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SARS-CoV-2诱导恒河猴生发中心CD4 T滤泡辅助细胞应答

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发表时间:2021-01-25 10:05作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

CD4 T滤泡助手(T)FH细胞对于产生抗病毒感染的持久和特异的体液保护是很重要的。SARS-CoV-2感染产生T的程度FH细胞和刺激生发中心(GC)反应是一个重要的问题,因为我们研究疫苗诱导的免疫新冠肺炎。在此,我们报告了sars-cov-2感染在恒河猴体内,无论是注入恢复期血浆、正常血浆,还是不接受输液,都会导致促炎单核细胞的短暂积聚和T细胞的增殖。FHT细胞h1外周血标本。CD4辅助细胞反应主要向T方向倾斜h1血、肺、淋巴结反应。SARS-CoV-2感染诱导的GC TFH细胞特异性为SARS-CoV-2棘和核衣壳蛋白,并有相应的抗病毒血清IgG抗体出现。综合来看,这些数据显示了在温和新冠肺炎的恒河猴模型中GC反应的诱导作用。

导言

自2020年3月11日宣布新冠肺炎大流行以来,该病毒在全球迅速传播,导致超过5 000万人感染,100多万人死亡。1。虽然sars-cov-2在大多数情况下会引起轻微或无症状的疾病。2感染后意外并发症,如多系统炎症综合征,构成严重威胁。3。一种有效的疫苗是最重要的,几种sars-cov-2疫苗的候选品种正处于世界各地人体试验的不同阶段。4,5,6。最有效的疫苗可以诱导抗体提供长期的保护。7因此,了解sars-cov-2感染的免疫机制,是选择一种具有抗大流行能力的疫苗的基础。8,9.

CD4 T滤泡辅助细胞(T)产生持续性免疫FH)。T型FH细胞是CD4辅助细胞的一个子集,具有迁移到生发中心(GC)结构的特殊能力。GC-B细胞依赖T细胞FH细胞共刺激和细胞因子,以生存、增殖和分化为记忆B细胞或浆细胞,这是保护性免疫的关键方面。10。我们和其他人已经证明了外周CD4 TFH细胞预测HIV和流感疫苗的抗体持久性11,12,13。虽然对人类的研究表明T的诱导FH新冠肺炎患者的细胞14,15,16,SARS-CoV-2感染对GC T产生的影响FH细胞目前尚不清楚。这是一个有害的知识差距,因为了解早期相关的持久抗体,特别是那些在外周血中循环的抗体,将有助于最终选择有效的疫苗候选。在恢复期患者外周血中观察到sars-cov-2特异性CD4 T细胞对尖峰蛋白的反应。17,18。对于2002年的sars-cov病毒也进行了类似的观察。19,20,在小鼠模型上的研究已经证明了CD4 T细胞在病毒清除中的关键作用。21。这些数据共同强调了理解CD4 T的必要性。FHSARS-CoV-2感染后的反应。

因为感染sars-cov-2的健康恒河猴能够立即抵抗病毒的再次攻击。22,23,24,我们假设了解CD4 TFH而接触SARS-CoV-2后的GC反应将为理解免疫保护机制提供一个框架。我们在一项研究的背景下验证了这一假设,该研究旨在检查恢复期血浆输液在抑制新生感染方面的治疗效果。虽然血浆输注不会影响病毒载量,但我们报告称,感染sars-cov-2后,成年恒河猴出现短暂的活化增殖T积累。FHT细胞h1外周血1型。也许更相关的是sars-cov-2作为一种呼吸道病毒,感染会激发出与sars-cov-2-反应性T相结合的健壮的gcs。FH纵隔淋巴结内的细胞。在一个受控制的轻度疾病动物模型中的综合免疫分析增加了我们对SARS-CoV-2的免疫反应的理解。

结果

实验设计与恢复期血浆输液

以达到评估sars-cov-2是否诱发T的主要目的。FH细胞和GC反应,我们挑战了8只成年恒河猴(4-5岁,表)。S2)高剂量的SARS-CoV-2(2×10)6PFU)。根据幼龄恒河猴的病毒动力学,我们获得了8个样本进行免疫分析。23...病毒通过鼻内、气管内和眼内途径注射。用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)监测洗鼻液中病毒RNA(VRNA)的含量。在8只感染动物中,4只未接受血浆注射(感染),2只动物在接种后24h内注入新冠肺炎恢复期人血浆(I+CP),2只动物注入相同体积的无SARS-CoV-2抗体的正常血浆(I+NP)(图1+NP)。1A)。我们用人IgG特异性试剂对猴血清进行了注射抗体的检测,发现CP输注可明显增强SARS-CoV-2中抗棘和核衣壳蛋白的结合抗体滴度(如图2所示)。1B)。然而,虽然混合CP的中和效价为1:1,149,但由于输液后估计稀释50倍(以4ml/kg输注量和~20%胞外液为基础),24小时后猕猴血清中和活性低于中和试验的检测范围(1:40)(图一)。1C)。SARS-CoV-2结合抗体测定显示抗S1-IgG浓度为24.5 g/ml,为SARS-CoV-2中和提供了抗S1 IgG的下限(图一)。1C)。与缺乏中和活性相一致,CP给药并没有降低急性病毒载量,所有动物均观察到较高的vRNA水平(如图所示)。1D)。肺组织病理证实感染动物多灶性局部广泛性间质性肺炎轻至中度(图)S1a)。然而,这些组织学改变并没有伴随发烧、体重减轻或任何其他临床疾病的迹象(图)。S1B)。没有一只动物出现急性呼吸窘迫。总之,健康成年恒河猴感染SARS-CoV-2可导致高的病毒血症,但一般没有临床疾病的明显迹象,为研究保护性免疫反应的发展提供了一个框架。

图1:实验设计与恢复期血浆灌注。

A接种严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)的恒河猴,注入新冠肺炎恢复期血浆(I+CP)、正常血浆(I+NP)或不接受血浆(感染)。BCP输注后人抗S1、S2和N IgG抗体浓度的变化。C混合CP输注前抗S1、S2和N人IgM和IgG抗体的浓度。CP输注前及输注后混合猕猴血清的伪病毒中和作用。D鼻腔冲洗中的平均病毒RNA(+SD)(来自独立动物的动力学数据,实验组样本大小:n=4人感染,n=2I+CP,和n=2I+NP)。

Sars-cov-2感染导致天然免疫反应迅速而短暂的改变,并增加外周血中CD4 T滤泡辅助细胞的数量。

外周血天然免疫细胞亚群的评价(图一)。2A)显示中性粒细胞的比例或绝对计数在一段时间内均无显著变化(图1)。2B)。然而,在特定的髓系细胞亚群中观察到了迅速和不同的变化。虽然CD 14+CD 16+促炎单核细胞在第2天显著增加,Cx3CR1的表达也相应增加(图)S1C)外周血pDC下降。我们还注意到感染组内髓样DC(MDC)明显增加。促炎性趋化因子单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、干扰素γ诱导蛋白-10(IP-10)、干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)在第2天显著升高,并很快恢复到基线水平(图1)。2C)。我们没有观察到促炎症细胞因子白介素(IL)-6的显著升高.在感染过程中,我们观察到血清MCP-1水平与促炎单核细胞之间存在直接关系,而pDC和中性粒细胞频率分别与I-TAC和IL-8水平呈负相关(图一)。二维空间)。虽然IL-6或IL-10的变化无统计学意义,但两种细胞因子在感染过程中均存在相关性。暴露于SARS-CoV-2后的活跃和短暂的天然免疫动力学与体重、血氧饱和度和轻度整体疾病病理的微小变化相一致。观察到全身性IL-6缺乏增加,这与严重的新冠肺炎有关。25,可能是在我们的动物身上观察到的无症状/轻微疾病的基础。

图2:SARS-CoV-2感染导致外周血天然免疫反应迅速而短暂的改变.

A单细胞门控后全血天然免疫亚群的代表性门控策略。荧光染色质为CD3/CD20-APC-Cy7、CD14-A700、CD8-BUV 805、CD 66-APC、HLA-DR-BV 786、CD16-BV605、CD 123-BV421、CD11c-Pe-Cy7。B天然免疫反应动力学(促炎症单核细胞;*p=0.01在d2和d4相对d0使用单尾配对t在受感染的动物身上进行测试**p在d2和d4时,输注动物的pDC=0.006和0.002,相对于d0;**p=0.005在d2相对d0使用单尾配对t在受感染的动物身上进行测试*p=0.01在d2相对d0使用单尾配对t输注动物试验,MDCS;*p=0.02在d2相对d0使用单尾配对t在受感染的动物身上进行测试)。C血清趋化因子单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、干扰素γ诱导蛋白(IP)-10和干扰素诱导T细胞α趋化蛋白(I-TAC)(MCP-1;**)p=0.001表示感染和**p=0.005,用于d2相对d0的单尾配对注入。t测试,IP-10;*p=0.03表示感染和*p=0.0008,用于d2相对d0的单尾配对注入。t测试,ITAC;*p=0.0005表示感染和*p=0.0007,用于d2相对d0的单尾配对注入。t测试)。D趋化因子天然免疫细胞与白细胞介素(IL)-10与IL-6(双尾皮尔逊试验)的相关性p给出了最佳拟合线95%的置信带。

评估CD4 T增加FH细胞可归因于SARS-CoV-2,我们分析了外周血以捕捉效应T细胞反应.没有观察到一般淋巴减少的证据(图)S1D)。活化CXCR 5的频率和绝对计数+CD4 TFH通过Ki-67和PD-1的共同表达,所有动物细胞在第7天均显著增加,而不受血浆干预(图1所示)。3A,B)。在效应反应的顶端,Ki-67+CD4 T细胞,特别是T细胞h1而不是TFH亚群与CD8 T细胞增殖密切相关(图1)。3C)。反过来,我们观察到sars-cov-2 vrna与鼻腔冲洗液中的sars-cov-2 vrna与增殖(ki-67)之间的关联,证明了CD8 T细胞的强抗原依赖性诱导+)CD8 T细胞。

图3:SARS-CoV-2感染增加了外周血CD4 T滤泡辅助细胞的数量.

A典型的门控策略捕捉全血中表达Ki-67和程序性死亡-1(PD-1)的CD4 T细胞。荧光染色剂为CD3-A 700、CD 20/Dead-APC-Cy7、CD8-BUV 805、CD4-BV 650、CD 95-BUV 737、CXCR 5-PE、Pd-1-Pe Cy7、Ki-67-A 488、CXCR3-BV 786、CCR6-PECF 594、CCR4-BV605、SLAM-A 488、CX3CR1-PECF594、CD28-Pe-Cy7、CCR7-BV711、ICOS-BV786。B动力学显示Ki-67的频率和绝对计数。+Pd-1+CD4 T滤泡辅助细胞(T)FH)细胞(占T细胞的百分比)FH细胞;*p=0.01在d4和d7相对于d0感染和**p=d7=0.002,相对于d0,用于注入单尾配对。t试验,绝对TFH细胞计数;**p=0.003在d4和**p=0.0086在d7相对于d0感染和**p=d7=0.003,相对于d0,用于注入单尾配对。t测试一下。数据来自于一次全血的实时纵向染色)CKi-67相关图+抗Ki-67的CD8 T细胞+CD4亚群和病毒(V)RNA(全天第7天)(双尾皮尔逊试验)p所示值。给出了最佳拟合线的95%置信带。D基于CD4 Ki-67流式细胞术数据的t分布随机邻居嵌入(Tsne)图+感染事件(16,197起)和感染+注射动物事件(22,406起);点图显示Ki-67的频率+CD4 T细胞亚群。(EF)直方图和中位荧光强度(MFI)点图,显示了信号淋巴细胞活化分子(SLAM)、CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)、CD 28和C-C趋化因子受体7型(CCR 7)在外周血单个核细胞(PBMCs)中的相对表达。n=7)。独特的符号识别每个实验组中的动物。

对感染引起的CD4 T细胞分化在第7天的变化的评估显示,CD4 T细胞向T细胞的表型有了很强的转变。h1个效应器(CXCR 3)+),Th1极化TFH细胞(CXCR 3)+CXCR 5+)和Th1吨h17(CXCR 3)+CCR 6+CD4 T细胞,如用流动数据构建的tSNE图所示(图1)。三维空间,图S2A)。相应地,数据显示CD4 T蓄积。h第7天1个牢房(图)S2B)。尽管Th2 CD4细胞在第7天未见高峰,T细胞增多。h17个CD4细胞(图)S2C,D)。利用急性激活标记物诱导共刺激物(Icos)鉴定增殖(Ki-67)。+)第7天CD4 T细胞。3E),我们发现ICOS+CXCR 5和CXCR 5+CD4 T细胞亚群表达T细胞h1标记信号淋巴细胞粘附分子(SLAM)诱导T细胞活化26,我们已经表明,它也是用T表示的。h1吨FH细胞13免疫后,Fractalkine受体CX3CR1,a Th1标记物,与其活化状态一致(图1)。3F)。尽管激活的T增加了FH细胞,cxcl 13水平在sars-cov-2感染后没有显著增加(图)S2E)。都不是ICOS+CXCR 5或CXCR 5+CD4 T细胞亚群下调CD 28,这两种细胞表达CCR 7的水平与幼稚细胞相当或大于幼稚细胞,表明有淋巴结归巢表型。为了评估CD4 T细胞的功能,在体外用PMA和离体霉素刺激细胞因子。我们发现了两种不同的CD4 T细胞--一种脱颗粒的CD107a+b细胞,大部分脱颗粒的CD4 T细胞表达干扰素γ(IFNγ)和tnfa,而不是IL-2或IL-17;以及一种产生IL-21的亚群(图)。S2F)。相反,大多数IL-21表达细胞产生IL-2、IL-17,同时产生TNFa和IFNγ.因此,在SARS-CoV-2感染过程中,CD4-T细胞多功能被保留.

CD4 TFHSARS-CoV-2感染后产生了针对S蛋白和核衣壳蛋白的细胞。

基于系统性CD4 T的显著增加FHSARS-CoV-2暴露后的细胞,我们试图了解脾脏在GC期的免疫反应.为此,我们量化了GC T。FH死亡时脾脏中的细胞,并将其与未接触SARS-CoV-2的动物机会性尸检中的脾细胞值进行比较。结果提示感染后脾脏内发生GC反应(图)。S3A)。我们观察到大部分GC TFH细胞不表达Foxp 3,表明GC TFHGC T滤泡调节细胞(T细胞)占主导地位Fr;CXCR 5+,pd-1++、Foxp 3+)子集(图)S3B,Tregs被定义为CD 95。+CXCR 5Foxp 3+)。为了全面评估SARS-CoV-2诱导的反应,我们用覆盖S、N和膜(M)蛋白中多个T细胞表位的巨apools重叠肽刺激冷冻脾细胞,并跨越SARS-CoV-2的开放阅读框(ORF 1,3a,8)。以PMA/Ionomycin为阳性对照,二甲基亚砜(DMSO)处理细胞为阴性对照。激活诱导标记法(AIM)27根据OX 40和CD 25的共同表达,鉴定了SARS-CoV-2特异性CD4 T细胞。4A)。在DMSO处理的细胞中减去AIM+反应后,检测到CD4 T细胞对S和N的反应。此外,PD-1++GC TFH细胞对S、N和M的反应性表现为SARS-CoV-2诱导的脾GC反应(图一)。4B).

图4:CD4 TFHSARS-CoV-2感染后,淋巴组织产生靶向棘(S)和核衣壳(N)的细胞.

A典型的门控策略是CD3-A700、Dead-APC-Cy7、CD8-BV 510、CD4-BV 650、CD 95-BUV 737、CXCR5-PE、PD-1-Pe Cy7、CD 25-APC、OX40-BV 786、IFNG-Pe-Cy7、TNFa-A488、CXCR5-PE、PD-1-Pe Cy7、CD 25-APC、OX 40-BV 786、IFNG-Pe-Cy7、TNFa-A488、CD8-BV 510、CD4-BV 650、CD 95-BUV 737、CXCR5-PE、PD-1-Pe Cy7、CD 25-APC、OX40-BV 786、IFNG-Pe-Cy7、TNFa-AIL-488、-17-BV421、21-B散点图显示活化诱导标记(AIM)+CD4亚群。虚线表示无法检测到的响应,指定值为0.01%。CCXCR 5细胞因子谱(干扰素γ、白细胞介素2、肿瘤坏死因子a、白细胞介素17、白细胞介素21)的门控策略+、CXCR 5-和CD8+CD 95+T细胞)。D饼图显示T细胞多功能。

然而,应该指出的是,在sars-cov-2未暴露的动物的机会性身体的脾细胞中也检测到了对S、N、M的反应,这意味着与地方性冠状病毒交叉反应的T细胞,正如在人类中所报道的那样。17,28。事实上,已记录到hcov-nl 63对群养恒河猴的自然感染。29。关于疫苗的结果,这些交叉反应的T细胞是否能够在体内识别和增强对sars-cov-2感染的细胞的效应反应是高度相关的,因为预先存在的交叉反应T细胞可能会影响疫苗的效力。

免疫组化法检测脾CD4 T细胞多功能对PMA/Ionomycin刺激的影响显示CXCR 5+CD4 T细胞与CXCR 5明显不同它们共同产生干扰素γ、IL-2、TNFa和IL-21的能力。相反,CXCR 5亚群产生的白细胞介素-21很少,但能够共同产生IL-2和TNFa,或者,或者,干扰素γ,IL-2,或TNFa。相反,CD8 T细胞主要是干扰素γ产生者。4C,D)。未感染动物的T细胞表现出类似的多功能表现,说明SARS-CoV-2感染并没有改变T细胞的多功能特征以刺激有丝分裂。我们还发现了中等频率的干扰素γ和tnfa产生sars-cov-2特异性CD4 T。FH脾脏细胞(图)S3C,D与脾脏数据一致的是,在第7天,外周血中也出现了针对S和N的抗原特异性反应(图1)。5A,B)。这些数据表明,S和N特异性CD4 TFHSARS-CoV-2感染后细胞产生.

图5:CD4 TFHSARS-CoV-2感染后血中以棘(S)和核衣壳核(N)为靶点的细胞。

APBMCS和N肽池刺激SARS-CoV-2特异性CD4 T细胞的代表性门控策略。BAIM+CXCR 5和CXCR 5+第7天PBMC CD4亚群。

SARS-CoV-2感染引起纵隔淋巴结GC反应

已证实sars-cov-2刺激CD4 T的产生。FH细胞,我们接下来评估Th1在肺内诱导CD4 T细胞。胶原酶消化后,从肺分离出的单个细胞悬液用一组标记物染色,以勾画活化的CD4 T细胞。我们检测了颗粒酶B和pd-1,这两种抗原诱导的活化标志;粘膜归巢受体a的表达。4ß7、CCR 6和ThCD 69中的1受体CXCR 3+和CD 69CD4和CD8-T细胞亚群(图)。6A)。颗粒酶B、Pd-1和CXCR 3在肺CD4 T细胞中的表达模式为T。h1效应细胞CD4反应与肺实质CD8 T细胞效应的证据一致(图1)。6B)。我们还观察到颗粒酶B的比例+和PD-1+CD8 T细胞与鼻腔病毒载量相关,表明抗原驱动的CD8 T细胞在肺内扩张(如图所示)。6C)。此外,肺组织病理学显示支气管相关淋巴组织的发育(图)。S4A)证实了适应性免疫反应的诱导。纵隔淋巴结大体检查与淋巴结肿大一致(图)S4B)。相应地,H&E染色的纵隔淋巴结切片显示苍白的GCs明显丰富(图)。S4C)。福尔马林固定淋巴结切片显示CD3免疫染色+Pd-1-表达细胞(图.7A,E,I)定位于由CD 20组成的淋巴滤泡+Bcl-6+细胞(图1.7A、e、d证实SARS-CoV-2感染后纵隔淋巴结存在GCs。为了定量评估gc反应,我们从淋巴结和染色细胞中提取了单细胞悬液,并用一组标记物来定义gct。FH细胞,GC B细胞,滤泡树突状细胞(FDC)。如图所示,纵隔淋巴结显示出明显的CXCR 5。+Pd-1++GC TFH子集与Bcl-6+CD 95+CD 20+GC B细胞(图1.7b)。根据补体受体CD 21的表达鉴定FDC(克隆B-Ly4;图)S5A),在CD 45中CD3CD 20细胞群体30。FDC的数量与胃癌B细胞和胃癌T细胞的频率密切相关。FH单元格(图)S5B).

图6:T的诱导h1 SARS-CoV-2感染时肺部CD4效应因子。

ACD 95的选通策略+CD 69+CD4和CD8细胞表达颗粒酶B、PD-1、α4β7、CCR 6和CXCR 3。荧光染色剂为CD45-A 488、CD3-A 700、CD 20/Dead-APC-Cy7、CD8-BUV 805、CD4-BV 650、CD 95-BUV 737、CD 69-BV 711、颗粒酶B-BV 421、Pd-1-Pe Cy7、a4b7-PE、CD 25-APC、CCR6-PECF 594、CXCR3-BV786。B肺和血中颗粒酶B、PD-1、CXCR 3和CCR 6表达的CD4和CD8 T细胞百分比(*)p=0.02使用双尾Mann-WhitneyU测试)。C洗鼻液vRNA与CD8 T细胞颗粒酶B(GzmB)或pd-1的相关性分析(一尾Pearson试验)p所示值)。

图7:SARS-CoV-2感染引起纵隔淋巴结的生发中心反应.

A具有代表性的CD3、PD-1、CD 20、Bcl-6多色免疫荧光显像及DAPI染色在纵隔淋巴结中的应用。分别用CD3/Pd-1和CD 20/Bcl-6/CD3染色观察生发中心(GC)T。FH分别为细胞和胃癌B细胞。(a-d)显示GC B细胞的图像和(f-i)显示GC T的图像FH细胞从(E)中的白色盒子中放大,用一个×20的目标来收集。(D)合并图像显示CD 20+Bcl-6+GC B细胞,(I)图像显示CD3+PD-1+GC T。FH细胞。(E)标尺为100 m,其余为25m,粉红色CD3染色为伪色(原红色),与Bcl-6鉴别。B鉴别滤泡树突状细胞(FDC)、生发中心B细胞(GC B)和生发中心T的代表性门控策略FH细胞(GC T)FH纵隔淋巴结中CD45-A 488、CD3-A 700、CD20-BV 421、Dead-BV 510、CD8-BUV 805、CD4-BV 650、CD 95-BUV 737、CXCR 5-PE、Pd-1-Pe-Cy7、Bcl-6-APC-Cy7、CD140b-APC、CD21-PECF 594、CXCR3-BV786。CBcl-6、CD 21、CD 140 b和CXCR 3的中位荧光强度。DGC T频率FH纵隔淋巴结中的细胞、GC B细胞、FDC显著增高(Med,数据来源:n=8只独立动物(GC T)FH; **p=0.007,*p=0.01)相对于颈部淋巴结(CLN,数据显示n=8只独立动物)和肠系膜淋巴结(MES,数据来自n=7只独立动物),采用双尾Wilcoxon配对签名秩检验,GC B细胞;*p=0.04采用双尾Wilcoxon匹配-对符号秩检验;p=0.039使用双尾Wilcoxon匹配-对符号秩检验。水平线表示中值。E大多数GC TFH纵隔淋巴结细胞表达CXCR 3(GC T)FH和TFH; **p=0.007,*p=0.01,以及mTfh*p=0.01相对于CLN和MES,采用双尾Wilcoxon匹配-对符号秩检验).显示的数据来自n=Med、CLN和8只独立动物n=7只为MES的独立动物。水平线表示中值。

对典型gc标记表达的定量分析表明,bcl-6完全由gcb细胞表达,而在较小程度上由gct表达。FH细胞(图1.7C)。FDC标记物CD 21和血小板源性生长因子受体b(CD 140 B)31也用GC T来表达。FH和B细胞。T的表达增加h1-趋化因子受体CXCR 3对GC T的作用FH细胞与对病毒感染反应的细胞表型一致。虽然胃癌B细胞在CXCR 3表达上表现出异质性,但FDC对该标记的表达均为阴性。GC T增加FH、GC B细胞和FDC。7DCXCR 3在纵隔淋巴结中的相对表达高于颈淋巴结和肠系膜淋巴结,提示对病毒感染有积极的免疫应答(图一)。7E, S5C)。GC T的功能分析FHPMA/Ionomycin刺激后纵隔淋巴结细胞CD40L表达增强。+干扰素γ+GC T中的细胞FH舱室,与T相一致h纵隔淋巴结内1种表型(图)S5D).

了解CXCR 3在GC T中的表达方式FH细胞可能影响CXCR 3的定位和辅助电位,我们对CXCR 3进行了表型表征。和CXCR 3+GC TFHSARS-CoV-2感染后的细胞(见图)。8A-C)。数据显示CXCR 5和CCR 7具有同等的表达,CCR 7是控制两种CXCR 3卵泡定位的关键受体。和CXCR 3+子集32。此外,这两个子集在每个细胞基础上表达的CD 69的水平是相当的.与PT中的观察结果一致FH细胞,SLAM在CXCR 3中的表达较高。+GC TFH子集13。ICOS在CXCR 3中的表达与CXCR 3相当。+GC TFH细胞表达较高水平的CD 28。PMA/离子霉素刺激后的功能分析显示CXCR 3+GC TFH细胞表达较高水平的干扰素γ,并可与CD40L和IL-21的表达相媲美。8C)。类似于脾脏和外周血单个核细胞的反应,gct对sars的特异性反应。FH纵隔淋巴结可见细胞。8D)。这些数据表明sars-cov-2感染可引起gct。FH其他健康恒河猴的细胞。

图8:SARS-CoV-2感染诱导了纵隔淋巴结中针对棘(S)和核衣壳(N)的生发中心反应.

ACXCR 5、CCR 7、CD 69和CD 69的中位荧光强度(MFI)BCXCR 3中的SLAM、ICOS、CD 28-(橙色)和CXCR 3+(洋红)GC TFHSARS-CoV-2感染后脾脏细胞。脾脏幼稚CD4 T细胞比较(灰色)(SLAM;*)p < 0.0001 CXCR3+ relative to naive and CXCR3− using a paired two-tailed t测试,CD 28;**p=0.001 CXCR 3+子集相对于朴素和CXCR 3-使用一对双尾t测试)CPma/Ionomycin刺激后,CD40L、IFNγ和IL-21在GC T中的表达FH子集。未受刺激的细胞呈灰色(IFNG;**)p=0.0012 cxr 3+相对于cxr 3−使用一对双尾t测试)。盒子-胡须图显示数据的范围,框的界限从第25百分位数延伸到第75百分位数,盒子中的线是在中间位置绘制的。DPd-1流动图+CXCR 5+ TFHAIM+细胞在棘波刺激(S)后表现为AIM+细胞;散点图显示GC T的特异性FH细胞与CXCR 5细胞对SARS-CoV-2S和核衣壳蛋白(N)的反应及对PMA/离子霉素的反应。CD 95-幼稚CD4 T细胞显示作比较。虚线表示分配给0.01%的无法检测的响应。黑色方格表示SARS-CoV-2未暴露的动物。所使用的荧光染料是CD40L-APC;如以前的面板所述。

对sars-cov-2的体液反应以IgG抗体为主。

对S和N蛋白的早期抗体反应的动力学和抗体的贡献亚型,特别是在轻度或无症状的临床疾病的情况下,还没有得到明确的定义。在此,我们量化了S1、S2和N抗原的血清抗体浓度,并使用一种针对猕猴IgG的次级抗体来区分新的IgG抗体和被动注入的人CP IgG抗体。数据显示,感染后第7天,所有动物的IgM和IgG血清转化为S1和S2蛋白,只有一只动物例外(图一)。9A,B)。这与有报道称大多数感染2002年sars或cov-2的人血液中同时出现S或rbd特异性IgG和gm抗体的情况是一致的。33,34,35。据报道,人类对N蛋白的抗体应答在发病10天后增加。36,37有趣的是,在所有猕猴中,N特异性IgG在第7天都很明显,但在大多数动物中,N特异性IgM直到第10天才显著升高(比基线值高出3倍)。此外,50%的动物在感染后10天内未能对所有SARS-CoV-2蛋白表现出显著的IgA反应(图一)。9C)。然而,我们应该注意到,对一些尸检血清的分析表明,IgA抗体在第10天后继续增加。S5E).

图9:对SARS-CoV-2的体液反应以IgG抗体为主.

浓度AIGM,BIgG,和CBama或ELISA检测血清中S1、S2和N蛋白特异性IGA抗体(Ab)。虚线表示所有动物感染前(第0天)浓度的中位数。独特的符号识别每个实验组中的动物。(**)p=0.007,*p=0.015,在指示的时间点相对d0使用wilcoxon匹配-对符号-秩二尾。t测试)。

对未接受CP血浆的动物感染后抗体反应程度的评估清楚地表明,IgG对所有SARS-CoV-2蛋白的体液反应起主导作用(图一)。10A),IgG 1是最主要的亚型。10b)。在第10天,我们观察到S1特异性IgG和IgM之间以及N特异性IgA和IgG之间有很强的相关性。10C)。伪病毒nabs的范围从82到1754,比一些研究报告的要高。238只动物中有2只血清中的中和活性大于1:1000,提示了体液免疫应答的产生。我们观察到中和抗体滴度与第10天抗RBD IgG抗体浓度之间存在很强的相关性(图1)。10C)。此外,T的比例h1吨FH第7天的效应细胞可预测第10天的抗RBD IgG浓度(如图所示)。10C)。这些数据一起显示了SARS-CoV-2感染后在轻度或无临床症状的情况下,结合抗体和中和抗体的发展。抗病毒IgG抗体在第7天出现并延迟诱导IgA反应,提示SARS-CoV-2感染后可发生早期转诊,且可能是T促进的。h1型TFH细胞。然而,应该注意的是,黏膜IgA反应可以以T无关的方式诱导。38.

图10:SARS-CoV-2感染后IgG 1亚类和中和抗体。

A每只动物感染后第0天的抗体浓度除以第0天时测定的抗体反应增加一倍。显示的数据如下n=8只动物在所有时间点。水平线表示中位BIgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4抗S1、S2、N抗体增加一倍,IgG 1亚类抗体以IgG 1亚类抗体为主。所显示的数据为n=6只未给予CP的动物。CELISA法检测血清S1特异性IgG、IgM、N特异性IgA、IgG水平与伪病毒中和抗体滴度及抗受体结合域IgG抗体的相关性。独特的符号识别每个实验组中的动物(两尾皮尔逊试验)p所示值;抗RBD IgG与T的相关性h1吨FH细胞显示单尾Spearman试验p价值)。

讨论

CD4 T的重要性FH血浆细胞的产生对持续的抗体至关重要,这对理解T很重要。FHSARS-CoV-2感染后的GC反应。本研究在三个重要方面增加了我们对SARS-CoV-2免疫反应的理解.首先,我们证明了稳健的Th1-TFHSARS-CoV-2感染后可观察到反应.第二,TFH集中于S和N的反应可见于淋巴结内,在外周血中循环,有可能播散脾脏。最后,我们发现急性抗体动力学主要表现为IgG的诱导,主要是对S1和IgG 1亚类的诱导,表现为早期的类转换。综合起来,这些数据表明生产TFH健康成年恒河猴感染SARS-CoV-2后可引起反应.而Th1-T的偏倚FH感染后的细胞由于sars-cov-2后产生了强烈的干扰素反应,这种倾斜是很重要的,因为在covid患者中观察到的弱干扰素反应可能会阻碍有效的抗病毒抗体和CD8-T细胞反应的增强。39.

几项研究已经研究了人类在出现症状后的抗体反应动力学,并从这些数据中产生了三个统一的主题。首先,在大多数患者中,S1亚基的rbd抗体在症状出现后8天至10天内产生,这些抗体水平与中和效价密切相关。34,35,40。其次,大多数新冠肺炎恢复期患者的血浆不含有高水平的中和活性。41。第三,产生中和抗体的感染者血浆抗体变异最小。42。这些数据提示CD8 T细胞可能有助于SARS-CoV-2的控制,虽然持续的GC反应对中和抗体的产生可能不是关键的,但它可以通过增加血浆细胞的数量来改善抗体的持久性。我们的数据增加了这一发展的叙述,表明在轻度/无症状疾病的背景下,抗体反应产生并以IgG的优势为特征。有趣的是,我们观察到抗S1、S2和N蛋白的IgM和IgG抗体是同时产生的。

最近的数据表明,CP疗法与抗病毒和免疫调节剂一起治疗中至重度新冠肺炎有一定的益处。43,44但同时也表明,在感染过程中早期注射cp可能更有益,因为在症状出现后2周内产生了抗体反应。45。然而,我们的研究表明,CP注射并没有减轻新生的感染。当混合CP的中和效价为1:1149时,我们未能在输注后获得可检测到的中和抗体,从而解释了无效的原因。这些结果突出了恢复期血浆具有足够高的中和抗体滴度来治疗新冠肺炎患者的先决条件。需要更多有足够动物数量的对照研究来确定高滴度CP输注或多次CP输注是否能达到预防性或治疗性保护作用的中和效价。支持这一点的数据不仅在治疗方面有很大的潜力,而且对疫苗的功效也有很大的潜力。

虽然目前尚不清楚当自然感染sars-cov-2时所引起的免疫反应是否能防止再次感染,但对恒河猴的研究表明,感染在第一次感染后28-35天确实能防止再次受到攻击,这表明在感染后一定程度上有某种程度的保护性免疫反应。23。在这方面,发现感染诱导CD4辅助反应,针对病毒的主要结构蛋白,表明感染能够产生有效的CD4帮助CD8 T细胞和抗体反应。事实上,抗s1区rbd区的抗体是在绝大多数新冠肺炎患者中产生的,同时具有较强的CD4 T细胞反应。35。我们的数据表明,尖峰表位对T细胞和B细胞都具有免疫原性,提示疫苗诱导这些反应可能具有保护作用。虽然我们发现脾脏中有N和S特异性的CD4 T细胞,但目前我们无法分辨这些细胞是来自循环的细胞,还是通过被贩运的抗原重新激发的细胞。需要进一步的研究才能解决各种可能性,因为这对于理解保护性免疫的决定因素至关重要。总之,数据表明疫苗平台诱导Th1 CD4助手和TFH辅助反应很可能成功地激发出抗SARS-CoV-2的强大的CD8-T细胞和抗体反应。循环T的相似观测FH接种疫苗和感染人类的细胞支持这一假设。16,46,47。但是,必须强调的是,这些都是联系,也是T的必要性。h1抗体应答中的CD4 T细胞不能在本研究中得到解决。

总之,目前的研究增加了我们对sars-cov-2感染的CD4辅助反应的理解,并为利用刺激强劲的CD4 T的机制提供了重要的基础。FH有效疫苗的反应。

方法

恒河猴

八头印度产恒河猴(猕猴)被安置在加州国家灵长类动物研究中心,并按照美国实验动物保护准则认证协会和动物福利法/指南进行维护。这项研究得到了加州大学戴维斯分校动物保护和使用委员会的伦理批准,研究人员和动物工作人员遵守了所有有关动物测试和研究的道德规范。如提交人所述48严格的社会距离措施在今年3月开始在CNPAR实施,以减少人对恒河猴SARS-CoV-2传播的风险。对动物进行了SARS-CoV-2的筛查,并在指定学习任务前将其安置在PPE要求增加的屏障室中。动物4~5岁,体重中位数8.6kg(5.4~10.7kg),SIV-STLV-SRV-。研究开始时动物血清SARS-CoV-2呈阴性.实验组内性别分布如下:n=3名女性,n=1名男性);感染+恢复期血浆(n=2名男性);感染+正常血浆(n=2名男性)。表沙一提供研究中动物的详细情况。取血用盐酸氯胺酮10 mg/kg麻醉。对病毒接种和鼻分泌物采集,用15−30 g/kg盐酸右美托咪啶注射液灌胃给药。麻醉用盐酸阿替帕唑0.07-0.15 mg/kg静脉滴注。

病毒和接种

SARS-CoV-2病毒是从加州大学戴维斯医学中心萨克拉门托分校收治的一位患有急性呼吸窘迫综合征的新冠肺炎患者的鼻拭子中分离出来的。49。鼻拭子是从加州大学戴维斯分校(UC Davis Biorepository)获得的,得到了当地机构审查委员会的批准。临床样本在释放前已被卫生系统实验室排除,并符合相关的伦理和人类研究条例。Vero细胞(ATCCCCL-81)用于病毒的分离和扩增.用于动物接种的第2代病毒(SARS-CoV-2/人/美国/CA-CZB-59×002/2020)滴度为1.2×10。6PFU/ml(相当于2×10)9(Genbank登录号:MT 394528)。为重述SARS-CoV-2的相关传播途径,将动物接种于气管1ml,鼻内滴1ml,每个结膜滴上一滴病毒。

恢复期血浆和输液

疗养血浆来源于Vitalant,由多达4名捐献者组成。血浆是在注入猴子之前被混合在一起的。血清NAB效价为1:1149,SARS-CoV-2抗原结合抗体效价为:抗S1-IgG,24.5g/ml,抗-S2 IgG,2.9g/ml,抗-NIgG,10.7g/ml。抗S1-IgG浓度为0.00004μg/ml,抗-S2 IgG浓度为0.003 g/ml,抗-NIgG浓度为0.001 g/ml。控制动物(n=4)未注入。

标本采集与处理

在第2,4,5,7,8和10天,一个五个法式喂食管插入鼻腔。每鼻孔注入PBS 2ml,最大吸出量为800×。g将上清液和细胞颗粒溶于3ml的TrizolLS中进行RNA提取,共10 min和1ml。第0、2、4、7、10天收集乙二胺四乙酸抗凝血进行免疫分型。用密度梯度离心法从细胞制备液泡管收集的全血中分离PBMC,并于第7天取标本进行尸检。50。血清用800 g离心10 min,取上清液,保存于−80°C。尸检取淋巴结、脾、肺组织,用胶原酶酶切,手动破碎,获得单细胞悬液,进行流式细胞仪检测。全血采集数据实时生成,重复一次。

目的测定

用代表sars-cov-2的重叠肽池刺激细胞,并通过激活标记物的上调来鉴定应答细胞,如前面所述。50,51。用0.2μg CD 2 8和0.2μg CD49d共刺激抗体制成的刺激鸡尾酒中,所有抗原的最终浓度为2μg/mL。未受刺激的对照组用体积控制的DMSO(Sigma-Aldrich)治疗.管在5%CO中孵育237°C一夜。经过18h的刺激,细胞被染色,固定,并在同一天获得。目的对冷冻保存细胞进行脾细胞和纵隔淋巴结的检测(表)。S2)。目的对新鲜细胞进行第7天PBMC检测。采用标准流式细胞仪检测LNS和PBMC的表型。

QRT-PCR定量表达vRNA

采用改良的前胶原RNeaseLipid组织微型试剂盒对曲唑溶解后的鼻腔标本进行处理。在三唑裂解液中加入5.6μ1-多酰基载体,再加入1/10体积的BCP,并按奇根法分离相。根据试剂盒指令,用ezDNase处理8株μ1,在20μl反应中用随机引物将其转化为上标IV,在应用的生物系统QuantStudio 12 K Flex实时PCR系统上,用引物和探针(前5‘-GTTTGGGGGACTGATCA-3’,反向5‘-GTGAACCACATAT-3’,5′-/5-FAM/TAACCAGAA/ZEN/TGGAGAACGCAGTGGG/3IABkFQ/-3′).探针5‘-GTGAACCATAT-3’,前5‘-GTTTGGGGGACCGATCA-3’,反向5‘-GTGAACCACATAT-3’)为探针,将洗脱RNA的8μ1转化为cDNA。

血清细胞因子

采用Luminex(NHP细胞因子Luminex性能预混试剂盒,R&D,FCSTM 21)对恒河猴血清中的细胞因子进行检测。该检测是根据制造商的协议进行的。在Luminex 200双激光仪(Luminex,奥斯汀,TX)中询问每个样品的珠子、对照点和标准曲线点,监测每个样品的光谱特性和相关的藻红蛋白(PE)荧光量。使用xPONENT软件计算中位荧光指数,并计算每种细胞因子的浓度。

流式细胞术和免疫荧光染色

全血和单细胞悬液从肺和淋巴结染色新鲜,并在同一天采集。对冻存标本进行脾脏染色。用BD生物科学™和FACSDiva™8.0.1版软件对荧光进行了测定。补偿,门控和分析进行了弗劳乔(版本10)。免疫荧光显像用抗体孵育4μm切片,羊抗兔IgG与Alexa Fluor 568结合,羊抗鼠IgG与alexa Fluor 488(分子探针,Grand Island,ny)结合检测pd-1阳性细胞和CD3。+T淋巴细胞。用羊抗鼠IgG2a与Alexa Fluor 488结合,羊抗小鼠IgG2b与Alexa Fluor 568结合,羊抗兔IgG与Alexa Fluor 647结合(分子探针,大岛,NY)检测CD 20。+B细胞,Bcl-6+细胞和CD3+T淋巴细胞。以4‘,6-二氨基-2-苯环吲哚为核着色剂(分子探针,Grand Island,NY),用加长金试剂在所有玻片上放置Cover幻灯片。我们观看了幻灯片,并使用带有适当滤镜的蔡司成像仪Z1显微镜(CarlZeiss Inc.,Thornwood,NY)拍摄了图像。用于流式细胞术和免疫荧光的试剂列于表中。S2.

针对S1、S2和N蛋白的IgG和IgM抗体的结合抗体多重分析方法(Bama)可同时检测以下重组SARS-CoV-2蛋白(均来自于中国生物制品、韦恩、PA):S1(#40591-V08H)、S2胞外结构域(#40590-V08B)和核衣壳蛋白(N;#40588-V08B)。简单地说,蛋白质在PBS中被透析,并连接到BioPlex Pro羧化磁珠(BioRad,Hercules,CA)。50。用1%TritonX-100洗涤剂处理标准品和血清样品,在含1%BSA、0.05%叠氮化物和0.05%吐温-20的PBS中连续稀释,并在1100 rpm和4˚C下与珠子混在一起。第二天,用生物素化抗体清洗和处理珠子,然后用中微粉亲和素-PE(南方生物技术协会:SBA,伯明翰,AL)进行洗涤和处理(菲利普斯2017)。用BioRad BioPlex 200和BioManager软件测量荧光强度,建立标准曲线,对检测样品中抗体浓度进行插值。

用SARS-CoV-2混合血清感染猕猴11~14天。采用以下人源化单克隆抗体(IgG 1)测定恒河猴血清标准中IgG、IgM和IgA抗体的浓度:抗S1 RBD(Genscript#HC 2001)、抗S2(中国生物制品#40590-D001)和抗NC(Genscript#HC 2003)。用生物素化亲和纯化山羊抗人IgGγ链多克隆抗体(SBA#2048-08)检测人和恒河猴IgG抗体。随后用生物素化小鼠抗猴IgG链单克隆抗体(sbacat#4700-08)作为二次抗体,检测SARS-CoV-2特异性恒河猴IgG抗体。用生物素化亲和纯化山羊抗人IgM链多克隆抗体(SBA#2020~08)检测IGM抗体,与猕猴IgM反应良好。结果在恒河猴标准中获得的IgM值为3.3倍,说明单抗IgG单克隆抗体标准对IgM的估计偏低。用下面描述的抗体检测猕猴IgA抗体。IgG,IgM或IgA抗体必须在第0天增加三倍,才能被认为是显著的。

以新冠肺炎恢复期人血清为标准,检测恢复期血浆中人IgG抗体。对恒河猴IgG和IgM抗体的检测,以SARS-CoV-2感染猕猴血清为标准.用以下人源化单克隆抗体(IgG 1)来估计这些标准中抗体的浓度:抗S1 RBD(Genscript#HC 2001)、抗S2(中国生物制品#40590-D001)和抗NC(Genscript#HC 2003)。结果IgM为3.3倍,按单聚IgG抗体标准估算偏低。用NHP吸附亲和纯化山羊抗人IgGγ链多克隆抗体(SBA#2014~08)和生物素化小鼠抗猴IgGγ链单克隆抗体(SBA#4700~08)检测动物血清中人和恒河猴IgG抗体。采用生物素化亲和纯化山羊抗人IgM链多克隆抗体(SBA#2020~08)检测人和恒河猴IgM抗体。用NHP资源试剂中的恒河猴IgG亚类特异性单克隆分别检测IgG 1、IgG 2、IgG 3和IgG 4抗体:克隆3C10.3、3C10、2G11和7A8。用人吸附的生物素化山羊抗小鼠IgG2a或-IgG 1(SBA#1080-08和#1070-08)检测这些未标记的单克隆抗体。

SARS特异性IgA和RBD抗体的酶联免疫吸附试验

这些测试是使用类似于所描述的方法进行的。52而Immulon 4微滴度板(VWR、RADOR、PA)每井包被S1、S2、N或RBD蛋白(Sinobiological#40592-VNAH)100 ng/孔。IgA检测采用ge Healthcare蛋白gsepharose(Sigma,St.Louis,MO)作为标准,检测sars-cov-2感染后第14天的混合恒河猴血清。52。试验血清也缺乏IgG,以便于检测低水平的IgA抗体。用生物素化克隆10F12(NHP试剂资源)和生物素化克隆40.15.5(Ward等人,1995年)的混合物检测猕猴IgA,该单克隆抗体不与人IgA发生交叉反应,与人IgA结合后,可识别所有同种类型的恒河猴IgA(Kozlowski,个人观察)。RBD IgG检测采用上述混合血清标准和猕猴IgG特异性第二单克隆抗体。中和试验假病毒中和试验如前所述。53.

统计

用GraphPad棱镜8.4.2进行统计分析。分组内比较,如免疫反应和抗体水平在不同的时间点,进行了两尾威尔克森配对签名秩检验。相关分析采用两尾Spearman秩相关检验.用Biorender.com制作了图形插图。


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