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疫苗和放疗联合治疗方案增强荷瘤宿主免疫

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发表时间:2021-01-22 10:19作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

免疫治疗的一个主要障碍是效应免疫细胞对肿瘤微环境的浸润不足。放疗大大减轻了肿瘤负担,但复发经常发生。在此,我们发现免疫抑制性肿瘤微环境是通过放射后补充Tregs逐渐建立起来的。尽管肿瘤在照射区的Tregs耗竭后得到控制,但小鼠存活率的改善仍然很差。与其他治疗方法相比,接种疫苗和放射治疗的抗肿瘤效果要好得多。疫苗接种后,放射在肿瘤区域吸收了更多的效应T细胞,这些T细胞对高水平的趋化因子有反应。连续联合接种和放射治疗可引起不同的宿主免疫应答。我们的研究表明,为了获得有效的抗肿瘤免疫反应,需要辐射和疫苗的最佳组合。我们提出了一种可以很容易转化为临床的联合方案,为癌症治疗中合理的联合治疗设计提供了机会。

导言

原发性肿瘤诱导的免疫抑制微环境有利于肿瘤的进展1。调节性T细胞(Tregs)进入肿瘤微环境(TME)具有重要的免疫抑制作用,抑制T细胞自发免疫。2,3,导致肿瘤生长和病人预后不良。4。临床上,高密度Tregs和精疲力竭的CD8+T细胞已在肝癌中被发现。5、胃癌6,以及上皮性卵巢癌7,与肿瘤的进展密切相关。相反,CD8的高比率+T细胞与Tregs细胞在多种癌症中的存活率呈正相关。7,8,9。这表明CD8+/Treg比值可能是与肿瘤进展和患者生存相关的指标。

放射治疗是目前50%的癌症患者的标准治疗方法。10。越来越多的证据表明,辐射引起的潜在免疫抑制效应可能阻碍T细胞活化,进而阻止受照射肿瘤转化为“原位”疫苗。人们试图通过调节Treg在肿瘤中的数量来阻止Treg活性,但未能改善Treg诱导的免疫抑制,导致免疫力低下。11。最近的一项研究表明,即使是凋亡的Treg细胞也能维持和增强其抑制T细胞免疫的能力。12。重要的是,临床数据显示,只有RT才能有效地激发癌症患者的抗肿瘤免疫。13,14。一个主要原因可能是单纯的RT不能诱导足够的外周效应免疫细胞并将其吸收到受照射的肿瘤中。最佳的治疗协同作用正在成为临床癌症治疗中的一个关键问题。

针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原CTLA-4或程序性死亡pd-1的疫苗或免疫检查点抑制剂被报道可增强活性抗肿瘤免疫应答。15,16,17。蛋白抗原作为疫苗具有刺激淋巴细胞反应和诱导有效CTL反应的能力。18。然而,抗肿瘤效应免疫细胞在实体瘤中的浸润不足。19可能是阻止免疫治疗充分发挥潜能的主要障碍。一些研究强调了辐射将肿瘤转化为炎症周围组织的潜力。这是通过诱导趋化因子如CCL 5和CXCL 9/10来实现的,这两种趋化因子参与了表达CCR 5和CXCR 3等受体的效应T细胞的募集。20,21。CXCL 9、CXCL 10、CXCL 11和CCL 5在预处理肿瘤中的过表达与治疗反应性有关。22。阻断干扰素-γ或cxr 3可显著减少CD8的积累。+肿瘤部位T细胞23。此外,充分的T细胞浸润到TME是克服肿瘤抵抗检查点封锁的先决条件。24。摘要肿瘤mhcⅠ类(mhc-Ⅰ)表达缺失是常见于恶性肿瘤细胞中的一种,可诱导肿瘤免疫逃逸。25引起免疫治疗耐药性26。虽然免疫疗法被认为为抗肿瘤作用提供了足够的T细胞,但目前尚不清楚需要哪些介质来改善免疫耐药癌症的免疫治疗反应。

几项研究表明,当辐射与肿瘤特异性疫苗结合时,免疫反应增强。27,28。肿瘤疫苗通常被认为是RT诱导的免疫细胞的一种助推器,因此,在RT后接种疫苗可以获得有效的抗肿瘤活性。27。其他研究人员已经证明,辐射后的疫苗增强了受照射肿瘤的抗肿瘤免疫力。29。然而,很少有研究集中于免疫接种和RT连续组合是否能诱导足够的效应T细胞来克服Tregs在晚期和转移性肿瘤中的功能。目前尚不清楚放射治疗的最佳时机和顺序,并结合疫苗接种,以获得对晚期肿瘤的有益效果,且副作用较少。

针对癌蛋白E7的人乳头瘤病毒16型(Hpv 16)疫苗可以避免自身抗原的免疫耐受,被认为是治疗hpv相关恶性肿瘤的理想选择。30。为了获得特异性T细胞介导的应答,许多研究集中在纳米粒子疫苗上,用于抗原和佐剂的共传递。31。然而,受适当尺寸和其他性质的限制,疫苗很少进入CD8α。+树突状细胞(DC)位于淋巴结旁深部,主要介导CD8的产生。+T细胞反应。基于PEG-PE胶束的疫苗具有一些独特的特性,可以有效地将抗原传递到CD8α中。+Dcs并提供增强抗原特异性ctl反应。32。我们曾报道过含有特异性E7抗原和单磷酸脂A(MPLA)佐剂的PEG-PE胶束疫苗具有令人印象深刻的抗肿瘤作用,并已与外科手术或化疗相结合进行了研究。33。在本研究中,我们试图探讨RT与PEG-PE胶束疫苗的结合对实体瘤小鼠产生最佳免疫应答和持久治疗的作用。本研究以人乳头瘤病毒16 E6和E7转化的小鼠TC-1细胞为非转移性宫颈癌模型,以萤火虫荧光素酶cDNA表达载体(Luc2)转染的4T1-Luc2细胞作为转移性乳腺癌模型,预测HPV-16 E7(43-62)和9-聚肽Luc2(160-168)在免疫后产生特异性T细胞反应,并能增强哺乳动物宿主的免疫原性。我们发现,放疗后,肿瘤变得更加免疫抑制,表现为Tregs群体的增加,这是通过以前的疫苗接种而不是其他治疗来克服的。我们的发现提供了一个洞察的最佳时机和顺序的结合,辐射和疫苗,以影响免疫微环境的肿瘤。重要的是,我们提出的联合方案将进一步考虑转换到临床,特别是顽固性和不可切除的肿瘤。

结果

荷瘤小鼠宿主免疫抑制的特点是CD8比值逐渐降低。+T细胞转Tregs

髓源性抑制细胞(Mdscs)和胸腺干细胞(Tregs)均有助于宿主免疫抑制,并导致外周和肿瘤T细胞失活,导致肿瘤免疫逃逸。34。我们的结果发现MDSCs(CD11b)+GR1+)和Tregs(CD4)+CD 25+Foxp 3+)肿瘤植入后第21、28天显著升高(附图)。1A,b表明Tregs和MDSCs都可能影响宿主肿瘤的免疫应答。RT后在TME中检测到这两群细胞时,Tregs的百分比明显增加,而MDSCs的百分比却无明显增加(附图)。2F,g)。提示Tregs在放疗耐药中起主导作用。与无瘤小鼠相比,CD8显著降低。+T细胞与CD8比值+荷瘤小鼠T细胞转Tregs(附图)。1C,d随着肿瘤的进展,这种下降趋势更为明显。因此,提高CD8的比率+T细胞到Tregs以克服肿瘤所造成的免疫抑制可能是肿瘤免疫治疗的一种策略。

辐射增加肿瘤环境中TIL的数量和增强免疫抑制

RT已被报道增加抗肿瘤免疫反应。CD 45是一种白细胞共同抗原。35,并用于鉴别白细胞和非白细胞。为了了解rt如何影响肿瘤浸润淋巴细胞(Tils),我们测定了mhc-1分子在非白细胞(Cd 45)上的表达。)和白细胞(CD 45)+),并发现与未照射对照肿瘤相比,放疗后非白细胞和白细胞中MHC-1的表达水平显著升高(附图)。2A-C)。此外,照射还可触发白细胞向肿瘤的浸润,其表现为CD 45的比例增加了约2倍。+细胞与未照射肿瘤的比较(附图)。二维空间)。虽然CD8+肿瘤放疗后T细胞明显升高(附图)。2E),CD8的百分比+T细胞低(~0.3%)。这就引出了辐射是否会诱发更多的Tregs(CD4)的问题。+CD 25+Foxp 3+)在肿瘤中。如预期的那样,我们发现照射导致肿瘤中Tregs的比例比未照射的肿瘤增加2.1倍(12.13%vs 5.74%,附图)。2F)。然而,肿瘤中MDSCs的百分比在放疗后并没有升高(附图)。2G)。我们的结果表明,Tregs的增加而非MDSCs的增加主要是该肿瘤模型中辐射诱导的免疫抑制的原因之一。

临床报告表明,RT后肿瘤复发增加了转移,并给癌症患者带来了不良结果。36。最近的证据表明RT增加了TME中的抑制性Tregs。37。为了探讨放疗诱导的Tregs是否与放疗后复发有关,我们建立了两种肿瘤模型(TC-1和4T1-Luc2),并将照射选择性地传递到肿瘤上。两种不同的放射治疗采用单次剂量为12 Gy或连续两次剂量为8Gy(图5)。1A,e2A)。照射后肿瘤生长持续约10天无进展,但随后迅速生长(图4)。1D,f2B,c)。值得注意的是,与未受照射的小鼠相比,受照射肿瘤的小鼠存活率没有明显改善(图1)。1g).

图1:放射治疗对局部肿瘤和生存的影响。

aTC-1肿瘤模型的实验过程及治疗。b, c流式细胞术分析(n=每组4只)。CD8+T细胞的动态变化b)和CD8+T细胞/Tregs比值(c)在肿瘤中。dRt治疗前后荷瘤小鼠肿瘤生长曲线(n=每组10只)。e4T1-Luc2肿瘤模型的实验过程及治疗。f4T1-Luc2荷瘤小鼠放疗前后肿瘤生长曲线。g4T1-Luc2荷瘤小鼠无论是否接受放射治疗的生存情况(n=每组10只)。结果以平均±SD表示。实验重复了两次和两次。t-试验用于生物复制物的比较。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

图2:RT诱导的Tregs是肿瘤复发的主要原因。

a实验程序。bTC-1和Tc-1的肿瘤生长曲线c4T1-Luc 2肿瘤模型。n=10只小鼠/组。dfTC-1肿瘤的流式细胞分析。dCD 45动态变化百分比+肿瘤细胞随时间的变化。eTregs(CD 45+CD4+CD 25+Foxp 3+)随时间的动态变化百分比。fCD8比值+肿瘤T细胞对Tregs的作用随时间延长。g肿瘤组织中趋化因子水平(PG/mg蛋白)。数据以平均值±SD表示;n=3~4只小鼠/组。h抗体耗竭实验程序。iTC-1肿瘤生长曲线的小鼠,无论是否有抗体耗竭。j荷瘤小鼠经抗体耗竭治疗后的生存曲线。n=9只小鼠/组。实验重复了两次和两次。t-生物复制的双向比较。*P < 0.05, **P < 0.01.

其次,应用流式细胞术检测肿瘤组织中TIL的表达。与未照射肿瘤相比,CD 45所占比例较高。+照射后第7天肿瘤细胞明显增多,第14天细胞减少(如图所示)。二维空间)。第14天的Tregs数是第7天的3倍(图1)。2E),提示Tregs可能是放疗后复发的原因。同样,照射后肿瘤的CD8比值也明显下降。+T细胞转Tregs伴肿瘤进展(第7天为4.52,第14天为0.70;P与未照射肿瘤比较(图0.007)。2F)。两次剂量8Gy治疗的TC-1肿瘤模型也取得了类似的结果(如图所示)。1b,c)。肿瘤内趋化因子的表达与TIL的存在密切相关。38。为了确定放射是否刺激与趋化因子有关的T细胞反应,我们分析了放疗后第2天、第7天和第14天肿瘤组织中趋化因子的水平。与对照相比,RT后第2天和第7天CCL 5水平显著升高,第14天下降至对照水平。CXCL 9、CXCL 10和CCL 11在RT后第2天有所升高,第7和第14天下降(见图)。2G)。随着时间的推移,趋化因子水平的这些变化表明,RT诱导趋化因子在早期阶段招募效应T细胞,但未能维持其持久效果。

此外,CD8比值下降+Tregs的T细胞似乎在抑制TME中的适应性免疫反应中起着关键作用。这表明CD8的耗竭+T细胞仅轻度阻断rt的作用,而CD 25的耗竭作用。+T细胞进一步增强了这一作用。2I)。然而,与单纯的RT相比,CD 25的耗竭+细胞加RT不能改善荷瘤小鼠的生存(图一)。2J)。这表明,仅抑制Tregs等负性调节因子并不足以增强抗肿瘤免疫。获得有效的抗肿瘤免疫可能需要提高CD8的比率。+效应T细胞至Tregs。

RT和疫苗的序贯组合改变CD8的比值+肿瘤环境中的T细胞/Tregs

疫苗可诱导多种表位、T细胞介导的免疫和刺激CD8效应T细胞,为肿瘤免疫治疗提供了有效的免疫应答。15。据报道,照射前第一次接种疫苗可诱导较高水平的CD8。+干扰素-γ+T细胞比照射后有更好的抗肿瘤活性。29。同时也表明,照射与免疫联合只对肿瘤的生长有一定的抑制作用,而CD8的含量则有所增加。+T细胞浸润20。在本研究中,我们发现单独照射只维持了约10天的肿瘤消退,之后肿瘤迅速复发,CD8比值逐渐下降。+T细胞/Tregs在TME中。因此,我们认为接种疫苗预处理可以诱导出更多的效应因子CD8。+T细胞浸润肿瘤,可克服RT诱导的Tregs免疫抑制功能。为了解决这一假设,我们采用两种不同的联合接种疫苗(E7+RT)和照射后3天的接种(RT+E7),比较了TC-1肿瘤模型中TIL的分离肿瘤重量和群体。作为CD8的百分比+T细胞与CD8比值+T细胞对Tregs的作用随照射时间的延长而动态变化,照射后第14天T细胞相对稳定(图1)。1B,c在放疗后第14天取出肿瘤并进行分析。结果表明,与其他三种治疗方法相比,E7+RT治疗小鼠的肿瘤重量明显降低(图二)。3B)。CD 45的百分比+E7+RT组与RT+E7组(E7+RTvs RT+E7组:40.5%vs 16.4%)和单纯RT组(E7+RT组:40.5%vs 14.2%)相比,E7+RT组细胞数分别增加了2.47倍和2.85倍(P<0.05)。3B)。在重复这些实验时也发现了类似的结果(补充图)。3C)。令人惊讶的是,我们注意到CD 45+细胞数量在RT与RT之间没有差别,随后又接种了疫苗(见图)。3B和补充图。3C)。此外,CD 45的人口也有所增加。+MHC-1+E7+RT与RT+E7和RT单独治疗肿瘤细胞的比较(附图)。3A)和E7+RT也显著上调MHC-1。+CD 45表达细胞(附图)3B)。最有趣的是,CD 45的百分比+CD8+细胞(图1.3C)和效应因子CD8。+干扰素-γ+T细胞(图1.三维空间)E7+RT治疗的肿瘤比RT+E7或单纯RT治疗的肿瘤高出约4倍。然而,与单纯RT相比,RT+E7治疗并没有改变CD8的百分比。+细胞和CD8+干扰素-γ+肿瘤内CD 45 T细胞+细胞(图1.3C,d和补充图。3D,e).

图3:治疗性癌症疫苗,然后放射诱导更多的白细胞和CD8。+效应T细胞浸润肿瘤。

建立的TC-1肿瘤在放疗前后单独或联合疫苗进行治疗。术后14d取肿瘤。a实验程序。b肿瘤重量(左)和CD 45的百分比+流式细胞术检测肿瘤细胞(右)。cCD8%+CD 45细胞+肿瘤中的细胞dCD8%+干扰素-γ+CD 45细胞+流式细胞术分析肿瘤细胞。实验重复了三次和两次。t-试验用于生物复制物的比较。数据以平均值±SD表示;n=4只小鼠/组。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

为了进一步了解RT和疫苗的组合顺序是否影响抗肿瘤作用的质量,我们将两种联合治疗方法与相同接种次数和照射次数的免疫效果进行了不同顺序的比较。结果表明,在小鼠接受两次疫苗和一次照射后,E7+RT治疗对肿瘤的免疫应答明显强于RT+E7治疗,其特征是CD 45的百分比显著提高。+细胞,CD8+CD 45中的T细胞+细胞,CD8+干扰素-γ+细胞和CD8比值+T细胞至Tregs(附图)4)。这些结果表明,RT与疫苗的结合顺序具有明显的免疫介导的抗肿瘤作用。

目的:确定E7疫苗是否引起肿瘤抗原特异性CD8的增加。+干扰素-γ+我们测定了正常小鼠两次接种E7疫苗后淋巴细胞中E7特异性CTL的百分比。HPV 16 E749-57肽刺激淋巴细胞6 h,与未接种对照组相比,CD8水平明显升高。+T细胞和E7特异性CTL(补充图)。5).

肿瘤中的Tregs被认为是TME免疫抑制的主要诱因,广泛存在,并与预后不良有关。39。在本研究中,我们证明与未处理的对照组相比,辐射在TME中引起了更多的Tregs积累。2E)。一个问题是,与单纯放疗相比,联合治疗是否增加了TME中Tregs的数量。通过对CD4的分析+CD 25+Foxp 3+在肿瘤组织中,我们发现联合治疗(E7+RT和RT+E7)并没有改变Tregs的瘤内百分比。4A),说明E7+RT治疗可诱导CD8升高。+T细胞/Tregs在肿瘤中的作用有助于其较好的抗肿瘤作用。正如预期的那样,CD8的比率+E7+RT组T细胞/Tregs明显高于单纯RT+E7组和单纯RT组(P<0.01)。4B)。此外,与RT组和RT+E7组相比,CD8的比例更高。+T细胞,CD8+干扰素-γ+细胞(附图)6A-d),CD8的比率更高+淋巴结和脾淋巴细胞T细胞向Tregs转化(附图)。6E,f)E7+RT组。此外,在各处理中,E7+RT的CD8比值最高。+T细胞至CD 45肿瘤中的细胞(如图所示)。4C和补充图。3F)。免疫组织化学显像和统计数据也提供了可见的证据表明CD8的百分比。+E7+RT处理的肿瘤组织染色阳性细胞数(16.5%)明显高于其他三组(图1)。4D和补充图。7)。我们的结果支持提高肿瘤内CD8的比值。+T细胞/Tregs可能是免疫应答改善和肿瘤缩小的标志。

图4:联合应用E7疫苗治疗肿瘤前后CD8比值差异较大。+/Treg细胞。

在局部建立的肿瘤治疗之后,按照图所述的实验程序进行治疗。3A。于照射后第7、14天,取肿瘤标本进行流式细胞术、免疫荧光染色及RT-PCR分析。aTregs在CD4中的百分比+流式细胞术分析细胞。bCD8比值+流式细胞术分析肿瘤中的Tregs。cCD8比值+/CD 45流式细胞术分析肿瘤细胞。d每组3例,进行CD8免疫荧光染色。用抗CD8原抗体孵育4°C,然后与相应的次级抗体(红色)共同孵育,再用DAPI(蓝色)染色。每组10~12个视野进行图像分析(上)。图像软件(下)对图像进行合并。CD8%+用Imag-Pro Plus软件对阳性染色细胞进行分析。e, f从处理后的小鼠肿瘤中分离到完整的肿瘤RNA。实时PCR检测肿瘤放疗7d后CXCL 9、CCL 5、CXCL 10、CXCR 3的表达e)和14天(f)。数据以平均±SD表示;n=3~4只小鼠/组。实验重复了三次和两次。t-试验用于生物复制物的比较。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

由于以前的研究已经报道,免疫细胞的招募是由趋化因子水平介导的,我们随后在TC-1肿瘤模型中研究了RT和疫苗的序贯组合是否诱导了趋化因子。结果表明,E7+RT治疗的肿瘤组织中CCL 5、CXCL 9、CXCL 10及其受体CXCR 3的mRNA水平在第7天明显高于其他治疗组(图5)。4E)和第14天(如图所示)。4F)。综上所述,我们的结果表明,接种与rt的结合显着地诱导了CD8中系统地高γ的产生。+T细胞;肿瘤细胞和淋巴细胞表面MHC-1表达增强;TME产生趋化因子增加,从而吸引更多的效应分子CD8。+T细胞浸润肿瘤环境,从而形成良好的免疫微环境。

我们试图找出联合应用E7+RT而不是RT+E7导致更多的效应T细胞浸润到肿瘤中的原因。以前的研究表明,CD8产生的干扰素-γ。+T细胞可刺激上皮细胞表达CXCR 3配体CXCL 9和CXCL 10,进而导致CD8。+T细胞增殖和迁移40,41。我们检查了CD8+T细胞的迁移受趋化因子的控制;这些细胞是从正常小鼠淋巴结中分离出来的,无论接种与否。流式细胞仪检测显示CD8的迁移增强。+T细胞与照射后的tc-1肿瘤细胞上清或CD8共培养时的T细胞。+T细胞来自接种疫苗的小鼠。5A)。流式细胞仪检测CXCR 3和CCR 5在IFN-γ产生的CD8中的表达+T细胞在免疫前小鼠的淋巴细胞中明显增强(如图所示)。5B)。免疫小鼠T细胞与照射后的tc-1肿瘤细胞共培养时,cxcr 3细胞的数量明显减少。+CD8+T细胞与未照射的TC-1细胞共培养,或未接种T细胞与照射后的TC-1细胞共培养时,T细胞均高于未照射的TC-1细胞(图1)。5C)。为探讨免疫诱导的干扰素-γ是否能刺激肿瘤细胞产生某些趋化因子,并将这些趋化因子反过来激活T细胞中的CXCR 3信号传导通路。与未经照射的Tcl-1相比,经辐照处理的Tcl-1肿瘤细胞经IFN-γ诱导产生CCL 5和CXCL 10。然而,与IFN-γ处理的Tcl-1细胞相比,在照射后的Tcl-1细胞中加入免疫T细胞能显著增加CXCL 10的产生,但对CCL 5无明显影响(图5)。5D)。进一步调查是否招募CD8+用E7+RT诱导T细胞,分析照射肿瘤淋巴细胞的数量、表型和趋化因子的表达水平。采用三步fcs门控策略对CD8进行分类。+CXCR 3+干扰素-γ+和CD8+CCR 5+干扰素-γ+肿瘤组织悬液中的细胞(附图)。8)。如图所示。5E,f与其他处理相比,E7+RT处理诱导CD3增加。+CD8+T细胞招募,CXCR 3的百分比+干扰素-γ+细胞与CCR 5+干扰素-γ+CD8+T细胞中的细胞和趋化因子CCL 5和CXCL 9/10的表达水平。我们的结果表明,照射肿瘤产生的CCL 5和CXCL 10水平的升高可能会吸引接种的CD8。+高表达IFN-γ的T细胞+CXCR 3+进入肿瘤,导致CD8的比率增加+肿瘤环境中的T细胞/Tregs。CD8的不同调节机制+趋化因子CCL 5和CXCL 10对T细胞的免疫顺序和RT顺序如图所示。5G。除趋化因子外,白细胞和非白细胞MHCⅠ类表达的增强也可能在照射肿瘤环境中的免疫应答中起重要作用。

图5:疫苗和辐射诱导的趋化因子促进免疫激活的CD8+T细胞在体外迁移。

用于CD8的研究+T细胞迁移,照射(8Gy,X射线)照射tc-1细胞(5×10)。4细胞/mL),小鼠接种E7疫苗(10μg/鼠),接种7d后制成单个T细胞悬液。af流式细胞术分析。a流式细胞术计数T细胞在跨孔板下腔内迁移的数量。上清液(2×10)4从Tc-1细胞中收集到的细胞/mL或不受照射的细胞被填充在下腔和T细胞(1×10)中。6细胞/mL,200μL)加于上腔,37℃下孵育24h。b免疫7d后,从腹股沟淋巴结中分离T细胞。用E7种子和刺激细胞。49-57肽(5μg/mL)和添加BFA(1μg/mL)6 h。+干扰素-γ+细胞(上)和CCR 5+干扰素-γ+CD8细胞(较低)+流式细胞术分析T细胞。cTC-1细胞(2×10)4T细胞(1×10)与照射或不辐照处理的细胞/mL、1mL细胞共培养。6细胞/mL,200μL)小鼠接种与否,孵育24小时后,CD8的百分率+CXCR 3+流式细胞仪检测T细胞。dTC-1细胞(2×10)4T细胞(1×10)与照射或不辐照处理的细胞/mL、1mL细胞共培养。6免疫小鼠的细胞/mL,200μL),或加入100 ng/mL的干扰素-γ。+培养48h,取培养上清液进行CCL 5和CXCL 10趋化因子测定。e荷瘤小鼠(肿瘤体积约150 mm)3)接受RT治疗,接种疫苗(E7),RT接接种(RT+E7),再接种RT(E7+RT)14天。处死小鼠,解剖肿瘤进行进一步检测。CD3%+CD8+肿瘤T细胞(左),CCR 5+干扰素-γ+细胞(中间)和CXCR 3+干扰素-γ+CD8细胞(右)+流式细胞术分析T细胞。fCD8细胞增殖的调控机制+用趋化因子CCL 5和CXCL 10对T细胞进行不同的免疫接种和RT组合。gCD8的不同调节机制示意图+T细胞经趋化因子CCL 5和CXCL 9/10接种后,与RT呈反比关系。数据以平均±SD表示;n=5只小鼠/组。实验重复了三次和两次。t-试验用于生物复制物的比较。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

在RT之前接种疫苗是根除实体肿瘤的有效方法。

免疫治疗在同基因免疫活性小鼠体内根除实体瘤的可能性很小。42。我们还发现体积大于100毫米的实体肿瘤3单靠接种疫苗是不能治愈的33。E7+RT而不是RT+E7诱导CD8的高比率+T细胞/Tregs与肿瘤相关抗原特异性CD8的大量浸润+T细胞进入肿瘤环境(图6)。34)。因此,我们推测E7+RT会对大于100 mm的实体肿瘤产生持久的抗肿瘤作用。3(约150毫米)3)。为探讨不同序贯联合治疗对荷瘤小鼠的疗效,采用了两种治疗策略(图二)。6a,b)。与未治疗的肿瘤相比,仅用RT或E7疫苗治疗的肿瘤的生长时间较短,约为10天,然后开始生长(图1)。6C)。虽然RT+E7治疗明显延迟了肿瘤的生长,但与单纯RT相比,没有观察到强效的肿瘤消退和持久的治疗(图一)。6C)。与RT+E7治疗相比,E7+RT对44.4%的荷瘤小鼠有较强的肿瘤消退和持久治愈作用,所有长期存活者在再次攻击后均排斥肿瘤(图1)。6C,d)。E7+RT治疗还使TC-1荷瘤小鼠比其他三种治疗方法存活时间更长(图1)。6E)。E7+RT诱导的肿瘤排斥反应是否依赖于CD8+TME中的T细胞或Tregs,我们选择性地耗尽了Tregs或CD8。+T细胞分别用抗CD 25和抗CD8单克隆抗体。CD8耗竭+T细胞对E7+RT的疗效明显低于单纯RT。CD 25耗竭+T细胞对E7+RT的疗效无明显影响。6f,g)和改进的肿瘤退行性变,从40%到50%(如图所示)。六小时).

图6:疫苗注射顺序和肿瘤照射对产生持久的抗肿瘤作用至关重要。

a, b实验程序。a接种RT(E7+RT):荷瘤小鼠在肿瘤细胞注射后第1次接种E7疫苗(5μg/只),第14天照射肿瘤,再皮下注射3剂E7疫苗(Sc)。第4、11、18天。bRT接疫苗(RT + E7):肿瘤细胞注射后第14天用单剂量辐射照射肿瘤,然后用4剂E7疫苗Sc照射肿瘤。第3、10、17、24天。c单个肿瘤生长曲线和平均肿瘤体积随时间变化,未处理荷瘤小鼠为对照(CTR),每组9只。第14天从小鼠体内分离肿瘤,每组4~5只。d在接受不同治疗的无瘤小鼠中,只有E7+RT治疗显示有4只小鼠出现肿瘤排斥反应。e不同处理条件下TC-1荷瘤小鼠的生存曲线。f用抗体来消耗实验。用抗CD 25(10剂量,200μg/鼠)或抗CD8抗体(3剂量,200μg/鼠)治疗荷瘤小鼠,作为对照,详见图中所示的方法和原理图。2H. g小鼠存活率h无瘤小鼠经不同处理后,每组10只。结果为平均±SD。实验重复了两次和两次。t-生物复制的双向比较。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

RT前接种对三重阴性乳腺癌具有抗转移作用

三重阴性乳腺癌细胞有能力逃避免疫监视,并从其原点扩散到其他器官。为了探讨免疫后RT诱导的强效免疫是否能有效地预防乳腺癌的转移,我们采用具有高侵袭转移风险的4T1-Luc2肿瘤模型来模拟人类三重阴性乳腺癌。我们选择了4个Luc2表位(Luc2)。32,Luc2160,Luc2293,和Luc2446)并分析其刺激抗原特异性CTL的能力。AS Luc2160诱导CTL百分率最高(附图)。9该肽作为抗原制备了随后联合治疗的以胶束为基础的Luc2疫苗。我们检测了4T1-Luc2荷瘤小鼠的原发肿瘤体积、肺转移和存活情况。7A)。与未治疗相比,Luc2疫苗或RT能在较短的时间内延缓原发肿瘤的生长,而Luc2与RT的联合应用对肿瘤的生长有明显的抑制作用(图一)。7b)。此外,与RT或Luc2疫苗联合治疗相比,联合治疗对肺转移有很大的抑制作用(图1)。7D,e)。与其他治疗组相比,联合治疗组小鼠存活时间明显延长(图二)。7C)。这些结果表明,联合接种和放疗可以诱导一种强大的内源性免疫反应,以克服具有高转移潜能的晚期肿瘤。

图7:卢卡2疫苗联合RT治疗可有效预防4T1~Luc 2肿瘤的肺转移。

4T1-Luc 2细胞(5×10)4在BALB/c小鼠第四脂肪垫上接种细胞/小鼠。a实验过程:荷瘤小鼠在肿瘤细胞注射后第9天第一次接种LU-2疫苗(每只6μ),第12天照射肿瘤,再皮下注射3剂E7疫苗(sc.)第4、11、18天。b4T1-Luc2荷瘤小鼠肿瘤体积随时间的变化。c不同处理对4T1-Luc2荷瘤小鼠生存曲线的影响。结果为平均±SD,每组小鼠8-9只。d体内放疗后第23天4T1~Luc2乳腺癌肺转移的IVIS生物发光显像。e对小鼠肺转移的发生率进行了不同的治疗。实验重复了两次和两次。t-生物复制的双向比较。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

讨论

越来越多的临床肿瘤标本提出了一个问题,为什么癌症会在患者的炎症和免疫反应增加的情况下逐步增长。在本研究中,我们发现,随着小鼠肿瘤体积的增大,CD8的数量也随之增加。+肿瘤和脾脏T细胞减少,Tregs增多。这表明免疫抑制随着肿瘤的进展而增强。我们在小鼠模型上的观察与临床研究一致,临床研究表明病人的TILs在功能上有缺陷。43表明肿瘤诱导免疫抑制。

针对实体肿瘤的RT可诱导抗原的释放和活化T细胞的浸润。10。然而,越来越多的证据表明,rt使TME中的免疫功能从增强变为抑制,其中Tregs一直被认为是抑制抗肿瘤免疫的主要参与者。44,45,46。对124篇发表的文章的分析表明,CD8的比例很高。+CD45RO+黑色素瘤和乳腺癌中T细胞和较低比例的Tregs与患者的预后呈正相关。8。据报道,Tregs比其他淋巴细胞具有更强的抗辐射能力,从而使其优势增加。47。检查点抑制剂,如抗pd-l1和抗ctla 4抗体,被广泛用作辅助辐射,以恢复T细胞的活化,使T细胞能够控制癌症的进展。16,17。虽然这些联合治疗提高了受照射肿瘤的抗肿瘤免疫反应,但由于T细胞衰竭,通常会产生耐药性。与敏感肿瘤不同的是,CD8+T/Tregs比值在耐药肿瘤中降低。在这里,我们证明了CD8+T/Tregs比值随肿瘤的进展而降低,放疗后T/Tregs比值逐渐降低(附图)。12),表明CD8+T/Tregs比值在RT后调节肿瘤生长中起重要作用。

据报道,MDSCs通过抑制免疫反应来促进肿瘤的进展。8。MDSCs的数量可以被诱导48或减少49在放疗后肿瘤中,MDSCs可能在调节照射肿瘤中起着自相矛盾的作用。在我们的TC-1肿瘤模型中,MDSC的数量在辐射后变化不如Tregs。CD 25的耗竭+细胞对受照肿瘤的生长抑制作用较强,说明Tregs对辐射有负效应。然而,抗CD 25对消耗Tregs的作用,结合rt,不能诱导持久的治疗,说明有效的抗肿瘤免疫主要依赖于CD8。+效应T细胞

虽然癌症治疗疫苗在临床前的研究中显示出了希望,但其在癌症患者中的临床效果有限。50。疫苗无法消除癌细胞的一个可能原因是抗肿瘤T细胞难以进入肿瘤组织,特别是在实体肿瘤中。因此,在治疗已建立的肿瘤时,疫苗与其他疗法(如RT)的结合是必不可少的。在本研究中,我们证明了接种后RT对恶性TC-1和4T1-Luc2实体瘤都能诱导有效的抗肿瘤免疫。然而,由于大量的Tregs诱导,RT不能获得有益的抗肿瘤免疫,这可能导致相互增强的免疫抑制。因为疫苗提供了充足的CD8+T细胞,疫苗与rt的结合有望诱导出较高的CD8比值。+T细胞/Tregs在TME中。TME中效应细胞CD8细胞浸润增加,抑制性Treg细胞减少,对肿瘤免疫治疗有重要意义。

人类癌症是如此复杂,因此很难找到有效的疫苗。本研究表明,E7和Luc2抗原在高水平的肿瘤细胞中过表达,对肿瘤的消除和生存期的延长是有效的。提示如果抗原在某些癌组织(如乳腺癌HER 2和肺癌MUC 1)中过度表达,那么抗原表位就能有效地诱导人T细胞免疫原性。因此,筛选和探索人肿瘤细胞特异性抗原在疫苗临床翻译中具有重要意义。临床观察表明,某些癌症患者如果接受了rt治疗,就能从免疫治疗中获得更多的好处。51。以往的研究表明,放疗或化疗结合免疫治疗的时机对于消除已建立的肿瘤至关重要。52。在许多实体肿瘤中,由于TME中免疫抑制细胞的作用,免疫治疗的抗肿瘤作用通常是微弱的。疫苗加放射治疗协同抗肿瘤的研究越来越受到重视。27,28。因此,更好地了解免疫分子在治疗后的反应将有助于优化RT和疫苗的时间和顺序,以达到理想的治疗效果。在这里,我们发现,与RT后接种相比,疫苗接种后RT诱导了更高水平的趋化因子和CD8。+/Tregs在肿瘤中的比例。我们的研究与有关辐射通过增加趋化因子水平来促进免疫细胞吸收的报道是一致的。53。这表明疫苗接种后RT增加了趋化因子的产生,有利于CD8的吸收。+T细胞进入照射肿瘤。疫苗增强CCR 5的表达+干扰素-γ+和CXCR 3+干扰素-γ+论CD8+T细胞,导致照射后肿瘤细胞CCL 5和CXCL 9/10分泌显著增加。反过来,照射后的肿瘤细胞显著促进CCR 5的迁移。+CD8+和CXCR 3+CD8+T细胞至TME(图1)。5).

当CD8+T细胞耗竭,免疫后RT的协同抗肿瘤作用完全消除(图1)。6),表示CD8的主导功能。+联合治疗中的效应T细胞。在RT之前注射疫苗时,大量的CD8+效应T细胞抵消辐射引起的Tregs升高,从而导致CD8的高比率+/Tregs在肿瘤中的作用和明显增强的抗肿瘤作用。相反,当rt在疫苗接种前被注射时,大量的辐射诱导的Tregs抵消了疫苗诱导的CD8的功能。+效应T细胞,导致CD8的低比率+/肿瘤中的Tregs。本研究通过诱导强免疫反应,阐明序贯免疫联合RT治疗肿瘤的优势的原因。

详细了解联合治疗后TME中肿瘤与免疫细胞的关系,对于优化癌症患者的治疗方案至关重要。在本研究中,我们证明了CD8+预先制备的效应T细胞是对抗辐射诱导的Tregs的重要组成部分,对于肿瘤的稳健消退和持久的治疗是必不可少的。我们将演示如何操纵TILs,特别是CD8的比率。+T细胞/Tregs在TME中,通过简单的改变RT和疫苗的顺序。这些治疗方案适用于临床翻译,并可能治愈许多被认为是棘手和无法切除的肿瘤。


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