SOx-5通过促进Th17细胞分化，激活一种新型的rorγ促敏剂，促进实验性自身免疫性脑脊髓炎的发生

T辅助性17(Th17)细胞在炎症和自身免疫性疾病的发病机制中具有重要作用。视网膜相关孤儿受体-γt(RORγt)是Th17细胞分化和功能所必需的。然而，转录调控RORγt表达，特别是在增强剂的水平，仍然是很难理解的。在这里我们发现了一种新的增强剂RORγt基因在Th17细胞中，RORCE 2。RORCE 2缺乏抑制了RORγt的表达和Th17的分化，导致实验性自身免疫性脑脊髓炎的严重程度降低。机械地，RORCE 2被循环到RORγt在Th17细胞中，启动子通过SRY-box转录因子5(Sox-5)启动子，缺失SOx-5结合位点，使RORCE 2功能消失，并影响信号转导子和转录激活因子3(STAT 3)与RORγt位点的结合。综上所述，我们的数据突出了调节Th17分化和功能的分子机制，这可能是Th17相关疾病的一条新的干预线索。

众所周知，T辅助型17(Th17)细胞是T助手(Th)家族的一个子集，其特征是白细胞介素(IL)-17A的产生。Th17细胞是宿主抵御细胞外病原体和维持粘膜组织内稳态的关键细胞。1,2,3,4。除IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等趋化因子外，Th17细胞还可分泌促进中性粒细胞向感染部位迁移和介导病原体清除的趋化因子。5,6。虽然Th17细胞在宿主防御中起着重要作用，但它们也与自身免疫性和炎症性疾病有关，如多发性硬化(MS)、类风湿关节炎(RA)、炎症性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(SLE)、银屑病、过敏和哮喘。7,8.

天真CD4的分化+T细胞转化为Th17细胞主要受IL-6和转化生长因子β(TGF-β)的调控。9,10。IL-6与Th17细胞膜同源受体的结合导致信号转导和转录激活因子3(STAT 3)磷酸化和二聚。3。磷酸化的STAT 3二聚体随后转入细胞核，诱导转录因子(Tf)视网膜相关孤儿受体-γt(rorγt)的表达。RORC基因11,12。Rorγt被认为是Th17细胞的家族特异性标记，并且是Th17细胞谱系承诺和功能所必需的。11。RORγt能直接激活编码IL-17A和IL-17F的基因。11. RORγt-不足(RORγt−/−)小鼠对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的敏感性降低。11。由于RORγt在Th17细胞中的关键作用，因此更好地理解其转录和转录后调控是至关重要的。RORγt基因表达13。增强子是转录水平上关键的顺式调节元件之一。14。探讨参与调控的潜在促进剂RORγt基因在Th17细胞中的表达是了解Th17相关疾病的关键问题。

潜在增强子的识别是通过特定的组蛋白修饰来实现的，这种修饰标志着基因组中类似增强子的区域。特别是，活性增强子显示组蛋白H3赖氨酸4单甲基化(H3K4me1)、H3K4二甲基化(H3K4me2)和H3赖氨酸27乙酰化(H3K27ac)过度富集，但没有H3K4三甲基化(H3K4me3)。15,16。增强子通常调节特定基因的转录活性，而不管它们的位置、方向或与目标启动子的距离。这种调控通常通过染色质循环机制进行，增强子通过这种机制与目标启动子接近。17。染色质环的形成依赖于多层TFs与增强子的结合，从而导致染色质的开放和介体(Med)的重新形成，这是一种重要的蛋白质复合体，介导TFs与RNA聚合酶II(RNA Pol II)之间的相互作用。14,17,18,19.

在本研究中，我们发现RORCE 2是小鼠Th17细胞中RORγt基因的一种新的增强子。SRY-box转录因子5(SOX-5)介导RORCE 2与RORγt基因启动子之间的循环，促进Th17分化和EAE发病。此外，SOX-5是STAT 3与RORCE 2结合并发挥TF功能的先决条件。本研究不仅为Th17分化提供了新的机制，而且也为今后干预Th17相关疾病提供了潜在线索。

一种新型活性增强子的鉴定与表征RORγt基因

由于h3k4me2是著名的活性促进剂组蛋白标记物。16，我们利用h3k4me2染色质免疫共沉淀序列(chip-seq)数据，对小鼠Th17细胞和非Th17细胞(包括Th1和先天淋巴样细胞(ILCs))在GEO数据库中进行了测序。20,21的潜在促进剂RORγt基因。有趣的是，我们发现了一个独特的H3K4me2峰RORγt特异定位于Th17细胞，而不位于Th1细胞或ILCs。序列元素，名为RORCE，位于−7 kb和−3.6kb之间，位于RORC基因，并可能作为一个潜在的增强剂在Th17细胞(图1)。1A)。通过比较人Th17细胞与Th0细胞的RRCE同步区染色质特征，发现H3K4me1和H3K27ac等活性增强子相关表观遗传标记也在人Th17细胞中富集。1) (Http://egg2.wustl.edu/roadmap/web_portal/)22。因此，这些芯片-seq数据提示，RORCE可能是一种活性的RORγ增强剂在Th17细胞中。

考虑到普通促进剂的中位尺寸为1.3kb23我们将RORCE细分为三个连续片段，即RORCE 1(−7kb至−5.8kb)、RORCE 2(−5.8kb至−4.6kb)和RORCE 3(−4.6kb至−3.6kb)(附图)。2A)。为了评估我们的预测，我们采用芯片结合定量PCR(chip-qPCR)方法，检测了RRCE 1、RORCE 2和RORCE 3中其他表观增强子H3K4me1、H3K27Ac和H3Ac的表观遗传标记谱，并结合荧光激活细胞分选(FACS)纯化小鼠Th17和非Th17细胞(附图)。2B和3A)。我们的结果表明，在RORCE 1、RORCE 2和RORCE 3中，这些增强子相关的表观遗传标记在Th17细胞的RORCE 2中比在非Th17细胞中更显着地富集(补充图)。2C-e)，提示RORCE 2可能是Th17细胞的活性增强子。

接下来，我们确定RORCE 2是否对RORγt双荧光素酶在EL4小鼠肿瘤T细胞中的启动子--在静息条件下构成性表达rorγt和IL-17A24人胚胎肾(HEK)293 T细胞株25,26。六种潜在的调控元件，包括RORCE 1、RORCE 2、RORCE 3及其组合，都是在RORγtPGL3载体中的启动子(图1.1B)27。结果表明，与其它结构相比，仅含RORCE 2的结构能提高大鼠肝细胞的转录活性。RORγtEL4和293 T细胞中启动子的2~3倍(图1)。1C和d)。我们进一步检测了这些结构在Th17极化细胞中的荧光素酶活性。结果表明，所有含有RORCE 2的载体均能提高荧光素酶活性。1E)。当将这六个片段克隆到报告载体中荧光素酶基因的下游时，它们在Th17极化细胞中也表现出类似的活性。1F)。这些结果表明，RORCE 2可能是一种候选增强剂。RORγt基因与位置无关。所有这些体外实验结果表明，RORCE 2是一种有效的增强因子。RORγt在Th17细胞中启动子可能参与Th17的分化和功能。

RORCE 2是通过上调来正确分化Th17细胞所必需的。RORγt基因表达

RORCE 2对RCE 2的调节作用RORγt基因表达和Th17在体内分化，我们产生了RORCE 2缺陷(RORCE 2)。−/−)小鼠CRISPR/Cas9基因组编辑(C57BL/6系，北京生物细胞有限公司)(无花果)2A)。为了排除crispr-ca 9引起的离靶的可能性，我们在rorce 2中检测到上游/下游sgRNAs的前10位潜在目标。−/−小鼠发现没有任何缺失或突变(补充图)。4和表1)。我们发现rorγt在脾脏CD4中的mRNA和蛋白表达水平采用逆转录-qPCR(rt-qrr)方法检测。+T细胞与脾脏CD4平均荧光强度(MFI)的评价+RORγt+在RORCE 2中，Th17细胞减少了约75%和50%。−/−小鼠与野生型(WT)小鼠的比较(图)。2B-d和补充图。3B)。随着RORγt表达的降低，CD4的频率降低。+RORγt+脾脏CD4中Th17细胞减少约50%。+RORCE 2的T细胞−/−老鼠(图1.2C和d)。因为rorγt是诱导Th17细胞IL-17A转录的必要条件。11，我们发现RORCE 2缺乏导致白细胞介素-17a的表达和CD4的频率显著下降。+伊-17A+脾脏CD4中的Th17细胞+T细胞(图1.2e-g和补充图。3B)。在小鼠小肠固有层(LP)观察到类似的结果(图)。2H-n和补充图。3C)。然而，我们没有发现t1标志基因的mrna表达有任何变化。T盒转录因子21 (Tbx 21)或Th2标志基因Gata结合蛋白3 (GATA 3)RORCE 2基因敲除后或脾脏CD4的Th1和Th2细胞频率+T细胞(附图)5和3B)。此外，考虑到IL 3和Th17细胞的相似性，如RORγt在两种细胞中的特异性表达和关键作用，我们还检测了RORCE 2对IL 3细胞的影响。与Th17细胞相比，其相对mRNA表达水平RORγt在RORCE 2的LP中，ILC 3细胞频率不变。−/−小鼠与WT小鼠比较(图1)。奥Q和补充图。三维空间)。提示RORCE 2在体内可能有利于T细胞向Th17细胞分化。

为了进一步阐明RORCE 2在Th17细胞分化中的作用，我们对RORCE 2进行了极化。−/−或WT CD4+T细胞转化为Th17细胞。CD4频率+RORγt+Th17细胞或CD4+伊-17A+RORCE 2产生的Th17细胞−/−T细胞与CD4中RORγt的MFI+RORγt+Th17细胞明显低于WT T细胞相同参数的值(图1)。3A-E和补充图。3E)，这与培养的RORCE 2中降低的IL-17A的产生是一致的。−/−T细胞(图1.3F)。此外，mRNA的表达RORγt或伊-17A在RORCE 2中被显著下调−/−T细胞在Th17-极化条件下。3g-h)。然而，RORCE 2缺乏对Th1或Th2细胞体外分化没有影响，包括细胞频率、关键标志基因mRNA的表达。Tbx 21在Th1细胞或GATA 3Th2细胞)和细胞因子分泌(干扰素γ(IFNγ)在Th1细胞或IL-4在Th2细胞)(如图所示。3i-p和补充图。3E)在各自的极化条件下。综上所述，这些结果表明RORCE 2对Th17细胞的体外分化具有积极的调节作用。RORγt基因。

RORCE 2缺乏导致EAE严重程度降低

接下来，我们通过免疫10到12周龄的RORCE 2来确定RORCE 2的缺乏是否影响Th17依赖的炎症性疾病EAE的发展。−/−小鼠髓鞘少突胶质糖蛋白33-35肽(完全弗氏佐剂乳化)和百日咳毒素。28。RORCE 2缺乏的小鼠的疾病进展明显少于它们的WT小白蚁(如图所示)。4A)。组织学分析显示，RORCE 2缺乏的小鼠脊髓炎症细胞浸润和脱髓鞘程度明显减轻(图二)。4B)。从病鼠脊髓分离的T细胞的流式细胞仪分析进一步证实了细胞浸润的减少。4C-E和补充图。3F)。CD4总绝对数+T细胞和CD4+伊-17A+Th17细胞与CD4的频率+伊-17A+与WT小鼠相比，RORCE 2缺乏的小鼠脊髓中Th17细胞明显减少(图二)。4C)，反映了RORCE 2缺乏的小鼠疾病严重程度的降低。然而，CD4的百分比+干扰素γ+Th1和CD4+伊-4+RORCE 2脊髓中的Th2细胞−/−小鼠可与WT小鼠脊髓中的小鼠相媲美(图1)。4D和e)。进一步证实RORCE 2降低的疾病严重程度−/−小鼠是Th17相关的，我们免疫了RORCE 2。−/−第8天提取引流淋巴结，体外培养3天后，取淋巴结分离细胞进行体外培养。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IL-17A、IFN-γ和IL-4的浓度。我们发现在rorce 2中，IL-17a的产量下降了。−/−小鼠，而干扰素γ和IL-4的产生没有受到影响(图)。4F)。这些数据进一步证实了RORCE 2在Th17细胞的产生和IL-17的产生中的意义。

在RORCE 2和RORγtTh17细胞中的启动子

众所周知，增强子的调节活性主要取决于增强子与目标启动子之间形成染色质环。17，我们采用染色体构象捕获-qPCR(3C-qPCR)方法。29以确定RORCE 2是否与RORγtTh17细胞启动子。RORCE区的酶切图谱分析及文献检索29因此，我们选择NlaIII限制性内切酶进行3C-qPCR分析，以便对这一短序列区域进行高分辨率分析。此外，我们在RORγt启动子作为锚点(AS)来测试空间邻近性，其它NlaIII位点分布在RORCE区域(测试站点(TSS)1至8)，如图所示。5A)。用qPCR定量测定AS与TS位点的相对相互作用频率。我们选择小鼠T细胞株EL4进行3C-qPCR检测，因为RORγt的表达在静息条件下是构成性的，并且在激活时被上调(附图)。6A和b)。B16是一株未表达RORγt的黑色素瘤细胞株，作为阴性对照(补充图)。6A和b)。结果表明，在PMA/离子束霉素(PI)模拟的EL4细胞和未受刺激的EL4细胞中，AS与位于RORCE 2区的TS 3相互作用最频繁。5B)。然而，在B16细胞中AS与TS位点之间没有相互作用。5B)。类似的比较(FACS-纯化的Th17细胞与非Th17细胞或Th17极化细胞与幼稚细胞的比较)观察到类似的结果；如图所示。5C和d)。此外，我们没有观察到任何环形成的Th1或Th2极化或天真的T细胞从WT小鼠(图一)。5E和F)。这些结果强烈表明，RORCE 2区域与RORγtTh17细胞的基因启动子

因为在增强子和目标启动子之间形成染色质环需要tfs。17接下来，我们将研究哪些TF(S)参与了RORCE 2中的TS3与AS之间的相互作用。RORγtTh17细胞的基因启动子为此，Jaspar数据库(Http://jaspar.genereg.net)用于对所有可能绑定到RORCE的TFs进行排序(如图所示)。6A)。在所有的候选人中，索克斯-5是排名第一的候选人，因为它的绑定得分最高(如图所示)。6A)以及离TS3最近的位置(如图所示)。6B)。支持这一观点的Sox-5也参与了Th17细胞的分化。RORγt启动子30.

首先，表达SOX 5在PI刺激的EL4细胞和Th17极化细胞中证实(附图)。7)。使用芯片-qpcr，我们发现sox-5同时绑定到rorce和RORγtPI刺激的EL4细胞或WT Th17极化细胞的启动子与B16细胞或单纯CD4细胞的比较+分别为T细胞。6C和d)。此外，芯片3C分析(也称为芯片环分析)表明sox-5参与了ts3和ts3之间形成染色质环的过程。RORγtPI刺激的EL4细胞和Th17极化细胞的启动子。6E和F)。这种SOx-5介导的环不存在于Th1-或Th2-极化细胞中(如图所示)。6g和h).

为了进一步研究sox-5在体内染色质循环中的作用，我们产生了sox-5-bs缺陷(sox-5-bs)。−/−)小鼠经CRISPR/Cas9-介导的基因组编辑(C57BL/6系)。6I)。我们发现SOX-5-BS缺乏RORCE导致SOX-5富集显著减少(图1).6J)。有趣的是，3C-qPCR和芯片环检测表明TS3-的程度-RORγt通过删除启动子区域中的SOX-5-BS，启动子之间的相互作用也显著减少(如图所示)。6k和l)，确认RORCE 2与RORγt该基因主要由Sox-5介导。

Sox-5-bs缺失显著降低Th17细胞的分化

以更好地理解sox-5介导的ts3与RORγt启动子对RORγt表达和Th17分化的调节作用，我们进一步研究了SOX-5-BS消融对Th17细胞的影响。总体表型与RORCE 2缺乏的表型相似。在脾脏中，SOX-5-BS-缺陷小鼠的ROR、γ、t和IL-17A的mRNA和蛋白水平与WT小鼠相比下降了约60%(见图)。7A-c和补充图。3B)。脾CD4中抗CD4和抗rorγt或抗IL-17A抗体染色的Th17细胞百分比也显著降低。+T细胞(图1.7b和d和补充图。3B)。在小鼠小肠的LP中也观察到了类似的结果(见图)。7e-h和补充图。3C)。SOx-5-BS缺乏导致CD4的频率显著降低。+RORγt+Th17或CD4+伊-17A+Th17细胞在Th17-极化条件下(图1)。8A-c和补充图。3E)。此外，与WT Th17细胞相比，SOx-5-BS敲除的Th17细胞RORγt和IL-17A的mRNA和蛋白表达降低(图1)。8A、d和e)和白细胞介素-17A分泌减少(见图)。8F). SOX 5ROR、γ、t和IL-17A在WT Th17极化细胞中的表达明显增高(图1)。8g)。此外，我们还观察到rorγt和IL-17a在rr 2极化细胞中的表达略有增加。−/−和SOX-5-BS−/−小鼠后SOX 5过度表达(图1.8g)，表明sox-5可能在Th17细胞中有其他靶点。30.

SOx-5-BS缺乏症减轻了EAE的严重程度。

我们进一步研究了SOX-5-BS缺乏是否影响EAE的严重程度.结果表明，SOX-5-BS缺乏症可导致RORCE 2缺乏，包括疾病进展、细胞浸润和脊髓脱髓鞘明显减少。9A和b)。CD4频率+伊-17A+Th17细胞与CD4的绝对数+T细胞和CD4+伊-17A+与WT小鼠相比，Sox-5-BS缺陷小鼠脊髓中Th17细胞明显减少(图1)。9C-e和补充图。3F)。这些数据强烈表明SOX-5-BS缺乏的小鼠EAE严重程度减轻.

SOx-5和STAT 3协同激活Th17细胞的RORCE 2

由于sox-5不包含反活化结构域，它的活性很可能是由其他分子介导的。30。有趣的是，我们发现了STAT 3(STAT 3-BS)的一个DNA结合位点，这是一种著名的转录激活因子，靠近Sox-5-BS(图1)。10A)。STAT 3在RORγt表达和Th17分化中的关键作用31,32,33我们研究了STAT 3对RORCE 2增强子功能的贡献。芯片-qPCR结果表明，在PI刺激的EL4细胞和Th17极化细胞中，STAT 3与RORCE 2的相互作用比在b16细胞和天真的CD4细胞中更强。+分别为T细胞。10b和c)。此外，STAT 3RT-qPCR和/或酶联免疫吸附试验(ELISA)证明，过表达使WT Th17极化细胞中的ROR、γ、t和IL-17A表达增加，STAT 3-RORCE 2相互作用增强。10d)；因此，STAT 3击倒导致了相反的结果(如图所示)。10d)。然而，由于Th17极化细胞中SOX-5-BS缺乏症，这种结合被严重破坏，说明STAT 3与RORCE 2的结合需要SOX-5(图2)。10C)。当RORCE 2缺少STAT 3-BS时，RORγt在pGL 3载体中，RORCE 2在EL4细胞中的转录活性低于正常人RORCE 2。10E)。此外，免疫共沉淀(Co-IP)实验显示STAT 3与SOX-5(图5)相互作用.10F和g)，暗示SOX-5可能会影响STAT 3对RORCE 2的招募。

在这项研究中，我们发现了一种新的增强剂RORCE 2。RORγtTh17细胞在体内和体外的基因表达。进一步的研究表明，RORCE 2与RORγt基因启动子是由SOX-5结合介导的.在RORCE中敲除SOx-5的BS可明显降低RORγt的表达和Th17的分化，从而降低ROR的严重程度。最后，我们证明STAT 3与SOX-5协同参与RORCE 2介导的基因激活。

最近的一项研究发现，在~1.5kb的上游有一种增强子。RORγt人Th17细胞启动子的研究34。然而，本研究没有研究这种增强剂对体内Th17分化或炎症性疾病的影响。在本研究中，我们发现了一种新的增强子，其上游为5.8-4.6kb。RORC基因在小鼠Th17细胞中的表达。更重要的是，我们证实了该增强剂在RORγt表达、Th17分化和促EAE疾病中的重要作用。因此，它是第一个RORγt增强子通过特定的增强子序列-敲除法鉴定。此外，我们还发现RORCE 2是一个活动的RORγtTh1、Th2和ILC 3细胞谱系不受RORCE 2基因敲除的影响。尽管rorγt也是IL 3细胞系中的关键TF，但这些细胞在RORCE 2区的富集程度远低于Th17细胞。20。我们推测，除RORCE 2外，还有一种增强剂可促进IL 3细胞中RORγt的表达。

众所周知，活性增强子通过与相应的目标启动子相互作用来调节基因的表达。17。在本研究中，我们建立了RORCE 2与RORγt启动子采用3C-qPCR。此外，tfs还促进了活性增强子和启动子之间的循环。17。Tfs与增强子的结合是形成环的第一步，它会激发其他的辅助因子来进一步调解启动子和增强子之间的相互作用。14。我们的研究发现了一种重要的TF(即SOX-5)，它通过生物信息学预测和多次实验验证，参与了Th17细胞与RORCE 2的这种相互作用。以往研究某些tfs在增强子-启动子循环中的作用主要依赖于敲除或敲除tf基因。35,36,37,38。与已发表的文献相比，在本研究中，我们使用CRISPR-Cas9策略来观察sox-5在rorce 2和rore 2之间的循环中所起的作用，从而剔除了rorce中的sox-5-bs。RORγt启动子。这项研究提供了直接证据，证实TF结合在增强子区域的作用，因为在细胞中敲除TF可能会因TF的多个靶点而对细胞生物学产生意想不到的影响。39.

STAT 3是Th17分化的关键31,32,33。此外，sox-5本身不包含反激活或跨抑制域。30,40因此，SOx-5的活性很可能是由SOx-5相互作用的伙伴分子介导的。因此，我们研究了SOX-5和STAT 3之间是否有关联。在本研究中，我们发现RORCE 2中SOX-5-BS的上游有一个STAT3-BS。STAT 3强烈约束STAT 3-BS促进RORγt转录是因为这种STAT3-BS的缺失严重下调了转录活性.有趣的是，当SOX-5-BS被删除时，STAT 3未能与RORCE 2结合，这表明SOX-5与RORCE 2的结合是STAT 3与RORCE 2结合并发挥其TF功能的先决条件。因此，STAT 3可能参与RORCE 2的激活，作为SOX-5的辅助因子。然而，SOX-5对STAT 3活性的影响还有待进一步阐明。除了sox-5和stat 3之外，其他tfs也可能参与rorce 2的活性；例如，crb 1，它通过促进Th17的分化而在自身免疫中发挥关键作用。28，是Jaspar在本研究中预测的与RORCE 2结合的最高潜在TF。

此外，我们观察到rorce 2或sox-5与rorce 2的结合不仅可以调节RORγt基因在转录水平上也影响Th17依赖性炎症性疾病EAE的发展。这一开创性的研究证明了该增强剂在EAE中的关键作用，提高了顺式调节元件在疾病发病机制中的意义。然而，还有其他几种与Th17相关的疾病，包括系统性红斑狼疮、胶原诱导性关节炎和结肠炎。41。在小鼠模型和人类细胞中，RORCE 2是否在这类Th17相关疾病中发挥重要作用仍有待阐明。

总之，我们发现RORCE 2是RORγt基因在体外培养小鼠Th17细胞中的作用和在体内。SOx-5在RORCE 2和RORγt基因启动子促进Th17分化及EAE发病机制。此外，SOX-5是STAT 3与RORCE 2结合并发挥TF功能的先决条件。因此，我们提出了RORCE 2介导的调节Th17细胞中RORγt表达的机制，并将先前的研究结果与我们的结果相结合，如附图所示。8。极化细胞因子IL-6的信号转导激活诱导Th17细胞中SOx-5所需的STAT 3。30...SOx-5绑定到RORCE，并中介RORCE的循环到RORγt启动子，促进活化的STAT 3与RORCE 2的结合，促进RORγt的表达，促进Th17细胞的分化，这可能是通过其他反式作用因子和EAE进展过程发生的。本研究不仅为Th17分化提供了新的机制，而且也为今后干预Th17相关疾病提供了潜在线索。