抗菌苹果醋根除耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗性大肠杆菌

甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)和抗药性大肠杆菌(R)E.coli)感染可以迅速传播。此外，它们还与治疗失败引起的高发病率和死亡率有关。治疗涉及多轮无效抗生素和不必要的副作用，替代治疗是至关重要的。苹果醋(ACV)是一种天然的纯素产品，已被证明具有很强的抗菌活性，因此我们研究了ACV是否能改善这些耐药细菌。抑制生长所需的ACV最低稀释度与两种细菌相当(ACV液和ACV片在200μg/ml时的1/25稀释对r有效。大肠杆菌和MRSA)。与mrsa或mrsa相比，与细菌共培养的单核细胞吞噬率分别提高了21.2%和33.5%。再来一次。大肠杆菌分别刺激单核细胞。微生物蛋白提取物的无标记定量蛋白质组学研究表明，ACV能穿透微生物细胞膜和细胞器，改变关键蛋白的表达。这导致总蛋白表达显著减少，而且我们只能检测到核糖体蛋白50s 30s、烯醇化酶、丙酮酸磷烯醇和ATP合成酶亚基。再来一次。大肠杆菌。ACV处理后MRSA中仅有伸长因子iNOS和磷酸甘油酸激酶OS。

微生物感染目前在世界范围内构成了难以想象的重大健康威胁。事实上，全球正处于一场致命的(冠状病毒)新冠肺炎大流行之中，没有治愈的办法。感染如HIV、SARS-CoV 2、E-桃、MRSA及大肠杆菌已被证明在人类中迅速传播，导致并发症，包括脓毒症伴细胞因子风暴，可导致多器官衰竭和死亡。1。此外，抗菌药物耐药性和病毒突变是一个巨大的关切，导致对治疗选择的进一步限制-世界卫生组织(世卫组织)2017年关于抗菌药物耐药性的全球报告指出，对通常用于治疗严重医院感染的上一代药物的耐药率很高。它还强调了头孢菌素耐药和氟喹诺酮耐药的全因死亡率增加了两倍。大肠杆菌2.

人类、动物养殖场不适当地使用抗生素、卫生条件差以及卫生保健方面缺乏对感染的控制，导致抗生素抗药性细菌的出现。多药耐药和广谱β内酰胺酶的产生大肠杆菌会导致危及生命的感染。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别构成胃肠道和皮肤中兼性菌群的一部分。3。长期接触抗生素后产生抗生素耐药性。病征大肠杆菌感染包括血泻、恶心、呕吐、脱水、腹部抽筋，并可能导致脓毒性休克或死亡。4。MRSA感染仍然是全世界主要的公共卫生问题，尤其是在医院和医疗机构。MRSA对免疫功能低下的患者、癌症患者、老年人甚至在常规的医院手术中都是致命的。它迅速蔓延，造成严重并发症。MRSA可产生大量毒素，包括超抗原，可导致中毒休克综合征和葡萄球菌猩红热。MRSA感染的症状通常包括多个皮肤肿胀、皮疹、头痛、发冷、发烧、疲劳、咳嗽、呼吸困难和胸痛。并发症可能导致坏疽、疼痛的脓肿和血液、心脏、肺或泌尿道系统的感染。5,6,7。虽然不再开甲氧西林，但MRSA往往对青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类抗生素产生耐药性，并可对喹诺酮类、氨基糖苷类和大滑翔类药物产生耐药性。8。20世纪60年代在英国和丹麦发生了第一次mrsa流行，导致了第一批mrsa分离物的出现。9.

ACV是由苹果、糖和酵母混合而成的酒精发酵过程。这些成分包括5%的醋酸，醋酶的母体，以及钾、镁和钙。10,11。其中一种是乙酸，具有很强的抗菌性能，并已被证明能抑制由以下物质组成的生物膜的浮游生物生长。鲍曼和铜绿假单胞菌烧伤12。它还能抑制酵母细胞的生长，导致线粒体和核糖体降解，导致细胞凋亡。13。我们曾证明acv对非耐药有很强的抗菌作用。大肠杆菌, 白色念珠菌和金黄色葡萄球菌14。因此，本研究的目的是研究ACV对耐药微生物的抗菌活性。

ACV抗耐药活性的研究大肠杆菌和MRSA

直接培养耐药株ACV的抗微生物活性测定大肠杆菌或不同浓度ACV的MRSA。

图形1显示MRSA和再来一次。大肠杆菌在不同浓度的ACV处理后，分别用1：2，1：10，1：25 v/v的布拉格液体ACV或200和400 g溶于水中的ACV片与微生物共同培养。图形2用光镜观察单核细胞与有无ACV(1：25稀释)的细菌共培养的图像，台盼蓝染色。值得注意的是，随着ACV的加入和微生物的暴露，有更多的单核细胞存活。此外，在培养6h后，即使添加干净的ACV，对单核细胞存活率超过90%的细胞也没有毒性。限制MRSA和MRSA生长所需的最低剂量再来一次。大肠杆菌1：25稀释布拉格的ACV(0.5%醋酸)。我们还比较了不同剂量的商用ACV口服片对微生物的影响。我们测试了浓度在50-400微克/mL范围内，在两倍稀释剂的ACV片对每种微生物。ACV片对MRSA和MRSA的最低抑菌浓度为200μg/mL。再来一次。大肠杆菌分别(表)1)。所有稀释液均用无菌水进行。我们使用BraggsACV进行所有未来的实验，在每个有机体所需的最低抑制浓度下。

增强吞噬能力

单核细胞主要通过吞噬细胞吞噬微生物，因此我们测试了ACV对此过程的影响。

事实上，MRSA和MRSA后，单核细胞吞噬能力分别增加了21.2%和33.5%。再来一次。大肠杆菌分别与ACV(1：25浓度)共培养，并与静止的未刺激单核细胞进行比较。其结果与常用抗生素类似，如克林霉素或甲氧苄啶。结果表示为三个相似实验的平均值和SD(表)。2).

蛋白质组学结果再来一次。大肠杆菌以及接触ACV后的MRSA。直接比较无标记、定量、自下而上的无菌培养和无ACV培养的微生物蛋白质组学研究。我们能够鉴定出这两种微生物蛋白质组的200多个蛋白质(补充表)。1)。在ACV治疗中再来一次。大肠杆菌培养物中缺乏关键酶以及DNA复制、糖酵解和呼吸蛋白。我们只能检测到少数蛋白质，如ATP合成酶亚基、烯醇化酶、丙酮酸磷烯醇和核糖体蛋白30s，50s(表)。3)。MRSA培养对ACV治疗非常敏感。ACV治疗后缺失的关键酶包括磷酸甘油和伴侣蛋白伸长因子蛋白，而对照组的mrsa蛋白总数为200。3).

数百万年的进化使细菌得以生存，利用复杂的耐药机制来避免被抗菌药物杀死。ACV越来越受欢迎，成为众多商业保健饮料的基础，并被认为是治愈许多疾病的良药。15.

我们先前的体外研究强调了acv对非耐药的抗炎和抗菌作用。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌14。我们现在延长ACV对MRSA和MRSA的抗菌活性。再来一次。大肠杆菌。ACV对细菌生长的抑制作用与临床上典型的抗生素甲氧苄啶和克林霉素的抑制作用相当。大肠杆菌和MRSA感染16,17。ACV处理抗性的蛋白质组学分析大肠杆菌揭示了关键核糖体蛋白(30s，50s)的存在。有趣的是，红霉素和其他大环内酯类抗生素也可以针对与伸长结构多肽有关的核糖体结构。18。也许这表明核糖体的稳健性。大肠杆菌亚单位。细胞内ATP合成酶的存在再来一次。大肠杆菌经过acv治疗后，由于atp合成酶广泛存在于细菌的能量传递膜中，因此具有重要的意义。19。ACV可能已经破坏了暴露在发现这种蛋白质的细胞膜上的细菌。ACV处理后还检测细菌烯醇化酶和丙酮酸磷烯醇。这两种蛋白质在细菌生长和繁殖中起着关键作用。20,21。在ACV处理的MRSA上，我们只能根据MRSA基因组中广泛的分类蛋白来鉴定两种蛋白质。其中之一是细菌延伸因子，它是MRSA耐药的关键翻译蛋白，也是新抗菌药物的研究热点。22。加入ACV后MRSA中缺乏磷酸甘油酸激酶，提示ACV可破坏糖酵解MRSA通路。23。在一例阴道念珠菌中，acv的抗微生物能力已得到临床验证。24。近年来，ACV已被证明具有上调对虾体内关键天然免疫防御基因的能力，并能促进其在体内的生长。它也被证明支持肠道虾的微生物群。25,26。对糖尿病患者口服ACV的研究发现，ACV能提高过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的活性。27。这可能是其抗菌特性的一个重要因素。耐药细菌会引起并发症，特别是在肠道。28。事实上，人们已经发现，抗药性的丧失会导致万古霉素抗药性的增加。大肠杆菌易患血友病29。因此，任何能够放大先天免疫系统的化合物都可能是这些可怕的抗药性生物体的强大解药。ACV的另一个成分是乙酸，其活性高(1.8%)，低浓度(0.3%)。12。在我们的研究中，活性的最低理想浓度是1：50稀释，其中含有0.1%的乙酸。因此乙酸可能不是ACV中唯一的抗菌活性成分。低pH也能有效地破坏微生物。ACV的pH值为5.6，而醋酸的pH值为4.7。我们研究了不同浓度的强有机酸(如盐酸和硫酸)对不同微生物的影响(结果未显示)，但未见与ACV相同的抗菌效果。ACV对人体血液参数的影响很小。我们首次证明ACV对培养的人单核细胞没有任何影响，即使在高浓度直接接触ACV 24小时后也是如此；证实ACV对白细胞没有损伤。这是一个非常重要的观察，因为几个世纪以来，ACV一直作为食物补充使用，许多人每天服用它，因此任何副作用都很重要。ACV对微生物有毒性作用，但在我们的实验中并不影响人单核细胞的完整性。要注意的是，ACV应该被稀释在少量的水或果汁中，因为它会烧掉喉咙，否则，没有已知的毒性或副作用的报告，因为它的消费。Oussay等人的一项研究。2020年观察了葡萄糖和ACV对体重2mL/kg连续5周喂养大鼠的影响。单独饲喂葡萄糖的大鼠血浆尿素水平升高，而ACV处理大鼠血浆尿素水平无明显变化。这表明ACV不影响肾功能，事实上，当与葡萄糖联合喂养时，ACV纠正了尿素水平。29.

我们认为acv对抗性有很强的抗菌作用。大肠杆菌和MRSA。其作用方式似乎涉及微生物致病生理的改变。这些体外结果突出了ACV的抗菌能力。因此，本研究促使临床进一步研究ACV对耐药细菌感染患者的治疗效果。ACV可以构成现代抗MRSA和抗MRSA的药物抗菌药物的核心成分。再来一次。大肠杆菌.

化学试剂、微生物、培养基和培养条件

微生物耐药株大肠杆菌抗头孢吡肟和头孢吡肟-恩美他唑巴坦联合耐药菌株(Nctc 13353)是从LGC Promochem获得的。MRSA菌株(ATCC 33591，NCTC 8325耐甲氧西林)是从英国Colindale公共卫生公司购买的。U 937细胞株CRL-1593.2是从美国型培养公司购买的。

试剂

从蛋白质组学级猪胰腺、甲酸、乙腈、HPLC级水、甲醇和Whatman Mini-UniPrep无注射器(孔径0.45m)购买了Dulbecco改良的iscoves培养基、二甲基-乙基-磺酰基氧化物、Hanks平衡盐溶液、非晶闸管、磷酸缓冲液、多聚甲醛、丙酮、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、胰蛋白酶等蛋白质组学级的蛋白质组学级、甲酸、乙腈、HPLC级水、甲醇和Whatman Mini-UniPrep无注射器过滤装置(孔径0.45m)。TNF-α，酶联免疫吸附试验(ELISA)是从研究与发展系统(Abingdon，U.K.)购买的。Mueller Hinton琼脂是从英国Oxid购买的。布拉格的苹果醋和苹果醋药片(500毫克)是从英国Colchester的Troo保健公司购买的。

根据Yagnik等人先前发表的方法，制备了ACV的接种物，并对其抗微生物活性进行了测定。14

抗性培养大肠杆菌MRSA在营养培养基中培养。所有培养物均在37°C摇床中培养24小时后使用。将38g蒸馏水溶于1 L蒸馏水中，煮沸1 min，冷却蒸压后倒入塔板中，制得Mueller Hinton琼脂(MHA)。所有微生物培养物均调整为0.5McFarland标准1.5×10。8CFU/ml和4×106实验采用每种生物的CFU/ml。将每种微生物均匀地擦至含有MHA的平板上。加入100升不同浓度的ACV，注入琼脂中。在37°C下孵育24 h，确定样品周围的抑制区，以mm为单位进行拍照和测量。实验至少重复了五次。

伦理认可

所有的实验协议都是由英国米德尔塞克斯大学自然科学伦理委员会批准的，编号为2323。此外，这些方法是根据有关准则和条例进行的。

Yagnik等人曾发表过类似的文献。14

人单核细胞株U 937是从美国型培养收集(ATCC)获得的单核细胞的来源。细胞培养密度为4×105/毫升再来一次。大肠杆菌、MRSA或不同浓度的ACV计数为4×106在37°C和5%CO条件下，CFU/ml分别作用24h。2然后，收集上清液，用ELISA试剂盒对其分泌肿瘤坏死因子-α的情况进行分析。

流式细胞术测定单核细胞吞噬能力

U 937细胞在4×10条件下培养5每毫升在24个井板内，两天后与微生物(4×10)一起孵育6(CFU/ml)37°C和5%CO作用4h。2。然后在含有1mm EDTA的冰冷PBS中刮除细胞，并将其从平板上清洗和移除。所得微丸被固定在4%多聚甲醛的400升中，并使用FACS杯式流式细胞仪进行分析(贝克顿·狄金森免疫细胞计量学系统，英国和细胞探索软件2019年)。

用于质谱分析的样品准备，类似于Yagnik等人先前发表的。14

MRSA和再来一次。大肠杆菌用1/25稀释液孵育或不加ACV孵育24h，37次。∘C在900 rpm离心后，取上清液分离出细菌颗粒。至少使用了12个样本重复。将细菌细胞颗粒再悬浮在冷丙酮(600μL)中，以14,800 rpm离心5 min沉淀蛋白质。去除上清液，加入50 mm碳酸铵(4 0 0μL)溶解提取的蛋白质。蛋白质浓度的测定采用纳米滴式装置(ThermoFisher UK)。

在56°C下用10 mm二硫苏糖醇(DTT)还原15 min，室温下用100 mm碘乙酰胺进行烷基化反应30 min。每个样品在37℃下用胰蛋白酶消化一夜。

以Yagnik等人先前发表的方法为基础的微生物质谱分析方法。14

LC-MS/MS数据采集基于Yagnik等人先前发表的类似方法。14

用Dionex终极3000 RSLC纳米超高效液相色谱系统对胰蛋白酶进行了分析。用5mm×300μm(1d)稀释和浓缩胰蛋白酶的ALI‘(15μL)。C_(18)捕集柱和溶剂由水和乙腈(98：2%，v/v)以20μL/min的流速，含0.05%TFA(负载溶剂A)和乙腈和水(80：20%，v/v)(负载溶剂B)组成的溶剂组成。用水和乙腈(95：5，v/v)的混合物(95：5，v/v)，0.1%甲酸(洗脱剂A)和乙腈和水(80：20%，v/v)(洗脱剂B)组成的二元梯度洗脱剖面，流速为6μL/min。梯度为0 min~0%B、4 min~5%B、5 min~8%B、40 min~40%B、41 min~80%B。QExactives是以依赖于数据的模式操作的。Ms调查扫描是从M/z350到2000，分辨率为70,000，AGC为3e6，最大IT为100 ms。对10个最丰富的离子进行MS/MS测量，分辨率为17,500，AGC为1e5，最大IT为200 ms。14.

根据Yagnik等人以前发表的类似方法进行数据处理和分析。14

LC-MS/MS数据使用Proteome Discoverer v2.1(英国热费舍尔科学公司)进行处理，数据库搜索来自UniProt_SwissProt_2019_02下载的FASTA文件。在前体耐受量为10 ppm，片段质量耐受度为0.02 Da的情况下，将搜索参数设置为将MS/MS谱与完全特异性胰蛋白酶裂解产生的肽相匹配。卡波米甲基(CAM：+57.021 Da)作为对半胱氨酸的静态修饰，蛋氨酸氧化(Metox：+15.995 Da)为可变修饰。结果最初在软件中可视化，然后导出到Excel进行进一步审查。14.

统计分析

所有实验结果均表示为平均±标准差(SD)。采用单因素方差分析或学生t检验进行统计学分析，结果P<0.05(所有实验将苹果醋处理的微生物与未处理组进行比较)。所有实验至少重复3-5次。使用Excel软件版本2019年进行了分析。