实验设计与恢复期血浆输液 以达到评估sars-cov-2是否诱发T的主要目的。 FH 细胞和GC反应，我们挑战了8只成年恒河猴(4-5岁，表)。 S2 )高剂量的SARS-CoV-2(2×10) 6 PFU)。根据幼龄恒河猴的病毒动力学，我们获得了8个样本进行免疫分析。 23 ...病毒通过鼻内、气管内和眼内途径注射。用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)监测洗鼻液中病毒RNA(VRNA)的含量。在8只感染动物中，4只未接受血浆注射(感染)，2只动物在接种后24h内注入新冠肺炎恢复期人血浆(I+CP)，2只动物注入相同体积的无SARS-CoV-2抗体的正常血浆(I+NP)(图1+NP)。 1A )。我们用人IgG特异性试剂对猴血清进行了注射抗体的检测，发现CP输注可明显增强SARS-CoV-2中抗棘和核衣壳蛋白的结合抗体滴度(如图2所示)。 1B )。然而，虽然混合CP的中和效价为1：1,149，但由于输液后估计稀释50倍(以4ml/kg输注量和~20%胞外液为基础)，24小时后猕猴血清中和活性低于中和试验的检测范围(1：40)(图一)。 1C )。SARS-CoV-2结合抗体测定显示抗S1-IgG浓度为24.5 g/ml，为SARS-CoV-2中和提供了抗S1 IgG的下限(图一)。 1C )。与缺乏中和活性相一致，CP给药并没有降低急性病毒载量，所有动物均观察到较高的vRNA水平(如图所示)。 1D )。肺组织病理证实感染动物多灶性局部广泛性间质性肺炎轻至中度(图) S1a )。然而，这些组织学改变并没有伴随发烧、体重减轻或任何其他临床疾病的迹象(图)。 S1B )。没有一只动物出现急性呼吸窘迫。总之，健康成年恒河猴感染SARS-CoV-2可导致高的病毒血症，但一般没有临床疾病的明显迹象，为研究保护性免疫反应的发展提供了一个框架。
图1：实验设计与恢复期血浆灌注。 A 接种严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)的恒河猴，注入新冠肺炎恢复期血浆(I+CP)、正常血浆(I+NP)或不接受血浆(感染)。 B CP输注后人抗S1、S2和N IgG抗体浓度的变化。 C 混合CP输注前抗S1、S2和N人IgM和IgG抗体的浓度。CP输注前及输注后混合猕猴血清的伪病毒中和作用。 D 鼻腔冲洗中的平均病毒RNA(+SD)(来自独立动物的动力学数据，实验组样本大小： n =4人感染， n =2I+CP，和 n =2I+NP)。
Sars-cov-2感染导致天然免疫反应迅速而短暂的改变，并增加外周血中CD4 T滤泡辅助细胞的数量。 外周血天然免疫细胞亚群的评价(图一)。 2A )显示中性粒细胞的比例或绝对计数在一段时间内均无显著变化(图1)。 2B )。然而，在特定的髓系细胞亚群中观察到了迅速和不同的变化。虽然CD 14+ CD 16 + 促炎单核细胞在第2天显著增加，Cx3CR1的表达也相应增加(图) S1C )外周血pDC下降。我们还注意到感染组内髓样DC(MDC)明显增加。促炎性趋化因子单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、干扰素γ诱导蛋白-10(IP-10)、干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)在第2天显著升高，并很快恢复到基线水平(图1)。 2C )。我们没有观察到促炎症细胞因子白介素(IL)-6的显著升高.在感染过程中，我们观察到血清MCP-1水平与促炎单核细胞之间存在直接关系，而pDC和中性粒细胞频率分别与I-TAC和IL-8水平呈负相关(图一)。 二维空间 )。虽然IL-6或IL-10的变化无统计学意义，但两种细胞因子在感染过程中均存在相关性。暴露于SARS-CoV-2后的活跃和短暂的天然免疫动力学与体重、血氧饱和度和轻度整体疾病病理的微小变化相一致。观察到全身性IL-6缺乏增加，这与严重的新冠肺炎有关。 25 ，可能是在我们的动物身上观察到的无症状/轻微疾病的基础。
图2：SARS-CoV-2感染导致外周血天然免疫反应迅速而短暂的改变. A 单细胞门控后全血天然免疫亚群的代表性门控策略。荧光染色质为CD3/CD20-APC-Cy7、CD14-A700、CD8-BUV 805、CD 66-APC、HLA-DR-BV 786、CD16-BV605、CD 123-BV421、CD11c-Pe-Cy7。 B 天然免疫反应动力学(促炎症单核细胞；* p =0.01在d2和d4相对d0使用单尾配对 t 在受感染的动物身上进行测试** p 在d2和d4时，输注动物的pDC=0.006和0.002，相对于d0；** p =0.005在d2相对d0使用单尾配对 t 在受感染的动物身上进行测试* p =0.01在d2相对d0使用单尾配对 t 输注动物试验，MDCS；* p =0.02在d2相对d0使用单尾配对 t 在受感染的动物身上进行测试)。 C 血清趋化因子单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、干扰素γ诱导蛋白(IP)-10和干扰素诱导T细胞α趋化蛋白(I-TAC)(MCP-1；**) p =0.001表示感染和** p =0.005，用于d2相对d0的单尾配对注入。 t 测试，IP-10；* p =0.03表示感染和* p =0.0008，用于d2相对d0的单尾配对注入。 t 测试，ITAC；* p =0.0005表示感染和* p =0.0007，用于d2相对d0的单尾配对注入。 t 测试)。 D 趋化因子天然免疫细胞与白细胞介素(IL)-10与IL-6(双尾皮尔逊试验)的相关性 p 给出了最佳拟合线95%的置信带。
评估CD4 T增加 FH 细胞可归因于SARS-CoV-2，我们分析了外周血以捕捉效应T细胞反应.没有观察到一般淋巴减少的证据(图) S1D )。活化CXCR 5的频率和绝对计数 + CD4 T FH 通过Ki-67和PD-1的共同表达，所有动物细胞在第7天均显著增加，而不受血浆干预(图1所示)。 3A，B )。在效应反应的顶端，Ki-67 + CD4 T细胞，特别是T细胞 h 1而不是T FH 亚群与CD8 T细胞增殖密切相关(图1)。 3C )。反过来，我们观察到sars-cov-2 vrna与鼻腔冲洗液中的sars-cov-2 vrna与增殖(ki-67)之间的关联，证明了CD8 T细胞的强抗原依赖性诱导 + )CD8 T细胞。
图3：SARS-CoV-2感染增加了外周血CD4 T滤泡辅助细胞的数量. A 典型的门控策略捕捉全血中表达Ki-67和程序性死亡-1(PD-1)的CD4 T细胞。荧光染色剂为CD3-A 700、CD 20/Dead-APC-Cy7、CD8-BUV 805、CD4-BV 650、CD 95-BUV 737、CXCR 5-PE、Pd-1-Pe Cy7、Ki-67-A 488、CXCR3-BV 786、CCR6-PECF 594、CCR4-BV605、SLAM-A 488、CX3CR1-PECF594、CD28-Pe-Cy7、CCR7-BV711、ICOS-BV786。 B 动力学显示Ki-67的频率和绝对计数。 + Pd-1 + CD4 T滤泡辅助细胞(T) FH )细胞(占T细胞的百分比) FH 细胞；* p =0.01在d4和d7相对于d0感染和** p =d7=0.002，相对于d0，用于注入单尾配对。 t 试验，绝对T FH 细胞计数；** p =0.003在d4和** p =0.0086在d7相对于d0感染和** p =d7=0.003，相对于d0，用于注入单尾配对。 t 测试一下。数据来自于一次全血的实时纵向染色) C Ki-67相关图 + 抗Ki-67的CD8 T细胞 + CD4亚群和病毒(V)RNA(全天第7天)(双尾皮尔逊试验) p 所示值。给出了最佳拟合线的95%置信带。 D 基于CD4 Ki-67流式细胞术数据的t分布随机邻居嵌入(Tsne)图 + 感染事件(16,197起)和感染+注射动物事件(22,406起)；点图显示Ki-67的频率 + CD4 T细胞亚群。( E –F )直方图和中位荧光强度(MFI)点图，显示了信号淋巴细胞活化分子(SLAM)、CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)、CD 28和C-C趋化因子受体7型(CCR 7)在外周血单个核细胞(PBMCs)中的相对表达。 n =7)。独特的符号识别每个实验组中的动物。
对感染引起的CD4 T细胞分化在第7天的变化的评估显示，CD4 T细胞向T细胞的表型有了很强的转变。 h 1个效应器(CXCR 3) + )，T h 1极化T FH 细胞(CXCR 3) + CXCR 5 + )和T h 1吨 h 17(CXCR 3) + CCR 6 + CD4 T细胞，如用流动数据构建的tSNE图所示(图1)。 三维空间 ，图 S2A )。相应地，数据显示CD4 T蓄积。 h 第7天1个牢房(图) S2B )。尽管T h 2 CD4细胞在第7天未见高峰，T细胞增多。 h 17个CD4细胞(图) S2C，D )。利用急性激活标记物诱导共刺激物(Icos)鉴定增殖(Ki-67)。 + )第7天CD4 T细胞。 3E )，我们发现ICOS + CXCR 5 − 和CXCR 5 + CD4 T细胞亚群表达T细胞 h 1标记信号淋巴细胞粘附分子(SLAM)诱导T细胞活化 26 ，我们已经表明，它也是用T表示的。 h 1吨 FH 细胞 13 免疫后，Fractalkine受体CX3CR1，a T h 1标记物，与其活化状态一致(图1)。 3F )。尽管激活的T增加了 FH 细胞，cxcl 13水平在sars-cov-2感染后没有显著增加(图) S2E )。都不是ICOS + CXCR 5 − 或CXCR 5 + CD4 T细胞亚群下调CD 28，这两种细胞表达CCR 7的水平与幼稚细胞相当或大于幼稚细胞，表明有淋巴结归巢表型。为了评估CD4 T细胞的功能，在体外用PMA和离体霉素刺激细胞因子。我们发现了两种不同的CD4 T细胞--一种脱颗粒的CD107a+b细胞，大部分脱颗粒的CD4 T细胞表达干扰素γ(IFNγ)和tnfa，而不是IL-2或IL-17；以及一种产生IL-21的亚群(图)。 S2F )。相反，大多数IL-21表达细胞产生IL-2、IL-17，同时产生TNFa和IFNγ.因此，在SARS-CoV-2感染过程中，CD4-T细胞多功能被保留.
CD4 T FH SARS-CoV-2感染后产生了针对S蛋白和核衣壳蛋白的细胞。 基于系统性CD4 T的显著增加 FH SARS-CoV-2暴露后的细胞，我们试图了解脾脏在GC期的免疫反应.为此，我们量化了GC T。 FH 死亡时脾脏中的细胞，并将其与未接触SARS-CoV-2的动物机会性尸检中的脾细胞值进行比较。结果提示感染后脾脏内发生GC反应(图)。 S3A )。我们观察到大部分GC T FH 细胞不表达Foxp 3，表明GC T FH GC T滤泡调节细胞(T细胞)占主导地位 Fr； CXCR 5 + ，pd-1 ++ 、Foxp 3 + )子集(图) S3B ，Tregs被定义为CD 95。 + CXCR 5 − Foxp 3 + )。为了全面评估SARS-CoV-2诱导的反应，我们用覆盖S、N和膜(M)蛋白中多个T细胞表位的巨apools重叠肽刺激冷冻脾细胞，并跨越SARS-CoV-2的开放阅读框(ORF 1，3a，8)。以PMA/Ionomycin为阳性对照，二甲基亚砜(DMSO)处理细胞为阴性对照。激活诱导标记法(AIM) 27 根据OX 40和CD 25的共同表达，鉴定了SARS-CoV-2特异性CD4 T细胞。 4A )。在DMSO处理的细胞中减去AIM+反应后，检测到CD4 T细胞对S和N的反应。此外，PD-1 ++ GC T FH 细胞对S、N和M的反应性表现为SARS-CoV-2诱导的脾GC反应(图一)。 4B ).
图4：CD4 T FH SARS-CoV-2感染后，淋巴组织产生靶向棘(S)和核衣壳(N)的细胞. A 典型的门控策略是CD3-A700、Dead-APC-Cy7、CD8-BV 510、CD4-BV 650、CD 95-BUV 737、CXCR5-PE、PD-1-Pe Cy7、CD 25-APC、OX40-BV 786、IFNG-Pe-Cy7、TNFa-A488、CXCR5-PE、PD-1-Pe Cy7、CD 25-APC、OX 40-BV 786、IFNG-Pe-Cy7、TNFa-A488、CD8-BV 510、CD4-BV 650、CD 95-BUV 737、CXCR5-PE、PD-1-Pe Cy7、CD 25-APC、OX40-BV 786、IFNG-Pe-Cy7、TNFa-AIL-488、-17-BV421、21- B 散点图显示活化诱导标记(AIM)+CD4亚群。虚线表示无法检测到的响应，指定值为0.01%。 C CXCR 5细胞因子谱(干扰素γ、白细胞介素2、肿瘤坏死因子a、白细胞介素17、白细胞介素21)的门控策略 + 、CXCR 5-和CD8 + CD 95 + T细胞)。 D 饼图显示T细胞多功能。
然而，应该指出的是，在sars-cov-2未暴露的动物的机会性身体的脾细胞中也检测到了对S、N、M的反应，这意味着与地方性冠状病毒交叉反应的T细胞，正如在人类中所报道的那样。 17 ,28 。事实上，已记录到hcov-nl 63对群养恒河猴的自然感染。 29 。关于疫苗的结果，这些交叉反应的T细胞是否能够在体内识别和增强对sars-cov-2感染的细胞的效应反应是高度相关的，因为预先存在的交叉反应T细胞可能会影响疫苗的效力。
免疫组化法检测脾CD4 T细胞多功能对PMA/Ionomycin刺激的影响显示CXCR 5 + CD4 T细胞与CXCR 5明显不同 − 它们共同产生干扰素γ、IL-2、TNFa和IL-21的能力。相反，CXCR 5 − 亚群产生的白细胞介素-21很少，但能够共同产生IL-2和TNFa，或者，或者，干扰素γ，IL-2，或TNFa。相反，CD8 T细胞主要是干扰素γ产生者。 4C，D )。未感染动物的T细胞表现出类似的多功能表现，说明SARS-CoV-2感染并没有改变T细胞的多功能特征以刺激有丝分裂。我们还发现了中等频率的干扰素γ和tnfa产生sars-cov-2特异性CD4 T。 FH 脾脏细胞(图) S3C，D 与脾脏数据一致的是，在第7天，外周血中也出现了针对S和N的抗原特异性反应(图1)。 5A，B )。这些数据表明，S和N特异性CD4 T FH SARS-CoV-2感染后细胞产生.
图5：CD4 T FH SARS-CoV-2感染后血中以棘(S)和核衣壳核(N)为靶点的细胞。 A PBMCS和N肽池刺激SARS-CoV-2特异性CD4 T细胞的代表性门控策略。 B AIM+CXCR 5 − 和CXCR 5 + 第7天PBMC CD4亚群。
SARS-CoV-2感染引起纵隔淋巴结GC反应 已证实sars-cov-2刺激CD4 T的产生。 FH 细胞，我们接下来评估T h 1在肺内诱导CD4 T细胞。胶原酶消化后，从肺分离出的单个细胞悬液用一组标记物染色，以勾画活化的CD4 T细胞。我们检测了颗粒酶B和pd-1，这两种抗原诱导的活化标志；粘膜归巢受体a的表达。 4 ß7 、CCR 6和T h CD 69中的1受体CXCR 3 + 和CD 69 − CD4和CD8-T细胞亚群(图)。 6A )。颗粒酶B、Pd-1和CXCR 3在肺CD4 T细胞中的表达模式为T。 h 1效应细胞CD4反应与肺实质CD8 T细胞效应的证据一致(图1)。 6B )。我们还观察到颗粒酶B的比例 + 和PD-1 + CD8 T细胞与鼻腔病毒载量相关，表明抗原驱动的CD8 T细胞在肺内扩张(如图所示)。 6C )。此外，肺组织病理学显示支气管相关淋巴组织的发育(图)。 S4A )证实了适应性免疫反应的诱导。纵隔淋巴结大体检查与淋巴结肿大一致(图) S4B )。相应地，H&E染色的纵隔淋巴结切片显示苍白的GCs明显丰富(图)。 S4C )。福尔马林固定淋巴结切片显示CD3免疫染色 + Pd-1-表达细胞(图. 7A ，E，I)定位于由CD 20组成的淋巴滤泡 + Bcl-6 + 细胞(图1. 7A、e、d 证实SARS-CoV-2感染后纵隔淋巴结存在GCs。为了定量评估gc反应，我们从淋巴结和染色细胞中提取了单细胞悬液，并用一组标记物来定义gct。 FH 细胞，GC B细胞，滤泡树突状细胞(FDC)。如图所示，纵隔淋巴结显示出明显的CXCR 5。 + Pd-1 ++ GC T FH 子集与Bcl-6 + CD 95 + CD 20 + GC B细胞(图1. 7b )。根据补体受体CD 21的表达鉴定FDC(克隆B-Ly4；图) S5A )，在CD 45中 − CD3 − CD 20 − 细胞群体 30 。FDC的数量与胃癌B细胞和胃癌T细胞的频率密切相关。 FH 单元格(图) S5B ).
图6：T的诱导 h 1 SARS-CoV-2感染时肺部CD4效应因子。 A CD 95的选通策略 + CD 69 + CD4和CD8细胞表达颗粒酶B、PD-1、α4β7、CCR 6和CXCR 3。荧光染色剂为CD45-A 488、CD3-A 700、CD 20/Dead-APC-Cy7、CD8-BUV 805、CD4-BV 650、CD 95-BUV 737、CD 69-BV 711、颗粒酶B-BV 421、Pd-1-Pe Cy7、a4b7-PE、CD 25-APC、CCR6-PECF 594、CXCR3-BV786。 B 肺和血中颗粒酶B、PD-1、CXCR 3和CCR 6表达的CD4和CD8 T细胞百分比(*) p =0.02使用双尾Mann-Whitney U 测试)。 C 洗鼻液vRNA与CD8 T细胞颗粒酶B(GzmB)或pd-1的相关性分析(一尾Pearson试验) p 所示值)。
图7：SARS-CoV-2感染引起纵隔淋巴结的生发中心反应. A 具有代表性的CD3、PD-1、CD 20、Bcl-6多色免疫荧光显像及DAPI染色在纵隔淋巴结中的应用。分别用CD3/Pd-1和CD 20/Bcl-6/CD3染色观察生发中心(GC)T。 FH 分别为细胞和胃癌B细胞。(a-d)显示GC B细胞的图像和(f-i)显示GC T的图像 FH 细胞从(E)中的白色盒子中放大，用一个×20的目标来收集。(D)合并图像显示CD 20+Bcl-6+GC B细胞，(I)图像显示CD3+PD-1+GC T。 FH 细胞。(E)标尺为100 m，其余为25m，粉红色CD3染色为伪色(原红色)，与Bcl-6鉴别。 B 鉴别滤泡树突状细胞(FDC)、生发中心B细胞(GC B)和生发中心T的代表性门控策略 FH 细胞(GC T) FH 纵隔淋巴结中CD45-A 488、CD3-A 700、CD20-BV 421、Dead-BV 510、CD8-BUV 805、CD4-BV 650、CD 95-BUV 737、CXCR 5-PE、Pd-1-Pe-Cy7、Bcl-6-APC-Cy7、CD140b-APC、CD21-PECF 594、CXCR3-BV786。 C Bcl-6、CD 21、CD 140 b和CXCR 3的中位荧光强度。 D GC T频率 FH 纵隔淋巴结中的细胞、GC B细胞、FDC显著增高(Med，数据来源： n =8只独立动物(GC T) FH p =0.007，* p =0.01)相对于颈部淋巴结(CLN，数据显示 n =8只独立动物)和肠系膜淋巴结(MES，数据来自 n =7只独立动物)，采用双尾Wilcoxon配对签名秩检验，GC B细胞；* p =0.04采用双尾Wilcoxon匹配-对符号秩检验； p =0.039使用双尾Wilcoxon匹配-对符号秩检验。水平线表示中值。 E 大多数GC T FH 纵隔淋巴结细胞表达CXCR 3(GC T) FH 和T FH p =0.007，* p =0.01，以及mTfh* p =0.01相对于CLN和MES，采用双尾Wilcoxon匹配-对符号秩检验).显示的数据来自 n =Med、CLN和8只独立动物 n =7只为MES的独立动物。水平线表示中值。
对典型gc标记表达的定量分析表明，bcl-6完全由gcb细胞表达，而在较小程度上由gct表达。 FH 细胞(图1. 7C )。FDC标记物CD 21和血小板源性生长因子受体b(CD 140 B) 31 也用GC T来表达。 FH 和B细胞。T的表达增加 h 1-趋化因子受体CXCR 3对GC T的作用 FH 细胞与对病毒感染反应的细胞表型一致。虽然胃癌B细胞在CXCR 3表达上表现出异质性，但FDC对该标记的表达均为阴性。GC T增加 FH 、GC B细胞和FDC。 7D CXCR 3在纵隔淋巴结中的相对表达高于颈淋巴结和肠系膜淋巴结，提示对病毒感染有积极的免疫应答(图一)。 7E , S5C )。GC T的功能分析 FH PMA/Ionomycin刺激后纵隔淋巴结细胞CD40L表达增强。 + 干扰素γ + GC T中的细胞 FH 舱室，与T相一致 h 纵隔淋巴结内1种表型(图) S5D ).
了解CXCR 3在GC T中的表达方式 FH 细胞可能影响CXCR 3的定位和辅助电位，我们对CXCR 3进行了表型表征。 − 和CXCR 3 + GC T FH SARS-CoV-2感染后的细胞(见图)。 8A-C )。数据显示CXCR 5和CCR 7具有同等的表达，CCR 7是控制两种CXCR 3卵泡定位的关键受体。 − 和CXCR 3 + 子集 32 。此外，这两个子集在每个细胞基础上表达的CD 69的水平是相当的.与PT中的观察结果一致 FH 细胞，SLAM在CXCR 3中的表达较高。 + GC T FH 子集 13 。ICOS在CXCR 3中的表达与CXCR 3相当。 + GC T FH 细胞表达较高水平的CD 28。PMA/离子霉素刺激后的功能分析显示CXCR 3 + GC T FH 细胞表达较高水平的干扰素γ，并可与CD40L和IL-21的表达相媲美。 8C )。类似于脾脏和外周血单个核细胞的反应，gct对sars的特异性反应。 FH 纵隔淋巴结可见细胞。 8D )。这些数据表明sars-cov-2感染可引起gct。 FH 其他健康恒河猴的细胞。
图8：SARS-CoV-2感染诱导了纵隔淋巴结中针对棘(S)和核衣壳(N)的生发中心反应. A CXCR 5、CCR 7、CD 69和CD 69的中位荧光强度(MFI) B CXCR 3中的SLAM、ICOS、CD 28 - (橙色)和CXCR 3 + (洋红)GC T FH SARS-CoV-2感染后脾脏细胞。脾脏幼稚CD4 T细胞比较(灰色)(SLAM；*) p < 0.0001 CXCR3+ relative to naive and CXCR3− using a paired two-tailed t 测试，CD 28；** p =0.001 CXCR 3+子集相对于朴素和CXCR 3-使用一对双尾 t 测试) C Pma/Ionomycin刺激后，CD40L、IFNγ和IL-21在GC T中的表达 FH 子集。未受刺激的细胞呈灰色(IFNG；**) p =0.0012 cxr 3+相对于cxr 3−使用一对双尾 t 测试)。盒子-胡须图显示数据的范围，框的界限从第25百分位数延伸到第75百分位数，盒子中的线是在中间位置绘制的。 D Pd-1流动图 + CXCR 5 + TFH AIM+细胞在棘波刺激(S)后表现为AIM+细胞；散点图显示GC T的特异性 FH 细胞与CXCR 5 − 细胞对SARS-CoV-2S和核衣壳蛋白(N)的反应及对PMA/离子霉素的反应。CD 95-幼稚CD4 T细胞显示作比较。虚线表示分配给0.01%的无法检测的响应。黑色方格表示SARS-CoV-2未暴露的动物。所使用的荧光染料是CD40L-APC；如以前的面板所述。
对sars-cov-2的体液反应以IgG抗体为主。 对S和N蛋白的早期抗体反应的动力学和抗体的贡献亚型，特别是在轻度或无症状的临床疾病的情况下，还没有得到明确的定义。在此，我们量化了S1、S2和N抗原的血清抗体浓度，并使用一种针对猕猴IgG的次级抗体来区分新的IgG抗体和被动注入的人CP IgG抗体。数据显示，感染后第7天，所有动物的IgM和IgG血清转化为S1和S2蛋白，只有一只动物例外(图一)。 9A，B )。这与有报道称大多数感染2002年sars或cov-2的人血液中同时出现S或rbd特异性IgG和gm抗体的情况是一致的。 33 ,34 ,35 。据报道，人类对N蛋白的抗体应答在发病10天后增加。 36 ,37 有趣的是，在所有猕猴中，N特异性IgG在第7天都很明显，但在大多数动物中，N特异性IgM直到第10天才显著升高(比基线值高出3倍)。此外，50%的动物在感染后10天内未能对所有SARS-CoV-2蛋白表现出显著的IgA反应(图一)。 9C )。然而，我们应该注意到，对一些尸检血清的分析表明，IgA抗体在第10天后继续增加。 S5E ).
图9：对SARS-CoV-2的体液反应以IgG抗体为主. 浓度 A IGM， B IgG，和 C Bama或ELISA检测血清中S1、S2和N蛋白特异性IGA抗体(Ab)。虚线表示所有动物感染前(第0天)浓度的中位数。独特的符号识别每个实验组中的动物。(**) p =0.007，* p =0.015，在指示的时间点相对d0使用wilcoxon匹配-对符号-秩二尾。 t 测试)。
对未接受CP血浆的动物感染后抗体反应程度的评估清楚地表明，IgG对所有SARS-CoV-2蛋白的体液反应起主导作用(图一)。 10A )，IgG 1是最主要的亚型。 10b )。在第10天，我们观察到S1特异性IgG和IgM之间以及N特异性IgA和IgG之间有很强的相关性。 10C )。伪病毒nabs的范围从82到1754，比一些研究报告的要高。 23 8只动物中有2只血清中的中和活性大于1：1000，提示了体液免疫应答的产生。我们观察到中和抗体滴度与第10天抗RBD IgG抗体浓度之间存在很强的相关性(图1)。 10C )。此外，T的比例 h 1吨 FH 第7天的效应细胞可预测第10天的抗RBD IgG浓度(如图所示)。 10C )。这些数据一起显示了SARS-CoV-2感染后在轻度或无临床症状的情况下，结合抗体和中和抗体的发展。抗病毒IgG抗体在第7天出现并延迟诱导IgA反应，提示SARS-CoV-2感染后可发生早期转诊，且可能是T促进的。 h 1型T FH 细胞。然而，应该注意的是，黏膜IgA反应可以以T无关的方式诱导。 38
图10：SARS-CoV-2感染后IgG 1亚类和中和抗体。 A 每只动物感染后第0天的抗体浓度除以第0天时测定的抗体反应增加一倍。显示的数据如下n =8只动物在所有时间点。水平线表示中位 B IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4抗S1、S2、N抗体增加一倍，IgG 1亚类抗体以IgG 1亚类抗体为主。所显示的数据为 n =6只未给予CP的动物。 C ELISA法检测血清S1特异性IgG、IgM、N特异性IgA、IgG水平与伪病毒中和抗体滴度及抗受体结合域IgG抗体的相关性。独特的符号识别每个实验组中的动物(两尾皮尔逊试验) p 所示值；抗RBD IgG与T的相关性 h 1吨 FH 细胞显示单尾Spearman试验 p 价值)。
