胞浆区有广泛的重叠，特别是在假足顶端。这些结果表明TG可能有利于GRP 94和C3/C3b共定位，这与我们的PLA结果相一致。

未处理与TG处理的M2巨噬细胞的平衡iC3b/c3b不同。

由于GRP 94在TG处理的M2上清中分泌，并与C3/C3b共存，我们分析了上清中的C3/C3b。在所有条件下(MW 125 KD)均检测到C3的α−链，但TG处理条件下的α‘链(C3b，MW 115 kD)仅在TG处理的细胞上清液中检测到。6A)。接下来，我们在上清中进行了C3/C3b和GRP 94共沉淀实验，并证实了这些结果。有趣的是，只有在TG处理的上清液中才能检测到GRP 94-C3-C3b相互作用(图一)。6B).

然后，我们分析了细胞和分泌的组织蛋白酶L，该蛋白酶被描述为参与T细胞中C3被切割成C3b和C3a的蛋白酶。18。结果表明，组织蛋白酶L仅存在于TG处理的M2上清液中。6C)，这与细胞裂解物的减少有关(见图)。6d).

CD 46既是将C3b切割成iC3b的第一因子的辅助因子，也是显示参与T细胞分化的CYT 1和CYT 2亚型的C3b受体，我们对CD 46 CYT 1和CYT 2亚型mRNA进行了分析。CYT 1和CYT 2亚型在M1和M2中表达差异(图2)。6E)，M2主要表达CYT 2亚型。相反，TG处理使两种表型的CYT 1/CYT 2比值增加。

最后，我们分析了膜结合的iC3b，发现它存在于M2，而不是M1巨噬细胞，TG治疗后，iC3b明显降低(如图1所示)。6f)。然后，我们用重组的iC3b来观察它是否能调节TG诱导的M2的促炎表型。IC3b与IL-4和TG同时加入，我们使用pSTAT 1作为读出，因为它受到TG的强烈影响(图1)。2C)。如GRP 94抑制剂PU-WS13所示(如图所示)。3F)，iC3b以剂量依赖性的方式阻断TG诱导的pSTAT 1的增加。6g).

这些结果提示C3b/iC3b可能参与调节TG处理的M2的促炎剖面，其与CYT 1/CYT 2 CD 46的比值有一定的相关性。

GRP 94对膜结合iC3b和细胞内组织蛋白酶L的影响

接下来我们分析PU-WS13是否影响膜结合的iC3b。如图所示。7A，PU-WS13降低了M2上的膜结合iC3b，提示GRP 94的参与。然后，我们分析了PU-WS13对组织蛋白酶L的影响，并观察到，在未处理的巨噬细胞中，其细胞内组织蛋白酶L呈上升趋势，PU-WS13可明显抑制TG诱导的组织蛋白酶L的下降(图1)。7b)。最后，我们用PLA分析了细胞内GRP 94与组织蛋白酶L之间的相互作用，结果表明GRP 94与组织蛋白酶L在TG治疗后明显升高。7C).

GRP 94在TG处理的巨噬细胞中与细胞外介质中的C3和组织蛋白酶L一起分泌，可能通过组织蛋白酶L激活C3，并与所观察到的促炎症反应有关。

结果表明，GRP 94在M2膜上表达，而M1巨噬细胞不表达。此外，ER应激诱导剂thapsigargin在降低M2上GRP 94膜表达的同时，可诱导GRP 94分泌，并具有促炎作用。这些结果提示膜与分泌GRP 94呈负相关，膜GRP 94与M2的抗炎剖面呈负相关，而膜表达不足则与促炎相关。这种GRP 94依赖的促炎作用，在所用浓度下用TG观察到，而不是TM，与普遍定期审议激活的IRE1α途径有关。我们的结果与已发表的数据一致，表明grp 94分泌发生在tg之后，而不是tm治疗后。26,27。此外，他们也有足够的研究显示ire 1α与小鼠M2巨噬细胞的促炎作用有关。14,28.

由于TG是ER钙ATP酶的抑制剂，TG-GRP 94对巨噬细胞的依赖性作用可能与ER钙平衡有关。事实上，在巨噬细胞的TLR活化和炎症过程中，ER和/或细胞外间隙的钙含量增加。29,30,31,32巨噬细胞极化33。然而，单用ER膜IP3R受体激动剂卡巴胆碱对M2巨噬细胞的作用是不可缺少的。

据我们所知，这是第一次报告显示GRP 94存在于M2巨噬细胞表面。有趣的是，我们还发现了GRP 94与M2在体内的联系。我们分析了CD 206+巨噬细胞浸润小鼠三重阴性乳腺癌4T1活检，发现GRP 94存在于其膜上(如图所示)。S5)。我们认为膜GRP 94可能是M2(IL-4)细胞的一个特征。

为了更好地理解grp 94在M2中的作用，我们使用了它的特异性抑制剂pu-ws13。24...PU-WS13既不影响M2标记物，也不影响TGF-β水平，提示在我们的条件下，功能GRP 94可能不是维持M2表型在基础条件下所必需的。相反，PU-WS13通过阻止TG诱导的GRP 94分泌和促炎症标志物的增加，对TG处理的M2有明显的抑制作用。我们的结论是，分泌GRP 94可能起到促进炎症的作用。然而，PU-WS13抑制TG诱导的pSTAT 1表达，但不能恢复pSTAT 6或M2谱的抗炎标记物。GRP 94在M2中的作用不涉及其激活转化生长因子-β的客户蛋白GARP，因为GARP在M2中不表达。IC3b受体CD11b作为GRP 94的另一个客户，在M2中表达，TG诱导其表达降低。IC3b诱导巨噬细胞耐受25我们以前报道过GvHD患者血清GRP 94与补体C3/C3b相互作用。4。在这里，这种联系在巨噬细胞中得到证实。有趣的是，Dolink™PLA在M2中观察到的GRP 94-C3相互作用数低于M1，TG处理后增加。免疫荧光证实了我们的结果，表明在TG条件下，PLA中较高的C3/C3b水平和与GRP 94的共定位可以解释PLA中较多的相互作用。我们认为C3不太可能在ER中与grp 94发生相互作用，但在高尔基装置中亲C3断裂后与α链相互作用，这与gg治疗后GRP 94进入高尔基复合体的结果一致。27,34。虽然M2和TG处理的M2都分泌C3，但只有TG处理后才观察到一条与C3b相对应的条带。T淋巴细胞组织蛋白酶L切割C318。在这里，我们表明TG诱导了组织蛋白酶L的分泌，与已发表的结果一致。35,36。因此，在TG处理的条件下，C3可能主要被组织蛋白酶L细胞外裂解。此外，GRP 94与C3-C3b共沉淀于上清液中，证实了ELISA结果，提示GRP 94在裂解过程中可能与C3有关。GRP 94这样的伴侣最有可能的解释是，通过与C3的联系，它会影响组织蛋白酶的可及性。因此，我们推测在TG条件下，GRP 94是M2与C3和组织蛋白酶L共同分泌的，而组织蛋白酶-L则有利于C3的裂解，这可能是GRP 94促炎症作用的原因之一。有趣的是，我们之前发现的C3(AA 749-954)区域与GRP 94相互作用。4是结合因子H的区域，C3调节因子，也是组织蛋白酶L的辅助因子(补充图)。S6)37。此外，PU-WS13能抑制TG诱导的细胞组织蛋白酶L的减少，PLA结果表明TG有利于GRP 94与组织蛋白酶L的接近，从而证实了GRP 94与组织蛋白酶L之间的联系。

TG处理可增加CD46CYT1亚型，在Th1淋巴细胞分化中起主要作用，而CYT 2亚型主要在M2细胞上表达。TG诱导的C3裂解为C3b和C3a可能参与了所观察到的促炎症反应。事实上，c3b与CD46CYT1的结合对T细胞分泌干扰素γ的贡献是众所周知的。38并诱导小鼠巨噬细胞产生NO表达CYT 1，而不表达CYT 2。39。C3a诱导小鼠巨噬细胞产生pSTAT 1、pNFkB和TNFα，并在IL-4作用下降低M2标记物的表达。40.

最后，我们发现在M2巨噬细胞上存在iC3b，但TG处理后iC3b随CD11b的降低而降低。此外，PU-WS13处理后其含量下降，表明其存在依赖于GRP 94。

结论：GRP 94在M2(IL-4)膜上表达，而不是在TG处理的M2或M1巨噬细胞上表达，提示GRP 94可能是M2细胞的标志。膜结合的iC3b也是M2的一个标记，依赖于功能GRP 94。我们证明，TG诱导的M2内质网应激使其向促炎型转变，这既与IRE 1α的激活有关，又依赖于功能GRP 94，可能与其与C3共同分泌并促进其在细胞外介质中的激活有关。巨噬细胞在癌症、炎症和自身免疫性疾病中起着关键作用，而M2巨噬细胞抗炎功能的调节是这些疾病中的一个问题。我们的结果表明，膜GRP 94可能是M2的一个标志，它在ER应激中调节其抗炎功能的作用有助于开发新的治疗方法。在图中。8我们提出了一个整合GRP 94和补体C3参与基础条件和TG应激的M2巨噬细胞的假说模型。