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和平号-144-3p感染的患者与病理性炎症有关。脓肿分枝杆菌

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发表时间:2021-01-21 09:48作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

感染快速增长的非结核分枝杆菌正在作为一个全球性的健康问题出现;然而,关键的宿主因素仍然难以捉摸。在此,我们研究了患者外周血单个核细胞(PBMCs)的特征免疫谱。脓肿分枝杆菌分庭。脓肿(MABC)和脓肿Subsp.地块(MMass)。通过对全局mRNA和微RNA表达谱的综合分析,我们发现几种炎症细胞因子/趋化因子[白细胞介素(IL)-1β,伊-6,C-X-C基序趋化因子配体2和C-C基序趋化因子配体2]和和平号-144-3p与健康对照组(HCS)比较,患者外周血单个核细胞(PBMC)表达明显升高。值得注意的是,和平号-144-3p和促炎细胞因子/趋化因子。同样,上调了和平号-144-3p小鼠腹腔巨噬细胞和肺组织中存在促炎细胞因子/趋化因子。我们发现炎症负调节因子的表达Sarm1TNIP 3)患者外周血单个核细胞(PBMC)的调控水平明显下降,尽管它们不是预期的靶点。和平号-144-3p。此外,过度表达和平号-144-3p导致促炎细胞因子/趋化因子显著增加,促进巨噬细胞细菌生长。我们的研究结果共同强调了和平号-144-3p与病理炎症脓肿感染。

导言

在世界范围内,非结核分枝杆菌(NTM)感染的发病率和流行率越来越高,这引起了越来越多的关注。1。在NTM中,脓肿分枝杆菌-其中包括M. 脓肿Subsp.脓肿(MABC),M. 脓肿Subsp.Massiliense(MMass),和M. 脓肿Subsp.牛肝菌-增长迅速。M. 脓肿具有临床意义,因为它的多药耐药和有限的疗效,现有的治疗方法。2,3,4,5。.的风险M. 脓肿感染与免疫缺陷、免疫抑制治疗、老年以及潜在的肺和全身疾病有关。6,7。然而,宿主的免疫因子被调节保护和病理反应在M. 脓肿感染情况尚不清楚。

宿主免疫应答是决定NTM感染结果的决定因素,因为大多数NTM菌株是普遍存在且不具有传染性的。多种细胞因子,包括肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-32(IL-32),有可能作为某些NTM疾病的生物标志物。6,7,8我们对NTM感染的免疫反应的性质和调节的认识是不完整的。此外,天然免疫信号被严格控制,以确保有效的免疫和防止过度炎症损害。9,10。因此,在NTM感染过程中,识别和量化影响病理炎症与保护性免疫反应平衡的主要宿主因子是非常重要的。

MicroRNAs(MiRNAs)是一种小的非编码rna分子,是免疫和炎症反应的关键转录后调节因子。11。MiRNAs也有可能成为各种传染病的生物标志物。12,13。对NTM患者差异表达miRNAs的表达谱和功能的评价,将有助于开发生物标志物,提高我们对NTM感染过程中免疫病理的认识。

在这里,我们寻求研究免疫mRNA和miRNA特征的外周血单个核细胞(PBMCs)未经治疗的肺部疾病患者感染MABC或M。NTM患者PBMCs中几种促炎细胞因子/趋化因子的表达与健康对照组(HCS)比较有显着性差异(P<0.01)。此外,和平号-144-3p患者PBMC和小鼠骨髓巨噬细胞(BMDM)感染MABC或M质量后或感染小鼠肺组织后,其水平均显著升高。进一步的研究表明Sarm1(无菌α和含TIR基序的1蛋白)14TNIP 3(TNFAIP 3相互作用蛋白3)15,炎症的负调节因子,患者的PBMC与HCS的PBMC相比受到抑制,尽管它们并不是预期的靶点。和平号-144-3p。此外,过度表达和平号-144-3p导致炎症细胞因子/趋化因子明显增加,细菌生长增加。这些数据表明,肺部疾病患者脓肿感染加重了病理性炎症和平号-144-3p.

材料和方法

道德声明

研究患者的临床和实验室数据来自正在进行的机构审查委员会批准的前瞻性观察队列研究,以调查NTM肺病(临床试验.gov标识符NCT 00970801)。这项研究得到了春南国立大学医院机构研究和伦理委员会的批准(CNUH 2019-04-046;大田,韩国)。

NTM识别

取痰进行微生物鉴定。采用标准方法进行抗酸杆菌涂片和培养。用聚合酶链反应(PCR)-反向杂交法(Reba)鉴定NTM种。RpoB基因或通过巢式多重PCR-反向杂交(RLB)杂交检测内转录间隔区(ITS)区域。

对于PCR-Reba目标RpoB基因,一个Reba myco-ID试剂盒(YD诊断,韩国首尔)被使用.本实验采用3种来自临床分离株的模板脱氧核糖核酸(μL)。这个RpoB用生物素标记引物扩增基因区域。PCR条件为:94℃下1次循环5 min,94℃45次30 s,65℃30 s,72℃1次7 min。将PCR产物与固定化探针杂交到膜上。这些数据是使用制造商提供的Reba myco-ID数据表来解释的。

对ITS区域进行多重PCR-RLB杂交,采用AdvanSure分枝杆菌基因印迹法(LG生命科学,韩国首尔)。AdvanSure试验是按照制造商的指示进行的。简单地说,用含有2×μ混合物的反应混合物的25μL,引物混合物的5μL,样品DNA的7.5μL进行PCR。PCR条件为:50°C 1次,2 min,95°C 10 min,94°C 15次,30 s,65°C 1 min,72°C 30 s,94°C 38次,30 s,55°C 1 min,72°C 30 s,72°C 1 min,72℃10 min。用20μL的扩增样品进行杂交,加入链霉亲和素-碱性磷酸酶结合物后,观察蓝色染色。用AdvanSure基因扫描(LG生命科学)测量该波段的颜色强度。

细胞培养

从肝素化静脉血中分离出来自健康志愿者的人外周血单个核细胞(lymphoprepp;Axis-Shield,1114544,Dundee,苏格兰)。16。单核细胞源性巨噬细胞(MDM)分化,粘附单核细胞在Roswell Park纪念研究所1640培养液(Lonza,12~702 F,巴塞尔,瑞士)中加入5%人血清(Sigma-Aldrich,H 4522,MO,美国)和1%L-谷氨酰胺(L-谷氨酰胺)在37°C下孵育1h后,去除不贴壁细胞。在4 ng/mL人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(R&D,216-MC,MN,USA)存在下培养4天,制备人MDM。

取小鼠骨髓,在含10%胎牛血清(Serana,S-FBS-US-015,Pessin,德国)和抗生素(Lonza,17-745 E,R&D,416-ML)的Dulbecco改良Eagle‘s培养基(Lonza,12-604F)中培养3~5d。细胞在37°C加湿环境中培养,加入5%的二氧化碳。

小鼠

本研究选用8~12周龄(年龄相配)雄性C57BL/6小鼠(韩国庆功岛,Samtako Bio).在特定的无病原体条件下,小鼠维持12小时的光/暗循环。所有动物实验方法和程序都是按照春南国立大学医学院机构研究和伦理委员会批准的相关道德准则和条例(201912A-CNU-203;大田,韩国)和韩国食品和药物管理局的准则进行的。

纳米线计数法及数据分析

分别使用NanoString n计数器GX人类免疫学试剂盒V2(NanoString Technologies Inc.,西雅图,WA,USA)和N计数器人miRNA检测试剂盒V3(NanoString Technologies Inc.,西雅图,WA,USA),在PhileKorea Technology(韩国大田)进行了NanoString人免疫学基因表达检测和人miRNA表达检测。NSolver,版本4.0(NanoString Technologies),被用于与n计数器分析数据的差异基因表达分析。根据nSolver 4.0分析软件用户手册,来自n计数器仪器的所有报告代码计数文件都通过了默认的QC设置。所有原始基因表达数据均在阳性对照、规范化和家政规范化步骤中默认进行规范化。计算折叠变化的方法是:取健康对照组归一化车道的平均值,并调整错误发现率(Fdr)。p-数值是用Benjamin amini-Yekutieli程序计算的。

RNA提取与定量实时PCR

采用Ficoll-Hypaca(Lymphoprepp;Axis-Shield,1114544,Dundee,苏格兰)从肝素化静脉血中分离人外周血单个核细胞.用QIAzol裂解试剂(齐根,1023537,德国希尔登)和miRNeaseMini试剂盒(齐根,217004)根据制造商的指示提取PBMCs总RNA,然后用QIAxpert(Chiagen)进行RNA定量和评价。

RNA定量后,利用反转录主预混物(Elpis Biotech,EBT-1515,大田,韩国)合成了总RNA中的互补DNA(CDNA)。在miRNA表达分析中,用miScriptⅡRT试剂盒(齐根,218161)合成了来自总RNA的cdna,如前所述。17。用SYBR绿色主混合剂(Chiagen,204076)或miScript SYBR绿色PCR试剂盒(Chiagen,218073)和引物对转-基因Q2复合系统(齐根,9001620)进行qRT-PCR。引物序列显示在补充表中。1。用2−ΔΔCT法计算mrna和miRNA的相对表达水平。

分枝杆菌菌种的制备、感染及细胞内集落形成单位(Cfu)的检测

在含有10%油酸白蛋白葡萄糖过氧化氢酶(BD,富兰克林湖,NJ,美国)的米德尔布鲁克7H9培养基中,用轨道摇床将mbc(Atcc 19977)和mMass(kmrc-00136-13018)在37°C下孵育,直到中对数阶段(OD)。600 nm=0.4),如前所述18.

细胞接种MABC或M质体2 h,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次,去除细胞外细菌,在37℃加湿5%二氧化碳的新鲜培养基中培养。小鼠体内感染,经鼻注射MABC或MMass(I.N.;1×10)。7(CFU/鼠标)。在NTM感染后的指定时间对小鼠进行安乐死,以确定细菌的负担。如上文所述,用组织匀浆器(Omni th;Omni International,GA,USA)在PBS中用0.1%吐温20对肺进行切除和匀浆。18.

用CFU法分析宿主细胞的细菌活力,将感染的细胞溶于蒸馏水中释放细胞内的细菌。随后,将感染组织或细胞的连续稀释匀浆接种到7H10琼脂平板上,3~4天后计数菌落数。

生物信息学分析

对每个基因性状,在主成分分析(PCA)之前,首先在log2量表上转化24份样本的表达水平。PCA使用R中的“stats”包中的“prcomp”函数执行(3.2.4版)19前两个主成分。我们用TargetScan人体释放7.1(Http://www.targetscan.org/)20。使用David进行了功能和路径丰富分析(版本6.8,Https://david.ncifcrf.gov)21和豹(15.0版,Http://www.pantherdb.org)22具有人类参考基因集的分类系统。为了可视化火山图和热图,我们使用了R中“图形”包中的“绘图”功能。

细胞转染

这个HSA-miR-144-3pMMU-miR-144-3pMIMICS(Sense 5‘-UACAGUGAUGUACU-3’,反义5‘-AGUACAUCAUCUAUACUGUA-3’)相同,购自GENCRE(韩国首尔)。模拟阴性对照(4464058)是从Invitrogen(CA,美国)购买的。根据制造商的说明,使用脂质体2000(Invitrogen,11668019)将寡核苷酸转染到bmdms或人原发性mdm中(Invitrogen,11668019)。16。为实现实时PCR,从齐根公司购买了hsa-miR-144-3p引物(MS00020328)和MMU-miR-144-3p引物(MS00032326).

统计分析

统计分析采用Analysis-it,Version 5.1(Analysis-it Software,Ltd.,Leeds,UK),SPSS Statistics for Windows,Version 24.0(SPSS,Inc.,Chicago,IL,USA)和GraphPad Prism,Version 5.0(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)。数据经主成分分析、Spearman相关、学生相关处理。t-测试,Mann-Whitney U检验,ANOVA,和Kruskal-Wallis测试(视情况而定),并在上面的每个图形和图形图例中详细说明。计算结果为均值±扫描电镜(标准差)和显着性(*)。p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ns not significant).

结果

NTM患者的临床特点

31例mbc感染患者和22例mbc感染患者的临床特征见表。1。感染mbc和mbs的患者的平均年龄分别为59岁和55岁;大约四分之三的患者是女性,从未吸烟。最常见的基础条件是支气管扩张,其次是以前的肺结核和慢性阻塞性肺疾病在MABC和MMass组。没有一名患者检测出人体免疫缺陷病毒呈阳性。所有患者均有呼吸道症状,如咳嗽、痰或咯血。在胸部CT上,93%的MABC感染患者和86%的M肿块感染患者呈结节状细支气管扩张(补充图)。1)。MABC感染组的红细胞沉降率为33 mm/h,M块感染组的红细胞沉降率为31 mm/h。痰抗酸杆菌涂片阳性率分别为48%和36%。两组患者的特征无显着性差异。

表1研究患者在诊断时的基线特征。

NTM患者和HCS患者的免疫转录组分析

我们对mbc感染者的PBMC进行了人免疫基因表达的检测(n=11),被感染的病人(n=7),以及HCS(n=6)(图6。1A,补充表2)。所有受试者均为女性,年龄相近(p=0.31(Kruskal-Wallis检验)。MABC感染者的平均年龄为61.1岁,MMS患者的平均年龄为59.4岁,HCS的平均年龄为55.2岁。

图1:免疫转录组分析显示NTM患者和HCS患者PBMC间促炎细胞因子/趋化因子的表达差异。

a本研究中免疫转录组分析的原理图。b主成分分析结果显示所有测试样本(HC)的前两个主成分(PC1和PC2)n=6;MABC,n=11;MMass,n=7)。c火山图代表了579个免疫相关基因,对数2倍的变化与负的log 10相对应。p-与HC组相比,MABC组和MMass组的值。与HC组相比,红点和蓝点显示上调和下调基因。d前5条KEGG通路的结果富集了109种常见的MABC和M-质量群。e作为细胞因子-细胞因子相互作用途径(Hsa04060)组分的28个DEGS的热图。用红色标记的9个基因表明,它们在MABC或MMass组或TNF信号通路的成员中被上调了10倍以上。阿伊-7蓝色标记的基因表示MABC和MMass组中最受抑制的基因。利用Z分数的欧氏距离矩阵对基因进行层次聚类.健康对照脓肿Subsp.脓肿麦斯脓肿Subsp.地块.

为了评估23个数据集之间的转录组相似性,我们进行了PCA。HCS被很好的分离和聚集,另外两种类型的患者混合在PCA中,表明mbc感染和mbs感染的患者在转录组范围内的基因表达谱几乎没有或没有显著的差异,但这些图谱与hcs的转录组明显不同(见图)。1B)。接下来,我们用这两种方法分别鉴定了mbc和mms中143和151个差异表达基因(Degs)与hc的差异表达基因(Degs)。t-测试和折叠变化(FC)分析(FDR<0.05和FC>2)(图2)。1C)。在109个常见的dgs中,28个degs主要参与细胞因子-细胞因子受体的相互作用,这是最显著的富集途径(fdr<2.06×10)。−16)使用KEGG(京都基因和基因组百科全书)。1D在NTM感染的患者中,几乎四分之三(28例中有21例)基因被上调。值得注意的是,9个基因[C-C基序趋化因子配体(CCL)2,CCL 7,CCL 20,CCL 22,CCL 24,C-X-C基序趋化因子配体(CXCL)2,CCL 24,IL1B,TNF,和伊-6]在NTM感染条件下,与免疫反应和炎症有关的持续升高(超过10倍)。1E)。此外,伊-7,是T-助手1反应的关键细胞因子。23,24,25,26,是最下调的基因,在两种类型的患者中减少了6倍。

HCS患者PBMC中促炎细胞因子/趋化因子的表达

为了验证细胞因子/趋化因子的表达增加,我们对来自扩增群体的PBMC(MABC)进行了qRT-PCR,n=31;MMass,n=22;HC,n=39)。MRNA水平IL-1β, 伊-6, CXCL 2,和CCL 2与HCS患者相比,MABC感染和M群感染患者PBMC明显增加(见图)。2A,c-e)。这个肿瘤坏死因子与HCS组相比,MABC感染组和M组PBMC中mRNA水平均无明显升高(图1)。2B)。细胞因子/趋化因子水平无显着性差异(IL-1β, 肿瘤坏死因子, 伊-6, CXCL 2,和CCL 2)MABC感染患者与M块感染患者之间。有趣的是,CCL 5与HCS患者相比,M群感染患者PBMC的mRNA水平明显降低(见图)。2F)。此外,CCL 7, CCL 20,和CCL 24,但不是CCL 22,与HCS(补充图)相比,MABC或M质量感染患者明显增加。2).

图2:NTM患者与HCS患者PBMCs细胞因子/趋化因子谱的qRTPCR分析。

af细胞因子/趋化因子基因在NTM患者和HCS中的差异表达。人PBMC是从HCS中分离出来的。n=39)和NTM患者(MABC,n=31;MMass,n用实时定量PCR法检测细胞因子/趋化因子mRNA的表达。a IL1B; b肿瘤坏死因子; c IL6; d CXCL 2; e CCL 2; f CCL 5). giHCS细胞因子/趋化因子变量之间的相关矩阵(g),MABC感染者(h),以及被感染的患者(i)。在本研究中,6个细胞因子/趋化因子变量组合的相关矩阵显示了相关系数。NS,没什么意义。曼-惠特尼U测试。数据为三次或四次独立实验的综合结果(平均±扫描电镜)。健康对照脓肿Subsp.脓肿麦斯脓肿Subsp.地块.

然后,我们调查了不同细胞因子/趋化因子之间的相互关系(图一)。2G-I)。在HCS中,两者之间存在显著的正相关关系。IL-1β, 伊-6, CXCL 2,和CCL 2,而两者之间存在着负相关。肿瘤坏死因子CCL 5(无花果)2G)。在mbc感染的患者中,两者之间存在很强的正相关关系。伊-6CXCL 2 (n=31,r=0.543,p=0.002),CXCL 2IL-1β (n=31,r=0.723,p < 0.001), CXCL 2CCL 2 (n=31,r=0.736,p < 0.001), and IL-1β伊-6 (n=31,r=0.670,p < 0.001). However, the 肿瘤坏死因子水平与IL-1β, 伊-6, CXCL 2,和CCL 2但不是CCL 5(正相关;n=31,r=0.446,p=0.012)(图1。2H)。在多发性硬化症患者中,两者之间有很强的相关性。伊-6IL-1β (n=22,r=0.554,p=0.007),伊-6CXCL 2 (n=22,r=0.570,p=0.006),以及CXCL 2CCL 2 (n=22,r=0.733,p < 0.001). Similar to the findings observed in the Mabc-infected patients, the 肿瘤坏死因子水平与CCL 5在弥漫性感染的病人中(n=22,r=0.560,p=0.007)(图1。2I)。这些数据表明肿瘤坏死因子与其他促炎细胞因子/趋化因子在患者。

我们进一步研究了细胞因子/趋化因子水平与各种临床参数的关系。每种细胞因子/趋化因子与某些临床参数呈极强的正/负相关性(附图)。3)。值得注意的是,在感染mms的病人中,CCL 5血清白蛋白水平与血清白蛋白水平呈显著正相关(n=22,r=0.450,p=0.036)CXCL 2与血清白蛋白水平呈负相关(n=22,r=0.418,p=0.053)。这些结果提示,MABC感染和M群感染患者的外周免疫细胞有明显的上调的促炎症细胞因子/趋化因子,这可能与特定临床参数的调节有关。

这个和平号-144-3p患者外周血单个核细胞水平升高

为了探讨促炎症细胞因子/趋化因子在患者中表达改变的机制,我们对PBMCs进行了人miRNA表达检测,并对23例正常人标本进行了miRNA表达水平的检测(图一)。3A,补充表3)。与HCS相比,我们分别检测到25例(14例上调和11例下调)和10例(8例上调和2例下调)差异表达的miRNAs(FDR<0.05和折叠变化>2)。3B)。其中9例(7例上调,2例下调)miRNAs表达模式相同(图1)。3C,d)。接下来,为了验证这些差异表达的miRNAs是否能够调节促炎症反应基因,我们利用TargetScan数据库筛选出了潜在的miRNA靶基因,并对预测的靶基因进行了显着地富集(FDR<5%)。我们在目标基因中发现了11,9和23条重要的黑豹路径。和平号-144-3p, 米-1-3p,和和平号-132-3p分别(补充表)4)。共有5条途径(促性腺激素释放激素受体通路;P 06664,血管生成;P 00005,FGF信号通路;P 00021,EGF受体信号通路;P 00018和CCKR信号通路;P 06959),与免疫反应相关的三条途径(干扰素-γ信号通路;P 00035,T细胞活化;P 00053,和白细胞介素信号通路;P 00036)。3E).

图3:和平号-144-3p经miRNA转录组鉴定,NTM患者PBMCs表达上调。

aMiRNA转录组分析的原理图。b用对数2倍变化(Fc)表示798个人类mirna基因的火山图。p-与HC组比较,MABC组和MMass组的值。与HCS相比,红点和蓝点表明miRNA基因被上调和下调。cVenn图显示,两组患者均有9例miRNAs改变。d与HC组相比,MABC和M质量群的9种常见miRNAs的Log2倍变化。eTargetScan7.1预测的miRNA靶基因的豹途径富集试验结果。f点画图和平号-144-3p,NTM患者与HCS患者之间存在差异表达。人PBMC是从HCS中分离出来的。n=39)和NTM患者(MABC,n=31;MMass,n=22)。实时定量PCR分析和平号-144-3p表情。g人PBMC是从HCS中分离出来的。n=17)和NTM患者(MABC,n=14;MMass,n=14),以及和平号-1255 a和平号-5001-3p用qRT-PCR法测定.NS,无显着性;HC,健康对照;MABC,患者感染MABC;曼-惠特尼U测试。值表示三个独立实验的平均值(±SEM),一式三份。f, g)。健康对照脓肿Subsp.脓肿麦斯脓肿Subsp.地块.

我们选择了三种miRNAs,它们在患者和hcs之间的表达差异最大,并证实和平号-144-3pMABC感染和M群感染患者的水平明显高于HCS患者(见图)。3F; p < 0.001). The levels of the other two miRNAs (HSA-miR-1255 aHsa-miR-5001-3p)无显着性差异(图二)。第三代)。我们还检查了病情的严重程度和抗生素治疗的开始是否影响和平号-144-3p。当根据BACES评分来划分严重程度时27(补充图。4A)和相应的表达式级别和平号-144-3p两组比较,无显着性差异(附图)。4B; p=0.905)。水平和平号-144-3p也没有显示出任何明显的差异取决于抗生素治疗是否开始(补充图)。4C; p=0.215)。总之,这些数据表明和平号-144-3p是来自MABC或M群感染患者PBMCs的特征性miRNA。

和平号-144-3p过表达促进人巨噬细胞中促炎细胞因子/趋化因子的表达

Hsa-mir-144-3p据报道在特应性皮炎中起着促炎作用。28。因此,我们评估了和平号-144-3p水平和炎性细胞因子/趋化因子。这个和平号-144-3p水平与健康水平呈显著正相关。IL-1β(n=92,r=0.448,p < 0.0001), 伊-6 (n=92,r=0.615,p < 0.0001), CXCL 2 (n=92,r=0.506,p < 0.0001), and CCL 2 (n=92,r=0.35,p=0.0006)(图1。4A).

图4:过度表达和平号-144-3p上调炎性细胞因子/趋化因子在人MDMs中的表达。

a90%密度椭圆的散点图显示和平号-144-3p密谋IL1B, IL6, CXCL 2,和CCL 2所有科目(HC,n=39;MABC,n=31;MMass,n=22)。Spearman秩相关决定了系数(r)和意义。b人原发性MDM转染模拟阴性对照(对照组)或和平号-144-3p模拟(10 NM)24小时,然后感染或不感染MABC或MMass(MOI=2,每个;3h)。实时定量PCR分析IL1B, IL6, 肿瘤坏死因子,和CXCL 2表情。*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001. Spearman correlation (a);单向方差分析(b)。值表示三次独立实验的平均值(±sd)。b)。健康对照脓肿Subsp.脓肿麦斯脓肿Subsp.地块.

接下来,我们用一个和平号-144-3p模拟和检测IL-1β, 伊-6, 肿瘤坏死因子,和CXCL 2。过度表达和平号-144-3p结果表明,感染MABC的MDMS中4种促炎细胞因子/趋化因子水平显著升高(图1)。4B)。在Mams感染中,和平号-144-3p过度表达导致伊-6, 肿瘤坏死因子,和CXCL 2级别,但不影响IL-1β(无花果)4B)。转染效率和平号-144-3p如附图所示5。因此,和平号-144-3pMABC或M物质感染诱导人MDM中促炎性细胞因子/趋化因子mRNA的合成。

TLR阴性调节器的水平Sarm1TNIP 3患者外周血单个核细胞表达下调

的目标和平号-144-3p在调节宿主炎症反应时,我们使用了计算目标预测工具米兰达(Http://www.microrna.org/microrna/home.do)、TargetScan和Dia-MicroT(Http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/)。生物信息学分析确定了两个编码sarm1的TLR负调节基因。14和TNIP 315和平号-144-3p目标。然后,我们用qrt-PCR方法检测了PBMCs中mRNA的表达水平,发现两者都有表达。Sarm1TNIP 3两种MABC的水平均明显下降(n=22)和MMass(n=11)组(图1)。5A,b)。此外,Sarm1水平与CXCL 2CCL 2所有测试对象的水平。类似于这些结果,TNIP 3MRNA水平与CXCL 2CCL 2所有被试的水平(图1)。5C,d).

图5:Sarm1TNIP 3NTM患者与HCS患者之间的PBMCs。

a, b细胞因子/趋化因子基因在NTM患者和HCS中的差异表达。人PBMC是从HC中分离出来的。n=25)和NTM患者(MABC,n=22;MMass,n=11)和Sarm1 (a)和TNIP 3 (b用实时定量PCR方法检测mRNA的表达.曼-惠特尼U测试。C,d相关分析Sarm1CXCL 2/CCL 2 (c)和TNIP 3CXCL 2/CCL 2 (d). e人原发性MDM转染模拟阴性对照(对照组)或和平号-144-3p模拟(10 NM)24小时,然后感染或不感染MABC或MMass(MOI=2,每个;3h)。实时定量PCR分析TNIP 3Sarm1表情。*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001. Spearman correlation (c, d);单向方差分析(e)。数据代表三、四个独立实验,一式两份。健康对照脓肿Subsp.脓肿麦斯脓肿Subsp.地块.

进一步确定是否和平号-144-3p都参与了对这两家公司的监管Sarm1TNIP 3,我们用和平号-144-3p模拟和评估Sarm1TNIP 3MABC和M物质感染后。数据显示和平号-144-3p未能下调和显著上调TNIP 3Sarm1在人类MDMs感染前后MABC或MMass(图1)。5E)。这些数据表明Sarm1TNIP 3不是假定的目标和平号-144-3p。然而,这些数据表明,低水平的TLR负调控者Sarm1TNIP 3NTM患者炎症反应上调起一定作用。

和平号-144-3p在小鼠体内外被上调

因为和平号-144-3p人类和老鼠的序列是相同的。6A),我们接下来评估了MABC和Mams感染对大鼠的影响。和平号-144-3p体内和体外水平。为此,C57BL/6小鼠感染MABC或MMass3天,取肺测定miRNA和mRNA水平。二.MMU-miR-144-3pMABC或M物质感染后小鼠肺组织水平明显升高(图二)。6B),以及五种促炎细胞因子和趋化因子的水平。6C).

图6:和平号-144-3p在体外和体内水平升高,并与细胞内MABC和M质量的生长有关。

a对齐和平号-144-3p人类和小鼠基因组序列(hsa,智人;嗯,[医]肌肉). b, cC57BL/6小鼠经鼻感染MABC(1×10)7(1×10)7在感染后7天(Dpi)进行监测。实时定量PCR分析和平号-144-3p (b)和肿瘤坏死因子, IL6, CCL 2, Cxcl 2,和IL1b (c)感染小鼠肺组织(n=4,每组)。d小鼠BMDMs感染MABC或MMass(MOI=3,2h),并在一定时间内进行培养。定量RT-PCR分析MMU-miR-144-3p. e小鼠bmdms转染模拟阴性对照(Ctrl)或MMU-miR-144-3p模拟(10 NM)作用24h,细胞感染MABC或MMass(MOI=1,每组1),24 h后用CFU法测定细胞内细菌的存活情况。p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. ns not significant, U uninfected, A Mabc, MMmass. Mann–Whitney U test (b, c,和e);单向方差分析(d)。值表示至少四个独立实验的平均值(±sd),一式三份(bd)。数据是三个独立实验的综合结果(平均值±扫描电镜)。e)。MABC脓肿Subsp.脓肿麦斯脓肿Subsp.地块.

我们还检测了小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)在MABC或M物质感染后的miRNA和mRNA水平。尽管MABC和MMass群的峰值时间点不同,但这两种菌株都显着地提高了MMU-miR-144-3p在BMDM中的级别(图)。6d)。此外,MABC感染还显著增加了mrna的表达。肿瘤坏死因子, IL-1β,和CXCL 2在BMDMS中以时间依赖的方式(补充图)。6A)。有趣的是,Mams感染显著增加了肿瘤坏死因子, IL-1β,和CXCL 2BMDM感染后18h的水平(附图)。6B)。此外,MMU-miR-144-3p过表达导致BMDMs细胞内MABC和M质量的轻度上调(图1)。6E)。因此,MMU-miR-144-3p在体外和体内,MABC和MMass感染均能提高MABC和MMass的水平,有利于MABC和MMass的细胞内生长。


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