您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!2008-2020
本企业通过iso9001质量体系认证

Dll1+静止的肿瘤干细胞通过NF-κB生存途径驱动乳腺癌的化疗耐药

 二维码
发表时间:2021-01-22 10:14作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

乳腺癌患者化疗耐药性的发展大大提高了死亡率。因此,了解乳腺癌化疗耐药的机制对于克服这一临床挑战至关重要。虽然活化的Notch受体与肿瘤的耐药有关,但特异性Notch配体及其导致乳腺癌耐药的分子机制尚不清楚。利用条件基因敲除和报告小鼠模型,我们证明表达Notch配体Dll 1的肿瘤细胞对肿瘤的生长和转移具有重要作用,并且与乳腺癌中的肿瘤起始细胞(Tics)有相似之处。Rna-seq和ATAC-seq使用报告模型和患者数据证明NF-κB激活在Dll 1下游,并与一种耐化学耐药表型有关。最后,药物阻断Dll 1或NF-κB通路完全致敏Dll 1。+肿瘤到化疗,突出了化疗耐药乳腺癌患者近期的治疗途径。

导言

乳腺癌是女性癌症相关死亡的主要原因之一。1...尽管最近在该领域取得了进展,但包括治疗耐药性、复发和转移在内的临床挑战仍然存在。2。乳腺癌分为三种主要亚型,即腔内型(表达雌激素受体(ER)与孕酮受体(PR)和HER 2基因共表达),HER 2-不含ER和PR,三阴性乳腺癌(Tnbc)不表达这些受体。3,4。到目前为止,这种肿瘤间异质性已无法确定“普遍”的乳腺癌治疗学。此外,已知的乳腺癌肿瘤内异质性被认为是直接导致化疗耐药的因素,因为一小部分称为肿瘤起始细胞(Tics)/肿瘤干细胞(Cscs)的肿瘤细胞通常具有平静、转移和化疗耐药的能力。5,6,7,8,9,10,11即使在化疗后也能促进肿瘤的复发和转移12,13.

抽动蛋白存在于包括乳腺肿瘤在内的几个实体肿瘤中。14,Notch信号通路在促进乳腺癌组织/csc功能中起着重要作用。15,16,17,18,19。Notch通路由4个Notch受体(Notch 1-4)和5个配体(Jagged 1、Jagged 2、Delta-like 1(Dll1)、Dll 3和Dll 4)组成。而Notch信号在乳腺癌中表达异常,广泛的研究支持Notch受体在乳腺癌中的作用。20,21,22,23特异性Notch配体在促进TIC功能和耐药中的作用尚不清楚。虽然全球Notch信号抑制剂通过靶向抽搐来抑制肿瘤的生长,但其副作用限制了其治疗效果。值得注意的是,我们最近的研究突出了Notch配体dll 1在腔内乳腺癌中的促肿瘤作用。24。由于以配体为基础的治疗可能比全局Notch信号抑制剂提供更好的安全性,确定Dll1在TIC产生/功能和Notch介导的化疗耐药性中的作用,可能有助于确定乳腺癌患者的有效和耐受性更好的治疗药物。

在本研究中,我们发现Dll 1在多瘤中T(MMTV-PyMT)乳腺肿瘤模型中对肿瘤的发生和转移是必不可少的。利用报告模型,我们进一步证明了Dll1在肿瘤中的表达随肿瘤从早期到晚期(包括转移)的时间增加。机械地,我们显示在腔内肿瘤中,dll 1+细胞代表静息物,表现出富含低氧和NF-κB信号基因的耐化疗基因标记,并具有抗化疗能力。最值得注意的是,药物阻断Dll 1或NF-κB通路使肿瘤细胞对化疗敏感,并在肿瘤的发生和进展研究中显著消除肿瘤的生长和转移。总的来说,这些数据表明静止的Dll 1+抽动素是乳腺肿瘤进展和转移的重要调节因子,与化疗耐药有关。因此,针对Dll 1联合化疗和NF-κB可能是乳腺癌耐药患者的一种很有前途的治疗策略。

结果

在mmtv-pymt模型中,dll 1有致癌作用,而mmtv-wnt 1模型则不显示dll 1有致癌作用。

为了研究Dll 1在本地乳腺肿瘤中的作用,我们杂交了Dll1有条件的淘汰(Dll1CKO)K14-Cre重组酶能有效地敲除乳腺上皮细胞中的Dll 1的小鼠25,26到mmtv-pymt以生成pymt-dll1。CKO动物(图1.1A)。Mmtv-pymt模型代表了一种高转移潜能的腔状乳腺癌模型。27,28从而允许对疾病从早期到晚期的进展进行分析。Pymt-dll 1肿瘤细胞中dll 1的表达明显下调。CKO老鼠(图1.1B)。此外,我们发现dll 1的丢失导致pymt-dll 1细胞增生的急剧减少。CKO与PyMT-Dll1相比威汤哥8周时的乳腺。1C),表明Dll 1的丢失会影响肿瘤发生的早期事件,可能是通过影响肿瘤发生的人群而发生的。在控制PyMT-Dll1威汤哥小鼠乳腺肿瘤最早发生于11周龄,肿瘤外显率几乎为100%。相比之下,PyMT-Dll1中的肿瘤CKO小鼠在12周龄时有75%的延迟外显率(图1)。1D)。此外,PyMT-Dll1威汤哥小鼠的肿瘤负担明显增加(图一)。1E)和肺转移。1F,g)与PyMT-Dll1相比CKO老鼠。

图1:在MMTV-PyMT模型中,Dll 1的条件基因敲除显着地延缓了肿瘤的发生和肺转移。

a原理图显示了生成mmtv-pymt;dll 1的策略。CKO老鼠。bWesternblot显示PyMT-Dll1中有Dll 1蛋白的还原。CKO肿瘤细胞与PyMT-Dll1的比较威汤哥肿瘤细胞。cn威汤哥, n=6 PyMT-Dll1CKO8周龄乳腺增生。dKaplan-Meier图显示的MMTV-PyMT女性乳腺肿瘤发病动力学。PyMT-Dll1威汤哥 (n=22只老鼠)和PyMT-Dll1CKO (n小鼠32只)。e散点图显示了PyMT-Dll1中自发肿瘤的数目。威汤哥 (n=22只老鼠)和PyMT-Dll1CKO (n=32只老鼠)。当肿瘤直径为3×3mm时,乳腺被认为是肿瘤阳性。f典型的全身图像显示肺转移结节(黑色箭头)在Pymt-dll1。威汤哥,这在Pymt-Dll1中是缺失的。CKO老鼠。肺结节用Bouin氏液固定24h后在解剖显微镜下定量(详见方法部分)。g散点图显示了携带PyMT-Dll1的自发性肿瘤的肺结节数目。威汤哥和PyMT-Dll1CKO老鼠(n=每组7只)。双尾对数秩检验d和双尾未配对学生T-试验E,g计算p价值。数据显示b或三c或七f独立实验。e, g数据为平均值±扫描电镜。标尺,500米c400米f。源数据作为源数据文件提供。

为了确定dll 1的功能是否特定于腔腺癌mmtv-pymt模型,我们跨越了Dll1CKO小鼠至mmtv-wnt 1小鼠,代表一种基础/混合肿瘤模型。29,以生成wnt1-dll1。CKO小鼠(附图)1A)。与PyMT模型不同的是,两者的乳腺Wnt1-Dll1CKOWnt1-Dll1威汤哥小鼠表现出类似的增生性生长(附图)。1B)。此外,肿瘤的发病无显着性差异(P>0.05)。Wnt1-Dll1CKO相比较Wnt1-Dll1威汤哥老鼠(p=0.4)(附图。1C),提示Dll 1在腔内腺癌中具有特定的致瘤功能。

Dll1的急剧增加+PyMT肿瘤进展过程中的肿瘤细胞

Dll 1缺失对PyMT肿瘤形成的巨大影响促使我们研究Dll 1在肿瘤发生过程中的时空分布。为此,我们生成了PyMT-Dll1樱桃报告鼠25,30并对Dll 1的表达模式进行了评价。+PyMT-Dll1期细胞樱桃肿瘤从正常乳腺发展到晚期肿瘤。我们观察到Dll 1的数量大幅增加。+细胞作为乳腺向前推进,通过增生阶段,肿瘤(图)。2A,b),支持PYMT肿瘤中的致癌功能Dll1。Dll1在MCherry阳性和阴性人群中的mRNA水平显示Dll 1在报告小鼠中的忠实表达(图1)。2C)。Dll 1的现状分析+25(无花果)二维空间)。然而,Dll 1的数量相对增加。+流明(K8)+)细胞与Dll 1相比+基底肿瘤细胞(K14)+和K5+随着肿瘤从增生期进展到晚期肿瘤(如图所示)。2D,e和补充图。2A,b).

图2:Dll1的数目+在PyMT肿瘤发生过程中,管腔细胞增多。

a,bLIN的流式细胞仪分析-肿瘤细胞Dll 1增加+PyMT-Dll1中的细胞(mCherry表达)妇幼保健正常至肿瘤分期之间的肿瘤,b. b n=8正常乳腺,n=12个乳腺增生,n=7例早期肿瘤n=13例晚期肿瘤。cQPCR分析表明Dll1樱桃中mRNA的表达+对樱桃-肿瘤细胞增生和肿瘤分期(n=7乳腺增生n=9例肿瘤。我们酶解了PyMT-Dll1妇幼保健正常乳腺增生乳腺和肿瘤分类阴性(CD 45)-CD 31-特119-)Dll 1+或Dll 1基于mCherry表达的细胞量化Dll1MRNA水平Dll1(妇幼保健))折叠考虑1来计算dll 1。+(妇幼保健)+)折叠变化。dePYMT-Dll1正常乳腺、增生和肿瘤的代表免疫荧光(IF)图像妇幼保健小鼠在肿瘤发生过程中表现出Dll 1的细胞分布。用mCherry抗体检测dll 1MCH+细胞。d白色箭头表示基础标记K14和Dll 1的阳性细胞。e白色箭头表示Dll1和K8(n=每组3例)。请在补充图11中看到更多有代表性的图像。b, c P数值的计算采用单向方差分析和Tukey的多重比较,后特别检验(b)与邦菲罗尼的后测调整数进行双向方差分析。c。IF染色是在三个独立的实验中进行的,使用的是6个独立实验中的肿瘤。d, e. b, c数据为平均值±扫描电镜。标尺,40米(d, e)。源数据作为源数据文件提供。

进一步研究Dll 1的分布+在肿瘤发生过程中,我们采用PyMT-Dll1-GFP小鼠模型。我们穿过Dll 1GFP-IRES-CRE-ERT 2Knockin小鼠(Dll1)绿色荧光蛋白)31用mmtv-pymt小鼠生成pymt-dll1绿色荧光蛋白老鼠。GFP表达忠实地再现了Dll1的表达(补充图)。2C),类似于PyMT-Dll1樱桃模型,Dll1的数目+细胞(GFP)+)在PyMT-Dll1中绿色荧光蛋白小鼠明显增强,Dll 1+随着肿瘤的进展,细胞获得了腔内标记物(K8)的表达(补充图)。二维f和补充图。3A,b)。这些研究用多个报告模型确定了Dll 1在PyMT肿瘤发展的不同阶段的细胞和时间分布。

转移性肺结节与原发肿瘤相比Dll 1表达增加。

Mmtv-pymt小鼠模型发生高频率肺转移28。为了确定dll 1的表达是否与转移有关,我们在Pymt-dll1中评估了dll 1的表达。妇幼保健和PyMT-Dll1绿色荧光蛋白肺转移结节并与原发肿瘤比较。我们发现在两种报告模型中,Dll1在转移性结节中的表达水平都高于原发肿瘤(补充图)。4A-f)。总的来说,我们的研究来自于Dll1的条件敲除(图1)。1报告小鼠提示Dll 1可能是乳腺癌转移的一个重要决定因素。

Dll1+肿瘤细胞显示TIC特征

转移增加通常与肿瘤起始细胞(Tics)/肿瘤干细胞(Cscs)在癌症中的存在有关。32,33,34。以确定Dll1是否+细胞在乳腺肿瘤中表现为TIC表型,我们进行了体外肿瘤球试验,以评估Dll 1的致瘤潜能。+和Dll 1从PyMT-Dll1中分离出的肿瘤细胞妇幼保健肿瘤。排序单PyMT-Dll1+与Pymt-dll1相比,肿瘤细胞形成的肿瘤球数显著增加。肿瘤细胞,提示Pymt-Dll1+细胞在抽搐中富集(如图所示)。3A)。为了直接检测dll 1的抑瘤功能,我们将Pymt-dll 1进行了移植。+或PyMT-Dll1肿瘤细胞进入同基因C57BL/6小鼠乳腺脂肪垫(MFP)。我们发现移植的Dll 1+肿瘤细胞在Dll1之前启动肿瘤生长肿瘤细胞,表明Dll 1+细胞显示抽搐的特征(图。3B)。在限制稀释法中,Dll1+与Dll 1相比,肿瘤细胞具有更强的启动异种移植物生长的能力(1/2791)。肿瘤细胞(1/27,341)3C)。有趣的是,曾经肿瘤开始生长,它们的生长速度比Dll 1还快。+肿瘤,表明Dll 1具有较高的增殖潜能肿瘤细胞3D,e)。因为抽搐有缓慢的增殖表型35,我们在体内使用了edu标记。36来评估肿瘤细胞的增殖。值得注意的是,我们发现+细胞EDU阴性,表明与dll 1相比,细胞增殖减少。细胞(图1.3F),进一步支持Dll 1的TIC类特征。+细胞。我们的研究共同确定了dll 1。+细胞在乳腺癌中具有降低增殖潜能的潜能。

图3:Dll1+与Dll 1相比,细胞是一种静止的物质,具有很高的转移性。肿瘤细胞。

a条形图描述了单个排序Dll 1中的肿瘤球总数。+和Dll 1肿瘤细胞。单细胞在低贴壁板上培养7天。80(n=每组6口井)。B-fDll1+(樱桃+)和Dll 1(樱桃)从Pymt-Dll1中分离出的肿瘤细胞。妇幼保健将自发性肿瘤注射到C57BL/6小鼠乳腺脂肪垫(MFP)内。对侧乳腺(第4位)用于MFP注射,n列于表中。bKm-图描述了Pymt-dll1的抑瘤能力。+和PyMT-Dll1肿瘤细胞。当肿瘤尺寸大于1×1mm时,考虑肿瘤的发生。c该表显示了Pymt-dll1的肿瘤形成潜力。+和PyMT-Dll1C57BL/6小鼠移植瘤细胞。d, e具有代表性的生长曲线和图像c显示Dll 1肿瘤生长速度快于Dll 1+肿瘤细胞(n=5 Dll1n=8 Dll1+肿瘤)。f具有代表性的如果图像说明Dll 1+细胞(MCherry)不与EDU共定位+PYMT-Dll1正常乳腺、增生和肿瘤中的增殖细胞(绿色)妇幼保健老鼠。用mCherry抗体检测dll 1MCH+细胞。带Bonferroni后测调整的双向方差分析a, d、双尾对数秩检验b卡方检验c计算P价值。f如果是用肿瘤做了两次n=3个独立实验的3个样本/组。a, d数据为平均值±扫描电镜。标尺,40米(f)。源数据作为源数据文件提供。

Dll 1介导的Notch信号激活乳腺肿瘤NF-κB通路

以更好地理解Dll 1之间的分子特征+和Dll 1乳腺癌中的肿瘤细胞,我们用dll 1进行了rna-seq分析。+和Dll 1PYMT-Dll1两种肿瘤细胞妇幼保健和PyMT-Dll1绿色荧光蛋白肿瘤(附图)5A)。如所料,与干细胞、侵袭细胞和静止细胞相关的信号在dll 1中富集。+肿瘤细胞4A,b和补充图。5B,c),支持我们的实验数据+细胞具有类似干细胞的特性,增加了它们的侵袭性。NF-κB和缺氧信号通过调节包括乳腺癌在内的几种癌症的细胞增殖和存活而与化疗耐药密切相关。37,38,39,40。其次,我们发现NF-κB活化、缺氧和dll 1富集的Notch通路。+肿瘤细胞4C和补充图。5D,e),这可能是导致耐药的原因之一。最后,我们还发现dll 1丰富了转移特征的增加。+肿瘤细胞4D),支持我们体内转移的数据(补充图)。4A-f)。正如预期的那样,RNA-seq数据显示,在本实验装置中DLL 1的表达水平约为7.5倍.考虑严格切断Dll 1>5.5倍变化基因的表达+诉Dll1肿瘤细胞,我们鉴定了一组在dll 1中强表达的10个基因。+细胞与Dll 1的比较细胞(附图)5F)。值得注意的是,这10个基因中有8个与肺和骨转移有关。41,42,43,44,45,46,47,48表明它们可以代表潜在的生物标志物。

图4:rna-seq和atac-seq显示了dll 1。+肿瘤细胞对NF-κB通路有丰富的信号。

ae我们孤立了林Dll1+和Dll 1来自PyMT-Dll1的肿瘤细胞绿色荧光蛋白(绿色)或Pymt-Dll1妇幼保健(红色)肿瘤并进行RNA-seq分析。基因富集分析(GSEA)显示乳腺干细胞增多a,增加的侵袭力b,NF-κB信号增强c转移增加dDll 1中的签名+肿瘤细胞与Dll 1的比较肿瘤细胞。e具有近端ATAC-seq峰的基因在p < 0.05 in Dll1+细胞在GFP/mCherry up中富集(Dll 1)+)组合RNA-seq排序表。fATAC-seq分析的火山图描绘了Dll 1中几个原癌基因和前转移基因的富集峰。+肿瘤细胞与Dll 1的比较细胞。g NF-Kb1Dll1在Dll 1中显示了几个开放的染色质富集峰。+肿瘤细胞与Dll 1的比较肿瘤细胞。hi具有代表性的IHC图像显示出更高的核NF-kB。+Dll1肿瘤细胞+与Dll 1比较肿瘤。对这些人群进行细胞分选,然后注射乳脂垫。散点图中的点表示FOV,这是从n=每组3例肿瘤。视场是视场。黑色箭头显示肿瘤细胞NF-κB的核染色。jGFP的GSEA分析+肿瘤细胞Dll 1富集+小鼠肿瘤基因对DLL 1基因的影响腔A和B型患者(前100位基因)。k, l谷胱甘肽分析显示NF-κB标记在DLL 1中。A、B腔与DLL 1的比较低层A、B两组患者。m相关图描绘了NF-κB1和DLL 1在A、B腔标本中的表达。jmDLL 1和DLL 1低层n=1140例肿瘤。PyMT-Dll1妇幼保健Rna-seq和atct-seq均采用模型,pymt-dll1则采用。绿色荧光蛋白只用于rna-seq(n=2 Dll1+n=2 Dll1PyMT-Dll1肿瘤细胞妇幼保健肿瘤为RNA-seq;n=2 Dll1+n=2 Dll1PyMT-Dll1肿瘤细胞绿色荧光蛋白使用rna-seq的肿瘤;n=4 Dll1n=3 Dll1+从PyMT-Dll1中分离出的肿瘤细胞妇幼保健肿瘤为ATAC-seq)。双尾未配对学生t-测试(i)和Pearson相关系数m计算P价值。i数据为平均值±扫描电镜。标尺,60μmh。源数据作为源数据文件提供。

为了进一步探讨dll 1介导的肿瘤细胞转移和存活的机制基础,我们用atac-seq技术检测了dll 1中染色质的可及性和限制性区域。+和Dll 1肿瘤细胞(附图)5A)。在全球范围内,atac-seq数据并不表明dll 1之间染色质可访问性模式在表观基因组范围内发生了任何戏剧性的变化。+和Dll 1细胞。这一结论是基于在两个dll 1中找到类似的UTR、外显子、基因间、内含子和启动子的数目。+和Dll 1肿瘤细胞(附图)5G)。鉴于这些细胞具有相同的谱系,而且Dll 1本身并不是一种染色质修饰蛋白,这一发现是意料之中的。接下来,我们对ATAC-seq和RNA-seq数据进行了综合分析.在综合分析中,我们采用了“atac-seq up”的特征(在dll 1中,所有具有近端atac-seq峰值的基因在p调整后均显著增加,<0.0 5)。+在GFP/MCherry UP(Dll 1)中进行富集测试+)组合RNA-seq排序表。我们发现,这个ATAC-seq特征在rna-seq数据中得到了很强的丰富(nes=2.24,p < 0.001) (Fig. 4E)。然后,我们重点分析了23个GSEA“核心富集”基因(如图所示)。4E),它们都在ATAC-seq up签名中,并且在dll 1中被转录地上调。+使用EnrichR在线软件的单元。我们的数据显示,在这23种常见的上调/增加Dll 1基因的可及性基因中,+细胞,Notch信号和NF-kB信号(例如rela)都有明显的富集(补充图)。5H),提示Dll 1介导的Notch信号可能调控NF-Kb1活性和信号转导。

Atac-seq数据还证实了dll 1的rna-seq数据中发现的几个前转移基因的富集峰的存在。+细胞(火山图,图)。4F)。Dll1+肿瘤细胞也有NF-Kb1与Dll 1相比,特异的开放染色质区/富集峰细胞(图1.4G)。这些数据表明,dll 1激活了dll 1中的nf-kb1信号。+肿瘤细胞,可能有助于促进肿瘤的存活和相关的化学抗药性。IHC分析进一步证实了这一观点,其中Dll 1+与dll 1相比,肿瘤中NF-kB的核易位更大。肿瘤提示NF-kB信号的激活(图)。4H,i).

为了探讨小鼠数据的临床相关性,我们检查了dll 1。+小鼠签名与METABRIC患者数据库的相关性分析DLL 1NF-kBA、B腔乳癌患者49,50。值得注意的是,我们发现dll 1的基因患者肿瘤表现为强烈富集至dll 1。+PYMT签名绿色荧光蛋白肿瘤或PyMT妇幼保健(前100位上调基因)4J和补充图。6A),突出了小鼠模型与患者的相似之处。同时,当病人被分层的基础上DLL 1表达式DLL 1患者的肿瘤NF-kB类似于小鼠的rna-seq数据的特征(图)。4K,l和补充图。6B,c)。此外,来自A、B腔的肿瘤之间有很强的正相关关系。DLL 1NF-kB(r=0.185,p < 0.001, Fig. 4m)。最后,我们发现NF-kB基序基因在DLL 1+患者肿瘤(腔A和B)相比较DLL 1病人(附图)6d)使用GSEA C3简编。这些观察表明,Dll 1介导的Notch信号通过调节NF-Kb1而诱导NF-kB信号的激活,而NF-Kb1可能参与肿瘤细胞的存活。

Dll1+化疗耐药

人们认为抽搐对各种癌症的化疗产生抗药性。51,52。因此,我们接下来评估了阿霉素的敏感性,阿霉素是一种蒽环类化疗药物,可有效治疗包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤。53,54。功能测试Dll 1+PYMT-Dll1细胞对阿霉素耐药妇幼保健记者模型,我们整理了Dll 1+和Dll 1-肿瘤细胞用阿霉素体外处理。我们发现Dll 1+与Dll 1相比,细胞对阿霉素诱导的细胞死亡具有耐药性。细胞(附图)7a,b)。类似于我们的体外研究,移植Dll 1的处理+和Dll 1阿霉素肿瘤显示Dll 1+肿瘤是耐药的,而Dll 1阿霉素治疗后肿瘤生长明显受损。5A-d)。特别是,阿霉素治疗可显著增加静止/缓慢生长的Dll 1的数量。+肿瘤中的抽搐(图1.5E和补充图。7C),可能是由于它们逃避细胞死亡和/或DNA损伤。事实上,对移植性肿瘤的进一步分析显示Dll1+与dll 1相比,肿瘤更容易发生细胞死亡。从肿瘤细胞中的裂解caspase-3和TUNEL染色(凋亡细胞)可以看出肿瘤(如图所示)。5F-h)。细胞周期分析进一步显示dll 1亚G1期细胞(凋亡细胞)明显增加。细胞与Dll 1比较+肿瘤细胞(附图)8a,b)。最后,γh2ax染色(绿色染色表示dna损伤)显示阿霉素诱导的dll 1的dna损伤减少。+肿瘤细胞与Dll 1的比较肿瘤(附图)8C-e),有可能解释Dll 1的化疗耐药性。+肿瘤(如图所示)。5B-d).

图5:Dll1+肿瘤细胞在PyMT肿瘤中具有耐化学性。

a原理图显示了用Pymt-dll1进行体内阿霉素敏感性测定的实验方案。+和PyMT-Dll1肿瘤。b,c肿瘤生长曲线显示Pymt-Dll1。+ b和PyMT-Dll1 c肿瘤生长用生理盐水(Ctrl)或阿霉素治疗。d具有代表性的肿瘤图像b, c. bd n=6例肿瘤/组。e代表IF图像显示Dll1(红色)和EDU的表达+PyMT-Dll1中的增殖细胞(Green)+用生理盐水或阿霉素治疗肿瘤。用mCherry抗体检测dll 1MCH+细胞。白色箭头表示Dll 1增殖。+埃杜+阿霉素治疗肿瘤细胞。f流式细胞仪检测pymt-dll 1中活性裂解caspase-3阳性细胞的百分率。+和PyMT-Dll1用生理盐水(Ctrl)或阿霉素治疗肿瘤。g, h代表IF图像显示Dll 1(红色)和TUNEL的表达+PyMT-Dll1中的凋亡细胞(Green)+ g和PyMT-Dll1 h用生理盐水或阿霉素治疗肿瘤。福尔马林固定肿瘤标本用mCherry抗体染色检测dll 1。+肿瘤细胞。P数值计算采用双因素方差分析和Bonferroni后测调整。b, c单因素方差分析与Tukey的多项比较f。如果实验被重复了两次n=3个肿瘤/组e有一次n=4个肿瘤/组g, h。数据为平均值±扫描电镜。标尺,60米e, g, h。源数据作为源数据文件提供。

Dll1致敏剂Dll1的药理抑制作用+肿瘤细胞化疗

接下来,我们研究了体内靶向Dll 1是否会影响dll 1的耐药表型。++荷瘤小鼠分别给予对照剂或抗dll 1-阻断抗体(αdll 1)。55或阿霉素(Dox),或两者的组合(补充图)。9A)。在这个肿瘤的起始和进展研究中,Dll1抗体对肿瘤的生长有一定的抑制作用,而联合治疗则显著降低了肿瘤的生长(图一)。6a,b),暗示Dll 1-阻断敏化Dll 1+抽搐化疗。此外,与对照组相比,抗Dll 1抗体和化疗组小鼠的转移事件显著减少(图1所示)。6C-E和补充图。9B)。这种肿瘤生长和进展的减少与NF-kB核易位的减少有关(图一)。6f,g),提示Dll 1介导的化疗耐药可能是由NF-kB信号介导的。

图6:dll 1阻断抗体治疗使dll 1敏感。+肿瘤细胞到化疗。

a,b肿瘤生长曲线ab)在Dll1之后+肿瘤细胞来源的肿瘤用指示疗法治疗(详情见附图)。9A) (n=4对于ctrl,αdll1ab和αdll1ab+dox,n=6例Dox肿瘤。黑色箭头表示治疗开始的日期。ce有代表性的荧光图像显示mCherry+全肺结节的定量研究c, d。散点图dMCherry阳性肺结节,采集后在荧光解剖显微镜下定量(数据结合两个独立实验,n=5 Ctrl,n=5αDll1ab,n=6 Dox,和n=5αDll1ab+Dox肿瘤)。e具有代表性的肺横断面图像显示有mCherry+细胞(红色)用mCherry抗体检测dll 1MCH+细胞。f, g典型的IHC图像显示Dll 1的NF-κB染色。+肿瘤在体内的治疗,这是量化的g。散点图中的点表示FOV,这是从n=每组3例肿瘤。视场是视场。黑色箭头显示肿瘤细胞NF-κB的核染色。P数值计算采用双因素方差分析和Bonferroni后测调整。a或单因素方差分析与图基后测d, g。数据显示三C,e或两次f独立实验。数据为平均值±扫描电镜。标尺,200米c,20米e60米f。源数据作为源数据文件提供。

当这些小鼠的体重未发生改变时,Dll 1在单药或联合阿霉素中均无明显的副作用(补充图)。10A)。Dll1抗体的活性通过对依赖于Dll1活性的脾脏边缘B细胞耗竭的检测得到进一步证实(附图)。10b,c)56,57,58。综上所述,这些结果勾勒出Dll1靶向治疗化疗失败的患者可能是有效的,并且在治疗期间可能有更好的安全性。

NF-kB和Dll 1对耐化学性Dll1的药理抑制作用+肿瘤腔内细胞Dll 1阻断抗体的作用

由于NF-kB被发现是Dll 1介导的Notch信号的下游,我们接下来要研究的是NF-kB抑制剂IMD-0354(IMD-0354)是否会使肿瘤细胞对化疗过敏,从而影响Dll 1阻断抗体的作用。IMD是一种选择性IKK 2抑制剂,干扰NF-κB信号传导,在包括癌症在内的多种临床前模型中显示活性。59,60,61,62。Dll 1体外肿瘤球测定法+联合应用IMD和阿霉素后,肿瘤细胞的数量和大小明显减少,与Dll 1阻断抗体和阿霉素的作用相似(图1)。7A-c)。特别是联合应用Dll 1抗体、IMD和化疗进一步减少了肿瘤球的数量和大小。7A-cIMD或单纯化疗对肿瘤细胞的影响最小。为了补充体外数据,我们治疗了dll 1。+肿瘤细胞用阿霉素,Dll 1-阻断抗体,IMD-0354单独或联合治疗(附图)。10d)。与体外结果相似,NF-kB与αDll1ab或阿霉素共同抑制肿瘤生长,无明显毒性。7D,e和补充图。10E)。此外,联合治疗Dll 1、NF-kB和阿霉素可显著抑制Dll 1的肿瘤生长。+肿瘤细胞。因此,我们的结果表明,在肿瘤细胞中激活Dll 1信号下游的NF-kB可促进化疗耐药,同时阻断所有这些成分可导致肿瘤的显著反应。

图7:NF-κB敏化剂Dll1的抑制作用+肿瘤细胞到化疗。

a有代表性的荧光图像显示Dll 1的肿瘤球。+肿瘤细胞与指示的治疗。(IMD 100 NM,阿霉素80 NM,Dll 1抗体500μg/ml)。联合治疗:IMD 50 nm,阿霉素40 NM。b, c方框图显示了肿瘤球的数量。b直径(c)。方框表示值的75%、50%和25%。顶部和底线分别表示在×1.5 IQ(季度间)范围内的最大和最小数据点。dDll1来源肿瘤的生长曲线+肿瘤细胞的指示治疗(更多细节见补充图。10d)。黑色箭头表示治疗开始的日期。有代表性的整体肿瘤图像显示在e。图中两组实验均采用单独阿霉素组。7A-b和8d,e(n=6 Dox,n=4αDll1ab+Dox,n=4αDll1ab+IMD,n=6αDll1ab+Dox+IMD肿瘤)。f,模型表明Pymt-dll1+抽动素对阿霉素具有抗药性,NF-κB核易位增加,可以通过抗体阻断Dll 1、用NF-κB抑制剂和阿霉素阻断Dll 1而致敏。联合治疗在临床前小鼠模型中几乎完全有效。P数值采用单因素方差分析和Tukey后特别检验(b,c)和双向方差与Bonferroni的后测调整数(d)。数据显示两个(ac)独立实验。数据为平均值±扫描电镜。标尺,100米(a)。源数据作为源数据文件提供。

讨论

Notch信号特别是Notch受体在包括乳腺癌在内的几种癌症中与化疗耐药相关,其中以tnbc最为明显。63,64,65,66,67,68提示靶向这一途径可改善临床疗效。我们的研究揭示了Notch配体Dll 1在侵袭性腔内乳腺肿瘤中促进肿瘤进展、转移和化疗耐药的中心作用。识别一种以配体为基础的阻断肿瘤特异性Notch信号的治疗方法可能为乳腺癌患者提供一种安全有效的治疗方案。

我们小组早期的研究表明Notch配体dll 1对正常乳腺干细胞的发育是重要的。25。我们进一步表明,与TNBC/基底癌相比,Dll 1在腔内乳腺癌中优先上调,并调节这些乳腺癌细胞的csc功能。24。然而,当时我们无法评估Dll 1在肿瘤进展和转移过程中的时空分布。此外,我们无法确定Dll 1+由于缺乏合适的小鼠模型,细胞本身具有TIC/CSC特性。在本研究中,我们使用dll 1条件敲除和报告模型与自发小鼠模型(mmtv-pymt和mmtv-wnt 1)来确定dll 1的时空分布,并确定dll 1的功能。+肿瘤细胞在肿瘤进展中的作用。我们发现Dll 1+从正常乳腺到增生和肿瘤,细胞数量急剧增加,提示Dll 1具有支持肿瘤的功能。我们发现Dll 1+K8肿瘤细胞增多+在MMTV-PyMT模型中,随着肿瘤从增生到肿瘤分期,腔室与基底细胞相比较。未来从小鼠早期开始的血统追踪研究,将有助于破解K8基因增加背后的机制。+Dll1+肿瘤中的腔细胞。利用Dll 1的条件基因敲除小鼠,进一步证明Dll 1在MMTV-PyMT肿瘤中具有明显的促肿瘤作用,而在MMTV-Wnt 1肿瘤中则无明显的促肿瘤作用。Dll 1可能在其他基础肿瘤中具有促肿瘤作用,有待进一步探讨。我们进一步证明了Dll 1+肿瘤细胞是静止的,Dll 1介导的Notch信号是MMTV-PyMT模型中肿瘤进展和转移的主要驱动因素之一。这些数据符合转移性乳腺癌项目数据库(BlandInstitute),该数据库强调了Dll 1在转移性乳腺癌患者中的放大作用。

肿瘤异质性是目前乳腺癌治疗的一个临床难题。11,69,70,71。以确定Dll 1是否+肿瘤细胞类似于抽搐,它可以增加肿瘤负担、转移和化疗耐药性,这是dll 1的转录特征。+和Dll 1用RNA-seq分析进一步评价肿瘤细胞。这些数据表明Dll 1+肿瘤细胞与GSEA的侵袭性和转移性增强有关,证实了实验数据。Rna-seq数据显示Notch靶基因在dll 1中被激活。+肿瘤细胞与Dll 1的比较肿瘤细胞。然而,我们需要进一步的评估来理解dll 1之间的Notch信号。+细胞和Notch受体表达细胞。此外,Dll 1+肿瘤细胞富集干细胞基因,正如预期的那样,dll 1+细胞周期基因表达降低,而Dll 1基因表达下降。细胞高度富集,突出了dll 1的相对静止特性。+EDU法证实的肿瘤细胞。以前的研究表明CD 44/CD 24罗氏上皮细胞保留了乳腺癌典型的TIC特征,包括体内的肿瘤起始能力,肿瘤的形成,以及对标准化疗的抗药性。13。我们发现Dll 1+肿瘤细胞对化疗药物阿霉素耐药。机械上,我们证明了Dll 1+γH2AX染色、TUNEL和细胞周期分析表明,肿瘤细胞通过避免药物诱导的细胞死亡和dna损伤来抵抗化疗。有趣的是,Dll 1+细胞还富集了NF-κB信号和缺氧的信号,肿瘤进展和化疗耐药的共同特征。72,73,74,75。这一观察在使用METABRIC数据集的人类患者数据中得到进一步证实,在该数据集中,我们发现DLL 1NF-κB1。此外,Dll 1我们的小鼠模型中的基因标记(前100个基因)与DLL 1的基因非常相似。腔A、B两组患者支持我们的模型对人类患者的临床意义。事实上,NF-κB通路可与Notch信号通路串音,促进肺癌的耐药。76...此外,缺氧与多种癌症,如肺癌、前列腺癌和乳腺癌等多种药物,包括阿霉素的耐药有关。39,77,78,79。Atac-seq证实了rna-seq数据,并为NF-κB1基因和其他原癌基因和前转移基因,表明Dll 1介导的Notch信号可能通过调控这些通路来抵抗化疗。此外,在表达较高水平Dll 1的肿瘤细胞中,NF-κB的核易位增加。用IMD抑制剂联合阿霉素阻断NF-kB活性,可显著降低肿瘤细胞活力和肿瘤范围内干细胞的活性,从而影响Dll 1-阻断抗体的作用。联合治疗阻断NF-kB活化,Dll 1和化疗在体内肿瘤生长几乎完全应答。

我们的数据表明,Dll 1介导的Notch信号驱动转移和耐药,因此可能导致乳腺癌的高死亡率(图一)。7F)。机械地说,我们的数据表明Dll1通过NF-κB通路增强了对DNA损伤和细胞死亡的抵抗力。值得注意的是,针对Dll 1配体和NF-κB通路的联合治疗显示出对Dll 1中阿霉素的完全反应。+肿瘤细胞。总之,我们的研究结果表明,对于患有晚期疾病和转移的乳腺癌患者,尤其是那些化学耐药的患者,有一个很有前途的治疗目标。进一步的临床前研究将评估这一策略在诊所中的潜在效果。


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297