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二甲双胍负载巨噬细胞衍生微粒促进抗PD-1治疗

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发表时间:2021-01-22 10:26作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

程序性细胞死亡1(PD-1)/PD-1配体(PD-L1)检查点阻断的主要挑战在于缺乏足够的T细胞浸润、肿瘤免疫抑制微环境以及抗Pd-1/PD-L1抗体在肿瘤中的聚集和渗透不足。重置肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)是增强T细胞抗肿瘤免疫和改善肿瘤免疫抑制的一种有效策略。在这里,甘露糖修饰的巨噬细胞衍生微颗粒(Man-MPS)负载二甲双胍(Met@Man-MPS),有效地靶向于M2样TAMs,使之再次极化为M1型表型。MET@Man-MPS-Reset Tams通过增加CD8的吸收来重建肿瘤免疫微环境+T细胞进入肿瘤组织,减少免疫抑制浸润髓源性抑制细胞和调节性T细胞。更重要的是,MPS的胶原降解能力有助于CD8的浸润。+T细胞进入肿瘤内部,促进肿瘤的聚集和抗Pd-1抗体的渗透.Met@man-MPS的这些独特特性有助于增强抗PD-1抗体治疗,提高抗肿瘤疗效和长期记忆免疫。我们的结果支持Met@Man-MPS作为一种提高抗Pd-1肿瘤耐药性的潜在药物。

导言

程序性细胞死亡1(pd-1)/pd-1配体(pd-l1)检查点阻断是一种很有前途的抗肿瘤治疗方法,通过阻断肿瘤细胞上pd-L1与活化T细胞上pd-1的结合,重新激活T细胞介导的抗肿瘤免疫。1,2,3。然而,在大多数情况下,抗pd-1/pd-l1治疗的耐受性应答率仍然相对较低。4,5。抗pd-1/pd-ll耐药的主要原因是肿瘤组织中缺乏浸润性T淋巴细胞,这是所谓的“冷肿瘤”的特征。6和肿瘤免疫抑制微环境的存在,如调节性T(Treg)细胞和髓源性抑制细胞(MdSCs)抑制抗pd-1/pd-l1抗体再生抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞和Th1细胞应答。7,8。此外,肿瘤组织中血管结构异常,间质流体压力升高,细胞外基质(Ecm)致密,阻碍了抗pd-1/pd-l1抗体在肿瘤组织中的积聚和随后深入肿瘤实质。9,10,这限制了抗Pd-1/Pd-L1抗体的治疗效果。因此,需要有效的T淋巴细胞浸润,改善肿瘤免疫抑制的微环境,增强抗PD-1/Pd-L1抗体的蓄积和穿透能力,以提高对抗-PD-1/Pd-L1抗体的潜在反应。

肿瘤相关巨噬细胞(Tams)是各种肿瘤中最丰富的肿瘤浸润白细胞之一,通常由肿瘤微环境培养成不同的表型。11,12。M1样TAMs被公认为经典活化的巨噬细胞,通过释放氮氧化物(NO)和刺激天真的T细胞产生Th1/细胞毒性反应,表现出抗癌活性。13。相反,M2样巨噬细胞(以肿瘤为主的活化巨噬细胞)促进肿瘤生长、血管生成、转移和肿瘤免疫逃逸。14。M2样TAMs通过表达T细胞免疫检查点配体(如pd-L1和pd-L2),直接或间接抑制T细胞功能。15,16,分泌抑制性细胞因子(如IL-10和转化生长因子-β)。17,并招募免疫抑制细胞(如Treg细胞)18。因此,M2样TAMS对M1表型的复极化是提高T细胞介导的抗肿瘤免疫和改善免疫抑制性肿瘤微环境的一种很有前途的策略,这可能有利于提高抗PD-1/Pd-L1抗体的抗肿瘤活性。

二甲双胍(Met),降糖效果好,副作用少,成本低,是治疗糖尿病的常用药物。19,显示抗癌活性20。大量的研究表明,甲氨蝶呤可以调节肿瘤的代谢。21,阻断肿瘤细胞周期22,抑制血管生成23,通过激活腺苷5‘-单磷酸(AMP)激活蛋白激酶(AMPK)来杀伤肿瘤干细胞。24。最近,人们发现Met通过ampk-nf-κB信号通路,有效地将M2样TAMs重新极化为m1表型,抑制肿瘤的生长和转移。25,26。然而,如何实现Met靶向给M2类TAMS,以进一步提高疗效仍是一个很大的挑战。

细胞微颗粒是细胞外小泡,直径为100~1000 nm,是细胞对各种内源性或外源性刺激的反应而脱落的。27,28,29。MPS作为药物传递系统具有巨大的潜力,因为它具有在细胞间传递信使分子、酶和遗传物质(dna,rna)的独特特性。30,31,32具有良好的循环稳定性、高的生物相容性、低的免疫原性和毒性。33,34,35。考虑到TAMS来源于单核细胞或组织内巨噬细胞,这些巨噬细胞是由肿瘤微环境中的各种信号(如细胞因子、趋化因子、ECM成分和缺氧等)吸收的。14,36,巨噬细胞源性mps具有天然的肿瘤靶向性。37。M2样TAMS高表达甘露糖受体CD 206/MRC 138,39。在本研究中,甘露糖(MAN)修饰的巨噬细胞衍生MPS被用作Met(Met@Man-MPS)靶向传递到M2类TAMs的载体。MET@Man-MPS有效地将TAMS重置为M1表型,以抑制肿瘤生长。重要的是,Met@Man-MPS显著改善肿瘤免疫抑制微环境,增强CD8。+T细胞通过复位巨噬细胞诱导CD8浸润肿瘤内的实验研究+巨噬细胞表达基质金属蛋白酶(MMPs)后T细胞和人-MPS诱导的肿瘤ECM降解40,41。同时,Met@Man-MPS能有效地促进肿瘤的聚集和抗Pd-1抗体的渗透.Met@man-MPS的这些独特特性有助于抗PD-1抗体的抗癌治疗,从而产生了很强的抗癌效果,并在联合用药后产生了长期记忆免疫(图一)。1A).

图1:Met@Man-MPS的特征。

aMet@Man-MPS作为一种有效的抗PD-1治疗药物的原理图。MET@Man-MPS具有MMP活性,有效靶向M2样TAMs,降解肿瘤胶原蛋白。(1)Met@Man-MPS将M2类TAMS重新分化为m1样表型,导致CD8的出现。+T细胞进入肿瘤组织,改善肿瘤免疫抑制微环境。(2)人-MPS的胶原降解能力对CD8的浸润有一定的促进作用。+T细胞进入肿瘤内部,促进肿瘤的聚集和抗Pd-1抗体的渗透.(3)Met@Man-MPS与抗Pd-1抗体协同抑制肿瘤生长,产生长期记忆免疫。b用DLS分析MPS和不含Met的MPS和Man-MPS的水动力直径。括号中标明了多分散性指数。c用DLS分析MPS和Man-MPS与不含Met的MPS的zeta电位。数据表示为平均值±S.D。(n=3个独立样本)。dMPS和MAN-MPS与不含Met的MPS的透射电镜观察。图像是三个独立实验的代表。标尺:500 nm。e不同pH值下Met@MPS和Met‘Man-MPS在PBS中的药物释放。数据表示为平均值±S.D。(n=3个独立样本)。源数据作为源数据文件提供。

结果

Met@Man-MPS的制备及表征

M2样巨噬细胞高表达姆尔克1基因(附图)1),编码甘露糖受体CD 206/MRC 1。为了获得人修饰MPS以达到类M2巨噬细胞的靶向作用,首次将小鼠RAW 264.7巨噬细胞与dspe-peg-man共同孵育,通过天然膜磷脂交换获得人工程细胞。42。用Met(2mg ML)处理RAW264.7细胞和人工程RAW264.7细胞。−1),然后对Met包装MPS和Man MPS(分别表示Met@Mps和Met@Man-MPS)进行紫外线照射。34,35。凝集素识别实验证实了MAN在Man-MPS和Met@Man-MPS(补充图)中的成功修饰。2)。动态光散射(DLS)分析表明,Met@MPS和Met@Man-MPS的尺寸相似,为440 nm。1B)和−11.6MV的Zeta电位。1C)分别。透射电镜(TEM)显示,Met@MPS和Met@Man-MPS均为单分散和不规则球形。1D)。高效液相色谱分析表明,MPS和Man-MPS的载药量均为0.69μg/μg蛋白(MPS和Man MPS)。此外,Met@MPS和Met@Man-MPS显示出对pH敏感的持续药物释放(图一)。1E)。MET@MPS和Met@Man-MPS 7天后,在含10%胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液(PBS)中,大小或Zeta电位无明显变化(补充图)。3),表明大都会议员和大都会议员是相对稳定的。

MAN-MPS有效地瞄准M2类TAMS。

为了研究MAN-MPS的类M2靶向性,我们首先评价了RAW 264.7细胞(M0巨噬细胞)、LPS-和IFN-γ-条件性RAW264.7细胞(M1-样巨噬细胞)、IL-4-条件RAW 264.7细胞(M2-样巨噬细胞)、小鼠树突状DC2.4细胞(另一种主要表达甘露糖受体CD 206的吞噬细胞)对pkh 67标记MPS和man-MPS的摄取效率。43,用流式细胞仪检测小鼠H22肝癌细胞。2A)。MAN-MPS处理的M2型巨噬细胞细胞内PKH 67荧光最强,提示MS-MPS具有选择性的M2样巨噬细胞靶向性。与Met@MPS和游离Met相比,更多Met@Man-MPS内化为M2样巨噬细胞。4)。IL-4条件的小鼠骨髓源性巨噬细胞(M2样BMDMs,图1)证实了MS-MPS的M2样巨噬细胞靶向性。2B)。游离人预处理可显著降低M_2样巨噬细胞内MS-MPS的细胞内蓄积(图1)。2C表明MPS的M2样巨噬细胞靶向性是由M2样巨噬细胞表达的甘露糖受体CD 206介导的。

图2:M2类TAM-人-MPS的靶向能力。

a, bRAW264.7细胞(M0巨噬细胞)相对PKH 67平均荧光强度(MFI)a)或BMDM(M0 BMDM,b),LPS-和IFN-γ-条件性RAW264.7细胞(M1样巨噬细胞,a)或BMDM(类似M1的BMDM,b),IL-4-条件性RAW264.7细胞(M2样巨噬细胞,a)或BMDM(M2类BMDM,b),树突状DC2.4细胞(a)或骨髓来源的树突状细胞(BMDC),b)和h22细胞在pkh 67标记的mps或man-mp浓度为10g蛋白mL时处理后的细胞。−1数据以±S.D表示。(n=3个生物独立样本;单向方差分析,TUKY‘s HSD后特设试验)。cPkh 67标记mps或man-mps在10μg蛋白mL作用于IL-4条件RAW264.7细胞中的相对pkh 67 MFI−1在100μg mL存在或不存在的情况下−1MAN持续4h,数据以±S.D表示。(n=3个生物独立样本;单向方差分析,TUKY‘s HSD后特设试验)。d, e、活体成像(d)和荧光强度(e)静脉注射Cy5标记的MPS或MAN-MPS 15 mg蛋白kg后24 h对H22荷瘤小鼠器官和肿瘤中Cy5的含量。−1。标尺:1厘米(d)。数据表示为平均值±S.D。为(e). (n=每组4只;未配对的双尾学生t-测试)。fM1样TAMS(CD11b)中的相对PKH 26 MFI+F4/80+CD11c+,M2样TAMs(CD11b)+F4/80+CD 206+)、全球伙伴关系计划+DC(CD 45)+F4/80CD11c+),CD4+T细胞(CD 45)+CD3+CD4+),CD8+T细胞(CD 45)+CD3+CD8a+MDSCs(CD 45)+CD11b+GR1+细胞)和Tregs(CD 45)+CD4+CD 25+Foxp 3+Pkh 26标记mps或man mps 15 mg蛋白kg静脉滴注后24 h,在荷瘤小鼠体内的肿瘤组织中(pfp表达的h22荷瘤小鼠的肿瘤组织中)。−1。数据表示为平均值±S.D。(n=每组4只小鼠;双向方差分析,后进行Bonferroni的多次比较)。gTAMS、肝枯否细胞、脾巨噬细胞、肺巨噬细胞中相对PKH 26 MFI(包括TAMS在内的所有巨噬细胞均为CD11b)。+F4/80+细胞)和脾脏DC(CD 45)+F4/80CD11c+H22荷瘤小鼠在治疗后24h的细胞),提示:f)。数据表示为平均值±S.D。(n=每组4只小鼠;双向方差分析,后进行Bonferroni的多次比较)。源数据作为源数据文件提供。

人-MPS的M2类TAM靶向能力在体内得到进一步证实。H22荷瘤小鼠静脉注射Cy5标记的MPS或Man-MPS。生物分布分析表明,给药后24h,MPS和Man-MPS主要聚集在肿瘤中,显示巨噬细胞源性MPS对肿瘤的靶向性。2D,e)。然而,在肿瘤组织中积累的人-MPS多于MPS(图中所示)。2D,e)。同时,Met@man-MPS治疗组肿瘤组织中Met积累量最高(附图)。5)。此外,表达绿色荧光蛋白(GFP)的H22荷瘤小鼠静脉注射PKH 26标记的MPS或MPS。给药后24h,将肿瘤组织消化成单细胞悬液,流式细胞仪检测细胞内PKH 26荧光。2F补充图6)。像M2一样,TAMS所占的男性议员数量比国会议员要多得多。此外,与gfp阳性肿瘤细胞、m1样肿瘤细胞、树突状细胞(Dc)、CD4等其他细胞相比,M2样tams细胞中的man-mps明显增多。+T细胞,CD8+T细胞、MDSCs和Tregs,提示人-MPS具有良好的M2样TAM靶向能力.共聚焦显微图像还证实,与肿瘤组织中的其他免疫细胞相比,更多的人-MPS与M2样TAMS共存(补充图)。7)。由于巨噬细胞来源的MPS的肿瘤靶向能力和CD 206在TAMS中的高表达(补充图)。8静脉注射PKH 26标记的人-MPS后24h,TAMS细胞的PKH 26荧光强度显著高于枯否细胞、脾巨噬细胞、脾DC和肺巨噬细胞。2G),不包括MAN-MPS在其他组织驻留的巨噬细胞和吞噬细胞中的靶向积累。同时,MPS主要与CD 206共定位。+肿瘤组织中的细胞(附图)。9)虽然CD 209是一种C型凝集素,但它也能结合甘露糖残基。44.

MET@Man-MPS有效地使M2样巨噬细胞重新分化为M1表型

在IL-4条件的RAW264.7细胞中,Met@Man-MPS从RAW264.7细胞中检测M2样巨噬细胞对M1表型的复极化作用。3A-E和补充图。10),表达典型的M2样巨噬细胞标记物(附图)。11A)。与PBS相比,MPS、MPS和游离Met处理Met@Mps显著提高了mrna的表达。肿瘤坏死因子αiNOS,CD 80和CD 86的蛋白表达(m1相关标记物),而m1相关标记物(M1)的mRNA表达下降。Arg 1, 姆尔克1Mgl1,CD 206(M2相关标记)的蛋白表达。然而,Met@Man-MPS表现出最强的M2巨噬细胞复极活性,甚至优于高剂量的游离Met(图1)。3A-E和补充图。10),在IL-4条件BMDMS(补充图)中得到证实.12)。此外,来自BMDMS的Met@Man-MPS也显示出极佳的M2巨噬细胞复极活性。13)。人单核THP-1来源于巨噬细胞的Met@Man-MPS和人外周血单核细胞源性巨噬细胞(MDMs)在IL-4条件性THP-1来源的巨噬细胞中进一步证实了类似的现象(补充图)。14)和MDMS(附图)。15)分别。提示Met@Man-MPS的M2样巨噬细胞复极活性是普遍存在的。化合物C(CC),一种AMPK抑制剂,可显著消除Met@man-MPS引起的M1相关标记物的增加(肿瘤坏死因子-αiNOS)和M2相关标记的减少(姆尔克1Arg 1)(附图。16与Met类似,Met@Man-MPS通过AMPK信号通路将M2样巨噬细胞重新极化为M1表型。在M2类巨噬细胞中,Caveolin-、clathrin依赖的内吞作用和吞噬作用参与了人-MPS的细胞摄取(附图)。17)。罗丹明B(一种模型药物)负载人-MPS(rhB@Man-MPS)的细胞内追踪分析表明,药物和曼-MPS一起进入M2样巨噬细胞,然后与溶酶体共存,然后随着时间的推移药物释放(补充图)。18).

图3:Met@Man-MPS使M2样巨噬细胞向M1表型的复极。

aeMRNA表达水平肿瘤坏死因子α (a), iNOS (b), 姆尔克1 (c), Mgl1 (d),以及Arg 1 (e)在IL-4条件的RAW 264.7细胞中,MPS、Man-MPS、游离Met、Met@Mps或Met@Man-MPS来源于20μg mL的RAW 264.7细胞。−1,或在200μg mL时高浓度Met。−1用实时RT-PCR法进行24h。数据表示为平均值±S.D。(n=4个生物独立样本;单向方差分析,TUKY‘s HSD后特设试验)。fhH22细胞活力f),4T1(g),以及HepG 2细胞(h)用pbs预处理的IL-4-条件RAW264.7细胞上清液处理后,MPS、Man-MPS、游离Met、Met@Mps或Met@Man-MPS来自RAW 264.7细胞,Met浓度为20μg mL。−1,或高剂量游离蛋氨酸200μg mL。−124小时,数据以±S.D表示。(n=4个生物独立样本;单向方差分析,TUKY‘s HSD后特设试验)。iH22细胞(8×10)皮下联合种植对BALB/c小鼠肿瘤形成的影响5经pbs、MPS、Man-MPS、游离Met、Met@Mps或Met@Man-MPS预处理的RAW264.7细胞,其Met浓度为20μg mL。−1,或高剂量游离蛋氨酸200μg mL。−1以1:2的比例进入BALB/c小鼠两侧24小时(n=每组8只)。j治疗后BALB/c小鼠肿瘤体积(i)。数据表示为平均值±S.E.M。(n=每组8只小鼠;双向方差分析,后进行Bonferroni的多次比较)。k治疗结束时的肿瘤重量(i)。数据表示为平均值±S.D。(n=8只小鼠/组,单因素方差分析(TUKY‘s HSD后特设试验)。源数据作为源数据文件提供。

典型的促炎m1样巨噬细胞通过分泌促炎细胞因子和活性氮及氧物种,具有抗肿瘤作用。13。为了进一步证实Met@Man-MPS的M2样巨噬细胞复极活性,我们测定了IL-4条件的RAW264.7细胞经MPS、Man-MPS、游离Met、Met@MPS或Met@Man-MPS或高剂量游离Met预处理后上清液的抗癌作用。如所料,M2样巨噬细胞的上清液能显著提高小鼠肝细胞癌H22细胞、人肝细胞癌HepG 2细胞和小鼠4T1乳腺癌细胞的存活率(附图)。11B)。然而,Met@man-MPS培养的M2类巨噬细胞的上清液与游离Met-或Met@MPS组相比,对这些癌细胞的细胞活力有较强的抑制作用,甚至比高剂量的Met组更有效(图1)。3F-h)。Met@Man-MPS培养的M2样巨噬细胞上清液的强细胞毒性可能是由于分泌的肿瘤坏死因子-α所致,Met@Man-MPS处理的M2样巨噬细胞上清液中TNF-α含量明显高于其他各组(补充图)。19A肿瘤坏死因子-α抑制剂依那西普(Etan)可显著降低Met@Man-MPS处理的M2巨噬细胞对H22的细胞毒作用。19b)和4T1细胞(补充图)。19C)。同时,Met@man-MPS处理的M2样巨噬细胞对H22有较强的吞噬作用。20A)和4T1细胞(补充图)。20b)。此外,我们还将这些培养的M2样巨噬细胞和H22细胞皮下共植入BALB/c小鼠的两侧,然后评估肿瘤的形成潜力。始终如一,肿瘤形成率最低(如图所示)。3I),肿瘤生长最慢(图一)。3J)和最小的肿瘤重量(如图所示)。3K)Met@man-MPS处理的M2样巨噬细胞与H22细胞共移植组。这些数据表明Met@Man-MPS有效地将M2样巨噬细胞重新分化为M1表型。

Met@Man-MPS显著抑制肿瘤生长,改善肿瘤免疫微环境。

为探讨Met@Man-MPS的生物学功能,测定了Met@Man-MPS在荷H22皮下荷瘤BALB/c小鼠体内抗肿瘤活性。免费Met、Met@MPS或Met‘Man-Met剂量为10 mg kg的MPS−1,或100毫克升甲硝胺高剂量−1每隔一天给H22荷瘤小鼠静脉注射6次。与游离蛋氨酸(10毫克千克)比较−1Met@MPS显著抑制肿瘤生长,肿瘤体积和重量分别减少41.6%和39.9%。4A,b)。然而,Met@Man-MPS具有最强的抗癌活性,肿瘤体积和重量分别减少了70.2%和63.2%,甚至优于高剂量的Met(图1)。4A,b)。Kaplan-Meier生存分析显示,Met@Man-MPS治疗组在63天后仍有86%的小鼠存活,远远高于Met@MPS和高剂量Met治疗组(图1)。4C)。苏木精-伊红染色(附图)。21A)和TUNEL分析(补充图。21b,c)肿瘤组织中Met@Man-MPS治疗组肿瘤细胞数量最少,凋亡细胞数最大,进一步证实Met@Man-MPS具有良好的抗癌活性。Met@Man-MPS在小鼠原位4T1乳腺肿瘤中也有类似的抗癌活性。MET@Man-MPS显示出最强的抑制肿瘤生长的能力(补充图)。22A)并延长存活时间(附图)。22b与游离Met、Met@MPS和高剂量Met相比。此外,Met@man-MPS治疗组通过计数结节数目发现的肺转移结节明显减少(补充图)。22C肺的H&E染色分析(附图)。22d)。此外,体重变化(补充图。23),主要器官的H&E染色(附图)。24)和血清学分析(附图)。25表明Met@Man-MPS虽高剂量引起肾毒性(补充图),但未引起明显毒性。2425).

图4:Met@man-MPS对H22荷瘤小鼠的抗癌活性及免疫微环境的改善。

a静注pbs、MPS、Man-MPS、游离Met、Met@Mps或Met@Man-MPS 10 mg/kg对H22荷瘤小鼠肿瘤生长曲线的影响−1,或100毫克升甲硝胺高剂量−1每两天六次。黑色箭头表示注入时间。数据以平均值±S.E.M表示。(n=每组5只小鼠;双向方差分析,后进行Bonferroni的多次比较)。b治疗结束时的肿瘤重量(a)。数据以平均±S.D表示。(n=5只小鼠/组,单因素方差分析(TUKY‘s HSD后特设试验)。c治疗后H22荷瘤小鼠的Kaplan-Meier生存图(a) (n=每组7只)。dk类似m1的TAMS数(d),M2型TAMS(e),CD8+T细胞(f),CD8+CD 69+T细胞(g),CD4+T细胞(h),CD4+CD 69+T细胞(i),MDSCs(j)和Tregs(kH22荷瘤小鼠静脉注射pbs后肿瘤组织中MPS、MPS、Met@Mps、Met@Mps或Met@Man-MPS(Met剂量为10 mg kg)。−1,或100毫克升甲硝胺高剂量−1每两天六次。数据以平均±S.D表示。(n=3只小鼠,每组3只;单向方差分析,TUKY‘s HSD后特设试验)。lo干扰素-γ含量l),肿瘤坏死因子-α(m),国际法委员会第12p70页(n),以及转化生长因子-β(o)H22荷瘤小鼠静脉注射pbs、MPS、Man-MPS、Met、Met@Mps或Met@Man-MPS 10 mg/kg后的肿瘤组织。−1,或100毫克升甲硝胺高剂量−1每两天六次。数据以平均±S.D表示。(n=3只小鼠,每组3只;单向方差分析,TUKY‘s HSD后特设试验)。源数据作为源数据文件提供。

在H22荷瘤小鼠静脉注射Met、Met@Mps或Met_man-MPS 10 mg/kg后,观察肿瘤免疫微环境的变化。−1,或100毫克升甲硝胺高剂量−1每隔一天六次。Met@Man-MPS一直表现出最强大的能力来增加m1类TAMS的数量(图1)。4D)并减少M2样TAMS的数量。4E)在肿瘤组织中。此外,Met@Man-MPS显著增加了CD8的数量。+T细胞(图1.4F),活化CD8+CD 69+T细胞(图1.4G),CD4+T细胞(图1.4H),以及活化的CD4+CD 69+T细胞(图1.4I),而MDSCs的数量却明显减少(图1)。4J)和Tregs(图1.4K)肿瘤组织中与游离Met、Met@MPS甚至高剂量Met比较。同时,Met@Man-MPS治疗可显著提高促炎症细胞因子IFN-γ的水平。4L),肿瘤坏死因子-α(图1.4m),以及IL12p70(图1)。4N降低抗炎细胞因子转化生长因子-β的水平。4O)在肿瘤组织中。Met@man-MPS诱导的肿瘤免疫微环境在4T1荷瘤小鼠中也得到了证实(附图)。26A-h提示Met@Man-MPS能有效增强抗肿瘤免疫,改善肿瘤免疫抑制。

为了确定巨噬细胞是否参与了Met@Man-MPS介导的抗肿瘤作用,我们使用氯膦酸脂质体来消耗H22荷瘤小鼠的巨噬细胞。正如预期的那样,氯膦酸脂质体有效地耗尽了巨噬细胞(补充图)。27A),而其他免疫细胞,如CD8+T细胞(附图)27b),CD8+CD 69+T细胞(附图)27C),CD4+T细胞(附图)27D),CD4+CD 69+T细胞(附图)27E),MDSCs(附图)。27F)和Tregs(附图)。27g)未受影响。巨噬细胞的耗竭破坏了Met@Man-MPS(补充图)的抗肿瘤作用。27H,i)。相应地,Met@Man-MPS诱导的肿瘤免疫微环境在巨噬细胞耗竭后消失(附图)。27b-g提示Met@Man-MPS的抗肿瘤作用和改善肿瘤免疫微环境是巨噬细胞依赖性的。众所周知,m1样巨噬细胞有吸收T细胞和促进Th1反应的能力。45。巨噬细胞耗竭后疗效的改善通常取决于细胞毒性CD8的增加或功能的增强。+T细胞46,47。CD8耗竭+使用抗CD8抗体的T细胞对Met@Man-MPS的抗癌能力有明显的抑制作用。28a,b)。此外,Met@Man-MPS对H22荷瘤裸鼠无明显的抑瘤作用(附图)。28C,d),表明CD8+T细胞参与Met@Man-MPS的抗癌活性。

MPS有效降解肿瘤胶原蛋白

肿瘤ECM由胶原网络和蛋白多糖组成,提供天然屏障,抵抗单核细胞浸润和治疗药物的积聚和渗透,从而产生免疫逃避和抗肿瘤治疗的抗药性。48。与RAW264.7巨噬细胞相似,来源于RAW264.7巨噬细胞的MPS和MPS过表达MMP 9和MMP 14蛋白(附图)。29A)。同时,MPS和Man-MPS在MMP活性检测试剂盒中表现出较高的MMP活性,Met负载对其MMP活性没有影响(补充图)。29B)。此外,Batimatat(一种广谱的MMP抑制剂)预处理可显著降低Met@Man-MPS(补充图)的MMP活性。29B),进一步证实了人-MPS的MMP活性。从THP-1来源的巨噬细胞衍生的MPS中也检测到MMP的高活性(附图)。29C)。评价mps和man-mps是否能通过MMP活性、PKH 26标记的mps或人-mps预处理或不加bati或4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)或4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)(一种丝氨酸蛋白酶抑制剂)(如参与激活多个MMPs的纤溶酶原激活系统)来降解肿瘤ECM。49)与Ⅰ型胶原膜孵育。I型胶原被MPS或Man-MPS有效降解,证明I型胶原与MPS或Man-MPS之间没有共定位现象(补充图)。30)。Bati或AEBSF预处理可显著降低MPS和MAN-MP诱导的I型胶原降解(附图)。30),表明MMP参与了MPS-和Man-MPS诱导的胶原降解。胶原含量测定还支持MPS和Man-MPS在浓度范围内有效降解胶原。31)和MMP依赖的方式。5A)。此外,H22荷瘤小鼠静脉注射pbs、mps、man-mps、游离Met、Met@mps或met_man-mps 10 mg/kg。−1,或100毫克升甲硝胺高剂量−1每隔一天不同的时间。用二次谐波发生(SHG)显微镜分析肿瘤的纤维胶原结构。5B,c)。PBS和游离Met治疗组肿瘤的SHG信号逐渐增加。然而,MPS和Man-MPS显著降低了胶原纤维网络的沉积,揭示了MPS和Man-MPS的胶原降解能力。始终如一地,将Met加载到MPS或Man-MPS中并不影响它们的胶原降解活性.对H22肿瘤组织I型胶原的免疫荧光分析进一步证实,MPS、Man-MPS、Met@MPS和Met@Man-MPS明显降低了肿瘤组织中的胶原面积。5D,e).

图5:人-MPS的胶原降解能力。

a可溶性Ⅰ型胶原与MPS或Man-MPS孵育后的相对胶原含量为75μg蛋白mL。−1用或不加0.6mg mL预处理−1BATI或100μg mL−1AEBSF用天狼星红总胶原检测试剂盒测定72 h。数据以平均±S.D表示。(n=3个生物独立样本;单向方差分析,TUKY‘s HSD后特设试验)。b静注pbs、MPS、Man-MPS、游离Met、Met@Mps或Met_Man-MPS 10 mg kg对H22荷瘤小鼠肿瘤组织的SHG成像−1,或100毫克升甲硝胺高剂量−1每两天一次不同的时间。图像是三只独立于生物的老鼠的代表。标尺:50μm。cH22荷瘤小鼠治疗后肿瘤组织中的相对SHG信号强度。b)。数据以平均±S.D表示。(n=3只小鼠的10个字段;双向方差分析,然后是Bonferroni的多重比较(后测)。dH22荷瘤小鼠静脉注射PBS、MPS、Man-MPS、Met、Met@MPS或Met_Man-MPS 10 mg/kg后肿瘤组织中Ⅰ型胶原(用Cy3-共轭胶原I抗体标记)的免疫荧光分析−1,或100毫克升甲硝胺高剂量−1每两天六次。细胞核用DAPI(蓝色)染色。图像是三只独立于生物的老鼠的代表。标尺:200μm。eH22荷瘤小鼠肿瘤组织中I型胶原相对阳性区d)。数据以平均±S.D表示。(n=3只小鼠5个字段;单向方差分析(TUKY‘sHSD后特设试验)。源数据作为源数据文件提供。

MET@Man-MPS诱导CD8+T细胞浸润肿瘤+T细胞与降解ECM

CD8+T细胞是由m1样巨噬细胞通过分泌一些趋化因子和细胞因子(如cxcl-9、cxcl-10、cxcl-11和tf-α)而形成的。50,51,52。Transwell分析表明,met@man-mps处理的M2类巨噬细胞能有效地吸收CD8。+T细胞(附图)32)。然而,肿瘤坏死因子-α抑制剂etan明显减少CD8的生成。+T细胞由Met@man-MPS处理的M2样巨噬细胞(补充图。32),提示met@man-mps处理的M2样巨噬细胞表达和分泌上调的肿瘤坏死因子-α参与了CD8的形成。+T细胞除了CD8的招募+T细胞进入肿瘤组织,降解的肿瘤细胞促进CD8的浸润。+T细胞转化为肿瘤实质53。免疫荧光分析表明,Met@Man-MPS显著增强了CD8的表达。+肿瘤组织内部T细胞数。6B,c)。确定Met@Man-MPS诱导的CD8+T细胞浸润是由于M2样TAM复极向M1表型的再极化和肿瘤ECM的降解所致,H22荷瘤小鼠经Bati或/及腹腔注射Etan后静脉注射Met@Man-MPS。6A)。Bati预处理显着降低Met@Man-MPS诱导的肿瘤组织胶原降解(附图)。33A,b治疗后肿瘤组织中肿瘤坏死因子-α含量明显降低(附图)。33C)。Bati预处理可显著消除Met@Man-MPS诱导的CD8。+T细胞在肿瘤组织的内部增加(如图所示)。6B,c)。此外,Met@Man-MPS显著增加了CD8的数量。+T(图)6d),CD8+CD 69+T(图)6E),和CD8+干扰素-γ+T细胞(图1.6f)流式细胞术在肿瘤组织中的表达。Etan或Bati预处理能显著降低Met@Man-MPS诱导的免疫细胞数量的增加(图1)。6d-f)。在Bati预孵育的Met@man-MPS和Etan处理组中,这些免疫细胞的数量最少(见图)。6d-f)。相应地,Bati/和Etan预处理后,Met@Man-MPS的抗癌活性显著降低。6g,h)。这些结果表明Met@Man-MPS诱导CD8的招募。+T细胞通过M2样TAMs的复极向M1表型转化和肿瘤细胞ECM的降解是CD8升高的原因之一。+T细胞浸润肿瘤组织内部,提高Met@Man-MPS的抗癌活性。

图6:MET@Man-MPS诱导的CD8+T细胞肿瘤吸收CD8浸润的研究+T细胞与肿瘤ECM的降解。

aMet@man-MPS诱导CD8的原理表+H22荷瘤小鼠T细胞肿瘤浸润分析。bCD8荧光图像+Bati(0.6mg mL)处理H22荷瘤小鼠肿瘤组织中的T细胞(用Cy3结合CD8抗体标记)−1)Met剂量为10毫克千克−1每两天一次,每次6次,或(或)腹腔注射剂量为5毫克千克的埃坦。−1每四天四次a)。肿瘤血管用FITC结合CD 31抗体(绿色)标记,细胞核用DAPI(蓝色)染色。肿瘤边缘用白色虚线标记。图像是三只独立于生物的老鼠的代表。标尺:200μm。cCD8+H22荷瘤小鼠肿瘤组织内或边缘区的T细胞数b)。数据以平均±S.D表示。(n=3只小鼠9个字段;单向方差分析(TUKY‘sHSD后特设试验)。dfCD8数+T细胞(d),CD8+CD 69+T细胞,e和CD8+干扰素-γ+T细胞(f)H22荷瘤小鼠经治疗后肿瘤组织中(a)。数据以平均±S.D表示。(n=每组6只小鼠,单程方差分析,TUKY‘s HSD后特设试验)。gH22荷瘤小鼠治疗后肿瘤体积的研究a。数据以平均值±S.E.M表示。(n=每组6只小鼠;双向方差分析,后进行Bonferroni的多次比较)。hH22荷瘤小鼠经治疗后的肿瘤重量a)。数据以平均±S.D表示。(n=每组6只小鼠,单程方差分析,TUKY‘s HSD后特设试验)。源数据作为源数据文件提供。

MET@Man-MPS有效增强抗pd-1抗体的肿瘤蓄积和穿透性。

肿瘤组织中浓缩的ECM对肿瘤的聚集和抗pd-1抗体的穿透有重要影响。54。以人-MPS的胶原降解能力为基础,研究了Met@Man-MPS对H22荷瘤小鼠抗Pd-1抗体蓄积的影响。PBS或Met@Man-MPS每隔一天或不经Bati处理2次,然后腹腔注射Cy5结合抗PD-1抗体,于注射后24h测定不同组织中Cy5的荧光。7a,b)。MET@Man-MPS可显著增加抗Pd-1抗体在肿瘤中的蓄积.而Bati预处理可消除Met@Man MPS诱导的抗Pd-1抗体的肿瘤蓄积,提示Met@Man-MPS的胶原降解能力是增强抗Pd-1抗体的肿瘤蓄积的机制之一。

图7:Met@man-MPS增强肿瘤蓄积和抗Pd-1抗体的渗透。

aH22荷瘤小鼠抗Pd-1抗体的肿瘤聚集及穿透性分析。b用Cy5标记抗PD-1抗体(每只小鼠100 g)和met@man-mp预处理后H22荷瘤小鼠不同组织和肿瘤组织中抗pd-1抗体的相对含量(0.6mg mL)−1)Met剂量为10毫克千克−1在(a)。数据以平均±S.D表示。(n=4只,每组4只,单程方差分析,TUKY‘sHSD后特设试验)。cCy5标记抗PD-1抗体(红色)与FITC结合CD 31抗体(Green)标记的内皮细胞在H22荷瘤小鼠经Cy5标记抗PD-1抗体(每只小鼠100 g)和Met@Man-MPS预处理后(0.6mg mL)肿瘤切片中的共定位−1)Met剂量为10毫克千克−1在(a)。细胞核用DAPI(蓝色)染色。图像是3只独立于生物的小鼠的代表。标尺:50μm。d肿瘤实质中Cy5与血管内Cy5的比值c。数据以平均±S.D表示。(n=15场,3只小鼠;单向方差分析,TUKY‘s HSD后特设试验)。eH22荷瘤小鼠经bati或不含bati(0.6mg mL)静脉注射Met@Man-MPS后Cy5渗出及渗入肿瘤组织的时移成像−1)Met剂量为10毫克千克−1每隔一天两次,然后静脉注射Cy5标记的抗PD-1抗体(每只小鼠100克,红色)。用荧光素标记番茄凝集素(绿色)标记血管.箭头显示血管外抗Pd-1抗体。图像代表了两只独立于生物的老鼠。标尺:10μm。f注射后10 min血管内最大Cy5荧光(以%vmax表示)e。数据以平均±S.D表示。(n=2只小鼠的10个字段;双向方差分析,然后是Bonferroni的多重比较(后测)。源数据作为源数据文件提供。

其次,我们评价了Met@Man-MPS对抗Pd-1抗体肿瘤穿透性的影响.H22荷瘤小鼠静脉注射pbs或Met@Man-MPS,每隔一天用或不含Bati处理2次,然后腹腔注射Cy5-结合抗PD-1抗体。注射24h后,用异硫氰酸荧光素(FITC)结合CD 31抗体对肿瘤组织进行染色,并进行共聚焦显微镜观察。7A、c、d)。抗Pd-1抗体与CD 31标记的肿瘤血管高度共定位,虽然肿瘤血管具有渗透性,但内源性IgG分布于整个肿瘤组织中(补充图)。34)。MET@Man-MPS治疗后肿瘤组织中抗Pd-1抗体分布广泛,提示抗Pd-1抗体从肿瘤血管外渗,然后渗透到肿瘤组织中。然而,Bati预处理的Met@Man-MPS组抗Pd-1抗体的肿瘤穿透率有所降低,表明抗Pd-1抗体的肿瘤穿透是由Met@Man-MPS诱导的胶原降解在肿瘤组织中实现的。此外,建立背侧皮肤窗腔肿瘤模型,直接观察抗Pd-1抗体的外渗和肿瘤穿透情况。7E,f)。肿瘤形成后,每隔一天给小鼠静脉注射PBS或Met@Man-MPS,每隔一天用Bati预处理两次。肿瘤血管注射荧光素结合番茄凝集素标记肿瘤血管,然后静脉注射Cy5结合抗PD-1抗体。实时观察显示,虽然抗Pd-1抗体主要保留在血管内或血管周围,但Met@Man-MPS治疗后血管内抗PD-1抗体迅速外溢,并随时间的推移分布于血管外区。而Bati预处理可明显降低Met@Man MPS诱导的抗Pd-1抗体的外渗和肿瘤穿透性,证实Met@Man-MPS可通过胶原降解促进抗Pd-1抗体在肿瘤组织中的渗透。

MET@Man-MPS有效提高抗pd-1抗体的抗癌活性

针对肿瘤免疫微环境的重塑,如CD8的富集等。+T细胞,免疫抑制细胞下调,PD-L1表达上调(附图)。35以H22荷瘤小鼠为研究对象,首次观察了Met@Man-MPS对抗Pd-1抗体抗癌活性的影响,以及Met@Man-MPS增强抗Pd-1抗体的肿瘤蓄积和穿透作用。8A-I)。如所料,单独使用Met@Man-MPS或抗PD-1抗体治疗显示出显著的抗癌活性.人-MPS治疗可显著提高抗PD-1抗体的抗癌活性,这可能是由于MAN-MPS的胶原降解增强了抗Pd-1抗体的肿瘤蓄积和穿透所致。Met@man-MPS和抗Pd-1抗体的结合产生了最强的协同抗癌作用,没有明显的毒性(补充图1)。36),导致60%的小鼠没有肿瘤。Kaplan-Meier生存分析表明,Met@Man-MPS和抗PD-1抗体治疗组小鼠70d后100%仍存活,优于其他各组。重要的是,与其他群体相比,CD8+Met@Man-MPS和抗PD-1抗体治疗组脾脏效应记忆T细胞显著增加(图一)。8j)。为了进一步研究Met@Man-MPS和抗PD-1抗体联合应用对记忆性T细胞反应的影响,我们采用肿瘤再刺激模型。当Met@Man-MPS和抗PD-1抗体处理组小鼠在治疗后70d再次接种H22细胞时,100%的小鼠不接受肿瘤的再刺激,直至25d,而在同样数量的细胞同时接种的天真小鼠中则观察到肿瘤的持续生长(如图1所示)。8K)。同时,CR小鼠接种4T1细胞后,肿瘤形成率为100%。8L)。提示Met@Man-MPS和抗PD-1抗体联合治疗可产生免疫记忆,诱导长期抗肿瘤作用。Met@man-MPS与抗Pd-1抗体联合应用在恶性程度较高的4T1原位肿瘤模型中具有良好的协同抗肿瘤活性。抗Pd-1抗体对4T1荷瘤小鼠的肿瘤生长和肺转移无明显抑制作用(附图)。37A-E)。然而,Man-MPS和抗Pd-1抗体的结合明显阻止了肿瘤的发展(补充图)。37B)并抑制肺转移(附图)。37C-e)。Met@Man-MPS与抗Pd-1抗体的结合产生了最强的协同抗癌作用,使肿瘤收缩率达到75.0%(附图)。37B转移抑制率为81.2%(附图)。37C,d)和更长的存活时间(补充图。37F).

图8:抗Pd-1抗体与Met@Man-MPS联合应用对H22荷瘤小鼠的抗癌作用。

aH22荷瘤小鼠抗癌实验示意图。bgPBS对H22荷瘤小鼠个体肿瘤生长曲线的影响(英文)b),男议员(c),Met@Man-MPS(d),抗pd-1抗体(e)、人-MPS和抗PD-1抗体(fMet@Man-MPS和抗PD-1抗体(g抗pd-1抗体剂量为每只小鼠100 g/只,Met剂量为10 mg kg/只。−1在(a). hH22荷瘤小鼠的平均肿瘤生长曲线a。数据以平均值±S.E.M表示。(n=每组10只小鼠;双向方差分析,然后是Bonferroni的多重比较,后测)。i治疗后H22荷瘤小鼠的Kaplan-Meier生存图(a) (n=每组10只)。jCD8数+效应记忆T细胞(CD3)+CD8+CD 44+CD62LT细胞)在H22荷瘤小鼠脾脏中的作用a。数据以平均±S.D表示。(n=每组6只小鼠,单程方差分析,TUKY‘s HSD后特设试验)。k, lH22细胞(3×10)再刺激后肿瘤生长曲线6细胞,k)和4T1细胞(1×10)6细胞,l)在天真的小鼠或抗PD-1抗体与Met@Man-MPS联合治疗的小鼠中(a)。肿瘤发生小鼠的比例在括号中显示。数据以平均值±S.E.M表示。(n=10对于天真的老鼠,n=6抗PD-1抗体及Met@Man-MPS治疗小鼠)。源数据作为源数据文件提供。

以甲氧甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎相关癌(CAC)小鼠模型,进一步证实了Met@Man MPS和抗Pd-1抗体联合诱导的抗肿瘤活性和肿瘤免疫微环境的改善。9A)。Met@Man-MPS明显减少了大肿瘤的数量(如图所示)。9B和补充图。38)。抗Pd-1抗体的抗肿瘤活性明显提高。9B和补充图。38)。Met@man-MPS和抗Pd-1抗体联合在大肿瘤中产生最强的协同抑制作用(图1)。9B和补充图。38)。H&E染色也证实了Met@man-MPS和抗Pd-1抗体联合应用的抗肿瘤作用最强(附图)。39)。Met@Man-MPS和抗PD-1抗体治疗的小鼠体重下降较少(补充图)。40)。同时,肿瘤免疫微环境分析显示,Met@Man-MPS显著增加了m1样TAMs的百分比(图1)。9C),CD8+T细胞(图1.9E),活化CD8+T细胞(图1.9F),以及活化的CD4+T细胞(图1.9H),而M2样TAMS所占百分比下降(图1)。9d),MDSCs(图1.9I)和Tregs(图1.9J)。然而,Met@man-MPS和抗Pd-1抗体的结合显示出最强的能力来重塑肿瘤的免疫微环境(如图所示)。9C-j).

图9:抗PD-1抗体与Met@Man-MPS联合应用对AOM/DSS诱导的CAC小鼠的抗肿瘤活性及肿瘤免疫微环境的改善。

aAOM/DSS诱导的CAC小鼠抗癌实验示意图。bPbs、man-mps、met@man-mp、抗pd-1抗体、Man-mps和抗pd-1抗体联合治疗的CAC小鼠肿瘤数目>3mm和<3mm,或抗pd-1抗体与met@man-mps和抗pd-1抗体联合使用,抗pd-1抗体剂量为100 g/只,Met剂量为10 mg kg。−1在(a)。数据以平均±S.D表示。(n=5只小鼠/组,单因素方差分析(TUKY‘s HSD后特设试验)。cjM1类TAMS的百分比(c),M2型TAMS(d),CD8+T细胞(e),CD8+CD 69+T细胞(f),CD4+T细胞(g),CD4+CD 69+T细胞(h),MDSCs(i)和Tregs(j抗pd-1抗体剂量为100 g/只,Met-mps抗体剂量为100 g/只,met-mps与抗pd-1抗体联合使用,抗pd-1抗体剂量为100 g/只,met-mps与抗-pd-1抗体联合使用,每只小鼠100 g/只,抗pd-1抗体剂量为10 mg/kg。−1在(a)。数据以平均±S.D表示。(n=5只小鼠/组,单因素方差分析(TUKY‘s HSD后特设试验)。源数据作为源数据文件提供。

目的:探讨Met@man-MPS与抗Pd-1抗体联合应用是否能促进原位抗肿瘤免疫(附图)。41)我们采用了新鲜人肿瘤的组织型离体切片培养模型。在同一患者外周血单个核细胞(PBMCs)存在THP-1来源的Met@Man-MPS、抗PD-1抗体或Met@Man-MPS和抗PD-1抗体存在的情况下,对1例肝癌患者的器官切片进行培养。Met@Man-MPS能明显诱导肿瘤细胞凋亡(图1)。10A)。同时,Met@Man-MPS明显改变了肿瘤的免疫微环境,m1样TAM百分比的增加证明了这一点(图1)。10b),M2样TAM百分比下降(图1)。10C),CD8的浸润和活化增强。+T细胞(图1.10d-g)在肿瘤组织中。然而,在肿瘤细胞中诱导凋亡的能力最强(如图所示)。10A)最强的CD8+T细胞活化(图1.10d-f在Met@Man-MPS和抗PD-1治疗组中观察到,这在另一个肝癌患者源性肿瘤的有机切片中得到进一步证实(补充图1)。42)。这些结果有力地支持了Met@Man-MPS有效地重塑肿瘤微环境和提高抗Pd-1抗体的抗癌活性的观点。

图10:抗Pd-1抗体与Met@Man-MPS联合应用于肝癌组织切片中诱导细胞凋亡及改善肿瘤免疫微环境。

a肿瘤细胞凋亡率(CD 45))用抗人pd-1抗体、来源于thp-1的巨噬细胞的met@man-mps或met?mps+抗人pd-1抗体,在20μg mL和40μg mL的浓度下,对肿瘤组织进行抗人pd-1抗体处理。−1在PBMCs存在下,分别作用36h。数据以平均±S.D表示。(n=3个生物独立样本;单向方差分析,TUKY‘s HSD后特设试验)。(bg)M1类TAMS的百分比(b),M2型TAMS(c),CD8+T(d),CD8+CD 69+T(e),CD8+干扰素-γ+T(f),和CD8+GzmB+T细胞(g)在抗人pd-1抗体治疗后的肿瘤切片中,抗pd-1抗体浓度为20和40μg mL时,来源于thp-1的巨噬细胞的met@man-mps或met_man-mps+抗人pd-1抗体的浓度分别为20和40μg mL。−1在PBMCs存在下,分别作用36h。数据以平均±S.D表示。(n=3个生物独立样本;单向方差分析,TUKY‘s HSD后特设试验)。源数据作为源数据文件提供。

讨论

在本研究中,我们开发了人修饰的巨噬细胞源性MPS负载Met(Met@Man-MPS),以提高抗PD-1抗体的抗癌活性。与肿瘤组织中的其他免疫细胞和肿瘤细胞及其他组织驻留的巨噬细胞相比,Met@Man-MPS在M2样TAMs中大量积累,导致M2样TAMS向M1表型的复极。Met@Man-MPS-复位巨噬细胞不仅直接杀伤和吞噬肿瘤细胞抑制肿瘤生长,还可能产生肿瘤抗原来增强细胞毒性T细胞的肿瘤识别能力,增强抗PD-1的治疗效果。同时,met@man-mps-复位巨噬细胞能有效地重建抗肿瘤免疫微环境,通过减少Tregs和mdSCs的数量,增加CD8的吸收,改善抗pd-1的治疗。+T细胞在肿瘤组织中的作用,表现为巨噬细胞的大量耗竭,显著抑制了Met@Man-MPS诱导的肿瘤免疫微环境的改善。CD8的招募+T细胞进入肿瘤组织可能是由于met@man-mps-α等巨噬细胞分泌的趋化因子和细胞因子所致,因为met?man-mps处理的M2样巨噬细胞中α的表达和分泌显著增加,而tf-α的抑制剂etan则显著降低了CD8的生成。+T细胞由Met@man-MPS处理的M2样巨噬细胞进行跨阱迁移试验。更重要的是,腹腔注射Etan可明显减少CD8的增加。+Met@Man-MPS诱导H22荷瘤小鼠肿瘤组织T细胞。然而,其他趋化因子和细胞因子是否参与了Met@Man-MPS诱导的CD8的生成。+T细胞尚待阐明。

增强肿瘤免疫原性,重塑肿瘤免疫抑制微环境,增加CD8。+T细胞募集、CD8浸润+T细胞进入肿瘤内部,增强肿瘤的聚集和pd-1抗体的穿透性,对于改进抗pd-1治疗也有重要意义。6,9,10。MMPs过度表达MMP 9和MMP 14蛋白,导致肿瘤胶原蛋白的有效降解。人-MPS诱导的肿瘤胶原降解有利于CD8的浸润。+用MMP抑制剂Bati预处理后,T细胞进入肿瘤内,肿瘤聚集并穿透抗Pd-1抗体,明显消除了Met@Man-MPS诱导的这种效应。重要的是,H&E染色分析表明,Man-MPS引发的肿瘤胶原降解不能诱导H22荷瘤小鼠的肿瘤转移,显示出良好的生物安全性。然而,MMP在Man-MPS引起的肿瘤胶原降解中起着重要作用,需要进一步澄清.同时,bati和它的衍生物marimastat一样,具有类似胶原的羟基化结构,可以与非mmp的非目标金属蛋白酶结合。55。除MMPs外,其他金属蛋白酶是否参与Met@Man-MPS的生物学功能仍有待阐明。

鉴于上述事实,Met@Man-MP有效地整合了抗PD1抗体的治疗效果,在H22荷瘤小鼠、4T-1荷瘤小鼠、AOM/DSS诱导的CAC小鼠,甚至是新鲜人类肿瘤的有机体内切片培养模型中,产生了显著的抗癌活性。Met@Man-MPS来源于RAW 264.7细胞、BMDMs、THP-1来源的巨噬细胞和人MDM,M2样巨噬细胞对M1表型的复极化活性相似,表达MMP,表明不同巨噬细胞来源的MPS具有普遍性特征。为了最大限度地提高Met@Man-MPS的治疗效果,需要进一步探索几个领域。颗粒大小对药物动力学和组织生物分布有重要影响。发育大小分布较窄的人-MPS是静脉输注Met的理想方法;最近有报道称,m1样巨噬细胞衍生外显子可使M2样tams重极化为m1表型。56,并被DC和巨噬细胞吸收,以诱导Th1细胞因子池的释放。57。因此,从m1类巨噬细胞中提取MAN修饰的MPS来负载Met,可以发挥更好的抗癌活性,改善肿瘤的微环境,增强抗Pd-1抗体的治疗效果,同时也需要优化Met的负载量和给药时间。

尽管Met@Man-MPS和抗PD-1抗体在免疫能力强的小鼠模型中具有令人鼓舞的疗效和令人满意的安全性,但是已经非常小心地将这个治疗平台从工作台移植到人体临床试验。首先,制造曼-MP的巨噬细胞资源将是一个关键问题.在临床应用中,最好是使用人类MDM,而不是以永生化细胞作为供体细胞来制备Met@Man-mp,因为细胞系没有必要的“自我”特性来避免免疫系统的识别。58。然而,人力MDM的可用性和开发一个健壮的、可伸缩的过程将是一个挑战。来源于永生化肿瘤细胞系的MPS已在临床上应用于癌症患者。59。解决由异基因细胞衍生的MPS引起的免疫反应的潜在风险需要进一步阐明。第二,GMP生产部门的MP组成和含量的质量控制标准,以及药品的包封效率和装载量是必不可少的。

总之,本研究的数据显示met@man-mp有效地针对M2类tams,使m1样表型重新分化,从而导致CD8的出现。+T细胞进入肿瘤组织,改善肿瘤免疫抑制微环境。另外,MPS的胶原降解能力对CD8的浸润也有一定的促进作用。+T细胞进入肿瘤内部,增强肿瘤的聚集和抗Pd-1抗体的穿透性.Met@Man-MP具有这些独特的特性,有效地提高了抗PD1抗体治疗的抗癌活性,产生了长期的记忆免疫。这些发现表明,Met@man-MPS可能会增加目前抗Pd-1治疗对肿瘤耐药的治疗工具。


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