NTM患者的临床特点 31例mbc感染患者和22例mbc感染患者的临床特征见表。 1 。感染mbc和mbs的患者的平均年龄分别为59岁和55岁；大约四分之三的患者是女性，从未吸烟。最常见的基础条件是支气管扩张，其次是以前的肺结核和慢性阻塞性肺疾病在MABC和MMass组。没有一名患者检测出人体免疫缺陷病毒呈阳性。所有患者均有呼吸道症状，如咳嗽、痰或咯血。在胸部CT上，93%的MABC感染患者和86%的M肿块感染患者呈结节状细支气管扩张(补充图)。 1 )。MABC感染组的红细胞沉降率为33 mm/h，M块感染组的红细胞沉降率为31 mm/h。痰抗酸杆菌涂片阳性率分别为48%和36%。两组患者的特征无显着性差异。
NTM患者和HCS患者的免疫转录组分析 我们对mbc感染者的PBMC进行了人免疫基因表达的检测( n =11)，被感染的病人( n =7)，以及HCS( n =6)(图6。 1A ，补充表 2 )。所有受试者均为女性，年龄相近( p =0.31(Kruskal-Wallis检验)。MABC感染者的平均年龄为61.1岁，MMS患者的平均年龄为59.4岁，HCS的平均年龄为55.2岁。
图1：免疫转录组分析显示NTM患者和HCS患者PBMC间促炎细胞因子/趋化因子的表达差异。 a 本研究中免疫转录组分析的原理图。 b 主成分分析结果显示所有测试样本(HC)的前两个主成分(PC1和PC2) n =6；MABC， n =11；MMass， n =7)。 c 火山图代表了579个免疫相关基因，对数2倍的变化与负的log 10相对应。 p -与HC组相比，MABC组和MMass组的值。与HC组相比，红点和蓝点显示上调和下调基因。 d 前5条KEGG通路的结果富集了109种常见的MABC和M-质量群。 e 作为细胞因子-细胞因子相互作用途径(Hsa04060)组分的28个DEGS的热图。用红色标记的9个基因表明，它们在MABC或MMass组或TNF信号通路的成员中被上调了10倍以上。阿 伊-7 蓝色标记的基因表示MABC和MMass组中最受抑制的基因。利用Z分数的欧氏距离矩阵对基因进行层次聚类.健康对照 脓肿 Subsp. 脓肿 麦斯 脓肿 Subsp. 地块 .
为了评估23个数据集之间的转录组相似性，我们进行了PCA。HCS被很好的分离和聚集，另外两种类型的患者混合在PCA中，表明mbc感染和mbs感染的患者在转录组范围内的基因表达谱几乎没有或没有显著的差异，但这些图谱与hcs的转录组明显不同(见图)。 1B )。接下来，我们用这两种方法分别鉴定了mbc和mms中143和151个差异表达基因(Degs)与hc的差异表达基因(Degs)。 t -测试和折叠变化(FC)分析(FDR<0.05和FC>2)(图2)。 1C )。在109个常见的dgs中，28个degs主要参与细胞因子-细胞因子受体的相互作用，这是最显著的富集途径(fdr<2.06×10)。 −16 )使用KEGG(京都基因和基因组百科全书)。 1D 在NTM感染的患者中，几乎四分之三(28例中有21例)基因被上调。值得注意的是，9个基因[C-C基序趋化因子配体(CCL)2， CCL 7，CCL 20，CCL 22，CCL 24 ，C-X-C基序趋化因子配体(CXCL)2， CCL 24，IL1B，TNF ，和 伊-6 ]在NTM感染条件下，与免疫反应和炎症有关的持续升高(超过10倍)。 1E )。此外, 伊-7 ，是T-助手1反应的关键细胞因子。 23 ,24 ,25 ,26 ，是最下调的基因，在两种类型的患者中减少了6倍。
HCS患者PBMC中促炎细胞因子/趋化因子的表达 为了验证细胞因子/趋化因子的表达增加，我们对来自扩增群体的PBMC(MABC)进行了qRT-PCR， n =31；MMass， n =22；HC， n =39)。MRNA水平 IL-1β , 伊-6 , CXCL 2 ，和 CCL 2 与HCS患者相比，MABC感染和M群感染患者PBMC明显增加(见图)。 2A，c-e )。这个 肿瘤坏死因子 与HCS组相比，MABC感染组和M组PBMC中mRNA水平均无明显升高(图1)。 2B )。细胞因子/趋化因子水平无显着性差异( IL-1β , 肿瘤坏死因子 , 伊-6 , CXCL 2 ，和 CCL 2 )MABC感染患者与M块感染患者之间。有趣的是， CCL 5 与HCS患者相比，M群感染患者PBMC的mRNA水平明显降低(见图)。 2F )。此外， CCL 7 , CCL 20 ，和 CCL 24 ，但不是 CCL 22 ，与HCS(补充图)相比，MABC或M质量感染患者明显增加。 2 ).
图2：NTM患者与HCS患者PBMCs细胞因子/趋化因子谱的qRTPCR分析。 a –f 细胞因子/趋化因子基因在NTM患者和HCS中的差异表达。人PBMC是从HCS中分离出来的。 n =39)和NTM患者(MABC， n =31；MMass， n 用实时定量PCR法检测细胞因子/趋化因子mRNA的表达。 a IL1B ; b 肿瘤坏死因子 ; c IL6 ; d CXCL 2 ; e CCL 2 ; f CCL 5 ). g –i HCS细胞因子/趋化因子变量之间的相关矩阵( g )，MABC感染者( h )，以及被感染的患者( i )。在本研究中，6个细胞因子/趋化因子变量组合的相关矩阵显示了相关系数。NS，没什么意义。曼-惠特尼U测试。数据为三次或四次独立实验的综合结果(平均±扫描电镜)。健康对照 脓肿 Subsp. 脓肿 麦斯 脓肿 Subsp. 地块 .
然后，我们调查了不同细胞因子/趋化因子之间的相互关系(图一)。 2G-I )。在HCS中，两者之间存在显著的正相关关系。 IL-1β , 伊-6 , CXCL 2 ，和 CCL 2 ，而两者之间存在着负相关。 肿瘤坏死因子 和 CCL 5 (无花果) 2G )。在mbc感染的患者中，两者之间存在很强的正相关关系。 伊-6 和 CXCL 2 (n =31， r =0.543， p =0.002)， CXCL 2 和 IL-1β (n =31， r =0.723， p < 0.001), CXCL 2 和 CCL 2 (n =31， r =0.736， p < 0.001), and IL-1β 和 伊-6 (n =31， r =0.670， p < 0.001). However, the 肿瘤坏死因子 水平与 IL-1β , 伊-6 , CXCL 2 ，和 CCL 2 但不是 CCL 5 (正相关； n =31， r =0.446， p =0.012)(图1。 2H )。在多发性硬化症患者中，两者之间有很强的相关性。 伊-6 和 IL-1β (n =22， r =0.554， p =0.007)， 伊-6 和 CXCL 2 (n =22， r =0.570， p =0.006)，以及 CXCL 2 和 CCL 2 (n =22， r =0.733， p < 0.001). Similar to the findings observed in the Mabc-infected patients, the 肿瘤坏死因子 水平与 CCL 5 在弥漫性感染的病人中( n =22， r =0.560， p =0.007)(图1。 2I )。这些数据表明 肿瘤坏死因子 与其他促炎细胞因子/趋化因子在患者。
我们进一步研究了细胞因子/趋化因子水平与各种临床参数的关系。每种细胞因子/趋化因子与某些临床参数呈极强的正/负相关性(附图)。 3 )。值得注意的是，在感染mms的病人中， CCL 5 血清白蛋白水平与血清白蛋白水平呈显著正相关( n =22， r =0.450， p =0.036) CXCL 2 与血清白蛋白水平呈负相关( n =22， r =0.418， p =0.053)。这些结果提示，MABC感染和M群感染患者的外周免疫细胞有明显的上调的促炎症细胞因子/趋化因子，这可能与特定临床参数的调节有关。
这个 和平号-144-3p 患者外周血单个核细胞水平升高 为了探讨促炎症细胞因子/趋化因子在患者中表达改变的机制，我们对PBMCs进行了人miRNA表达检测，并对23例正常人标本进行了miRNA表达水平的检测(图一)。 3A ，补充表 3 )。与HCS相比，我们分别检测到25例(14例上调和11例下调)和10例(8例上调和2例下调)差异表达的miRNAs(FDR<0.05和折叠变化>2)。 3B )。其中9例(7例上调，2例下调)miRNAs表达模式相同(图1)。 3C，d )。接下来，为了验证这些差异表达的miRNAs是否能够调节促炎症反应基因，我们利用TargetScan数据库筛选出了潜在的miRNA靶基因，并对预测的靶基因进行了显着地富集(FDR<5%)。我们在目标基因中发现了11，9和23条重要的黑豹路径。 和平号-144-3p , 米-1-3p ，和 和平号-132-3p 分别(补充表) 4 )。共有5条途径(促性腺激素释放激素受体通路；P 06664，血管生成；P 00005，FGF信号通路；P 00021，EGF受体信号通路；P 00018和CCKR信号通路；P 06959)，与免疫反应相关的三条途径(干扰素-γ信号通路；P 00035，T细胞活化；P 00053，和白细胞介素信号通路；P 00036)。 3E ).
图3： 和平号-144-3p 经miRNA转录组鉴定，NTM患者PBMCs表达上调。 a MiRNA转录组分析的原理图。 b 用对数2倍变化(Fc)表示798个人类mirna基因的火山图。 p -与HC组比较，MABC组和MMass组的值。与HCS相比，红点和蓝点表明miRNA基因被上调和下调。 c Venn图显示，两组患者均有9例miRNAs改变。 d 与HC组相比，MABC和M质量群的9种常见miRNAs的Log2倍变化。 e TargetScan7.1预测的miRNA靶基因的豹途径富集试验结果。 f 点画图 和平号-144-3p ，NTM患者与HCS患者之间存在差异表达。人PBMC是从HCS中分离出来的。 n =39)和NTM患者(MABC， n =31；MMass， n =22)。实时定量PCR分析 和平号-144-3p 表情。 g 人PBMC是从HCS中分离出来的。 n =17)和NTM患者(MABC， n =14；MMass， n =14)，以及 和平号-1255 a 或 和平号-5001-3p 用qRT-PCR法测定.NS，无显着性；HC，健康对照；MABC，患者感染MABC；曼-惠特尼U测试。值表示三个独立实验的平均值(±SEM)，一式三份。 f , g )。健康对照 脓肿 Subsp. 脓肿 麦斯 脓肿 Subsp. 地块 .
我们选择了三种miRNAs，它们在患者和hcs之间的表达差异最大，并证实 和平号-144-3p MABC感染和M群感染患者的水平明显高于HCS患者(见图)。 3F ; p < 0.001). The levels of the other two miRNAs (HSA-miR-1255 a 和 Hsa-miR-5001-3p )无显着性差异(图二)。 第三代 )。我们还检查了病情的严重程度和抗生素治疗的开始是否影响 和平号-144-3p 。当根据BACES评分来划分严重程度时27 (补充图。 4A )和相应的表达式级别 和平号-144-3p 两组比较，无显着性差异(附图)。 4B ; p =0.905)。水平 和平号-144-3p 也没有显示出任何明显的差异取决于抗生素治疗是否开始(补充图)。 4C ; p =0.215)。总之，这些数据表明 和平号-144-3p 是来自MABC或M群感染患者PBMCs的特征性miRNA。
和平号-144-3p 过表达促进人巨噬细胞中促炎细胞因子/趋化因子的表达 Hsa-mir-144-3p 据报道在特应性皮炎中起着促炎作用。 28 。因此，我们评估了 和平号-144-3p 水平和炎性细胞因子/趋化因子。这个 和平号-144-3p 水平与健康水平呈显著正相关。 IL-1β (n =92， r =0.448， p < 0.0001), 伊-6 (n =92， r =0.615， p < 0.0001), CXCL 2 (n =92， r =0.506， p < 0.0001), and CCL 2 (n =92， r =0.35， p =0.0006)(图1。 4A ).
图4：过度表达 和平号-144-3p 上调炎性细胞因子/趋化因子在人MDMs中的表达。 a 90%密度椭圆的散点图显示 和平号-144-3p 密谋 IL1B , IL6 , CXCL 2 ，和 CCL 2 所有科目(HC， n =39；MABC， n =31；MMass， n =22)。Spearman秩相关决定了系数( r )和意义。 b 人原发性MDM转染模拟阴性对照(对照组)或 和平号-144-3p 模拟(10 NM)24小时，然后感染或不感染MABC或MMass(MOI=2，每个；3h)。实时定量PCR分析 IL1B , IL6 , 肿瘤坏死因子 ，和 CXCL 2 表情。* p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001. Spearman correlation (a )；单向方差分析( b )。值表示三次独立实验的平均值(±sd)。 b )。健康对照 脓肿 Subsp. 脓肿 麦斯 脓肿 Subsp. 地块 .
接下来，我们用一个 和平号-144-3p 模拟和检测 IL-1β , 伊-6 , 肿瘤坏死因子 ，和 CXCL 2 。过度表达 和平号-144-3p 结果表明，感染MABC的MDMS中4种促炎细胞因子/趋化因子水平显著升高(图1)。 4B )。在Mams感染中， 和平号-144-3p 过度表达导致 伊-6 , 肿瘤坏死因子 ，和 CXCL 2 级别，但不影响 IL-1β (无花果) 4B )。转染效率 和平号-144-3p 如附图所示 5 。因此， 和平号-144-3p MABC或M物质感染诱导人MDM中促炎性细胞因子/趋化因子mRNA的合成。
TLR阴性调节器的水平 Sarm1 和 TNIP 3 患者外周血单个核细胞表达下调 的目标 和平号-144-3p 在调节宿主炎症反应时，我们使用了计算目标预测工具米兰达( Http://www.microrna.org/microrna/home.do )、TargetScan和Dia-MicroT( Http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ )。生物信息学分析确定了两个编码sarm1的TLR负调节基因。 14 和TNIP 3 15 如 和平号-144-3p 目标。然后，我们用qrt-PCR方法检测了PBMCs中mRNA的表达水平，发现两者都有表达。 Sarm1 和 TNIP 3 两种MABC的水平均明显下降( n =22)和MMass( n =11)组(图1)。 5A，b )。此外， Sarm1 水平与 CXCL 2 和 CCL 2 所有测试对象的水平。类似于这些结果， TNIP 3 MRNA水平与 CXCL 2 和 CCL 2 所有被试的水平(图1)。 5C，d ).
图5： Sarm1 和 TNIP 3 NTM患者与HCS患者之间的PBMCs。 a , b 细胞因子/趋化因子基因在NTM患者和HCS中的差异表达。人PBMC是从HC中分离出来的。 n =25)和NTM患者(MABC， n =22；MMass， n =11)和 Sarm1 (a )和 TNIP 3 (b 用实时定量PCR方法检测mRNA的表达.曼-惠特尼U测试。 C，d 相关分析 Sarm1 和 CXCL 2 /CCL 2 (c )和 TNIP 3 和 CXCL 2 /CCL 2 (d ). e 人原发性MDM转染模拟阴性对照(对照组)或 和平号-144-3p 模拟(10 NM)24小时，然后感染或不感染MABC或MMass(MOI=2，每个；3h)。实时定量PCR分析 TNIP 3 和 Sarm1 表情。* p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001. Spearman correlation (c , d )；单向方差分析( e )。数据代表三、四个独立实验，一式两份。健康对照 脓肿 Subsp. 脓肿 麦斯 脓肿 Subsp. 地块 .
进一步确定是否 和平号-144-3p 都参与了对这两家公司的监管 Sarm1 和 TNIP 3 ，我们用 和平号-144-3p 模拟和评估 Sarm1 和 TNIP 3 MABC和M物质感染后。数据显示 和平号-144-3p 未能下调和显著上调 TNIP 3 和 Sarm1 在人类MDMs感染前后MABC或MMass(图1)。 5E )。这些数据表明 Sarm1 和 TNIP 3 不是假定的目标 和平号-144-3p 。然而，这些数据表明，低水平的TLR负调控者 Sarm1 和 TNIP 3 NTM患者炎症反应上调起一定作用。
和平号-144-3p 在小鼠体内外被上调 因为 和平号-144-3p 人类和老鼠的序列是相同的。 6A )，我们接下来评估了MABC和Mams感染对大鼠的影响。 和平号-144-3p 体内和体外水平。为此，C57BL/6小鼠感染MABC或MMass3天，取肺测定miRNA和mRNA水平。二. MMU-miR-144-3p MABC或M物质感染后小鼠肺组织水平明显升高(图二)。 6B )，以及五种促炎细胞因子和趋化因子的水平。 6C ).
图6： 和平号-144-3p 在体外和体内水平升高，并与细胞内MABC和M质量的生长有关。 a 对齐 和平号-144-3p 人类和小鼠基因组序列(hsa， 智人 ；嗯， [医]肌肉 ). b , c C57BL/6小鼠经鼻感染MABC(1×10) 7 (1×10) 7 在感染后7天(Dpi)进行监测。实时定量PCR分析 和平号-144-3p (b )和 肿瘤坏死因子 , IL6 , CCL 2 , Cxcl 2 ，和 IL1b (c )感染小鼠肺组织( n =4，每组)。 d 小鼠BMDMs感染MABC或MMass(MOI=3，2h)，并在一定时间内进行培养。定量RT-PCR分析 MMU-miR-144-3p . e 小鼠bmdms转染模拟阴性对照(Ctrl)或 MMU-miR-144-3p 模拟(10 NM)作用24h，细胞感染MABC或MMass(MOI=1，每组1)，24 h后用CFU法测定细胞内细菌的存活情况。 p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. ns not significant, U uninfected, A Mabc, MMmass. Mann–Whitney U test (b , c ，和 e )；单向方差分析( d )。值表示至少四个独立实验的平均值(±sd)，一式三份( b –d )。数据是三个独立实验的综合结果(平均值±扫描电镜)。 e )。MABC 脓肿 Subsp. 脓肿 麦斯 脓肿 Subsp. 地块 .
我们还检测了小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)在MABC或M物质感染后的miRNA和mRNA水平。尽管MABC和MMass群的峰值时间点不同，但这两种菌株都显着地提高了 MMU-miR-144-3p 在BMDM中的级别(图)。 6d )。此外，MABC感染还显著增加了mrna的表达。 肿瘤坏死因子 , IL-1β ，和 CXCL 2 在BMDMS中以时间依赖的方式(补充图)。 6A )。有趣的是，Mams感染显著增加了 肿瘤坏死因子 , IL-1β ，和 CXCL 2 BMDM感染后18h的水平(附图)。 6B )。此外， MMU-miR-144-3p 过表达导致BMDMs细胞内MABC和M质量的轻度上调(图1)。 6E )。因此， MMU-miR-144-3p 在体外和体内，MABC和MMass感染均能提高MABC和MMass的水平，有利于MABC和MMass的细胞内生长。
