用支气管肺泡灌洗的天然免疫和适应性免疫单细胞谱鉴别临界新冠肺炎

如何先天和适应性宿主免疫系统误传恶化新冠肺炎的免疫病理尚未完全阐明。本文对5例轻度支气管肺泡灌洗(BAL)和26例临界新冠肺炎的支气管肺泡灌洗(BAL)标本进行了单细胞深免疫分析，并与正常肺组织和非急性肺炎支气管肺泡灌洗(BAL)标本进行了比较。我们用假时间推断来建立T细胞和单核-巨噬细胞的轨迹，并模拟基因表达沿它们的变化。在温和的新冠肺炎，CD8+驻留内存(T)_雷姆)和CD4+T-帮手-17(T_H17)细胞在轨道末端会经历活跃的(可能是抗原驱动的)扩张，并且具有良好的效应功能，而在关键的新冠肺炎中，它们仍然更天真。反之亦然，CD4+具有T辅助功能的T细胞(T细胞)_H1)和CD8+表达耗竭标记的T细胞_前--就像)在温和的新冠肺炎中，它们的轨迹被浓缩到一半，在那里，它们也表现出良好的效应功能，而在临界状态下，它们在运动轨迹的末尾显示出炎症相关压力的证据。单核细胞到巨噬细胞的轨迹显示慢性炎症单核细胞在临界新冠肺炎中富集，而肺泡巨噬细胞(以抗炎和抗原提呈特征为特征)则被耗尽。在关键的新冠肺炎中，单核细胞参与ATP-嘌呤能信号--炎症--脚印，这可能会导致急性胰腺炎相关的纤维化并加重疾病的严重程度。最后，病毒RNA跟踪显示感染的肺上皮细胞，以及相当大比例的中性粒细胞和巨噬细胞参与病毒清除。

SARS-CoV-2已迅速席卷全球，影响超过3300万人，死亡病例超过100万.1现在人们充分认识到，虽然大多数新冠肺炎患者(80%)仍无症状或仅出现轻微症状，但20%的患者出现明显肺炎；其中约四分之一进展为危及生命的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和严重或不典型的全身炎症。2发热、急性期反应物增多、淋巴细胞计数减少、髓样炎症明显、中性粒细胞/淋巴细胞比率升高是新冠肺炎的主要免疫学标志。3,4

温等人首次根据单细胞RNA序列(scRNA-seq)提供了10例新冠肺炎患者循环单个核细胞的免疫图谱。淋巴细胞数量在全球范围内减少，而炎症性髓系细胞(主要是分泌IL 1β的经典单核细胞)更为丰富，这表明新冠肺炎的免疫病理是一个由髓细胞驱动的过程。5同时，至少有8项研究使用scRNA-seq来表征对sars-cov-2的外周适应性免疫反应，6,7,8,9,10,11,12,13不断证实经典单核细胞在关键新冠肺炎中的富集。6,7,8,9,10,11此外，一些研究报告称，功能失调的中性粒细胞增多，特别是在危重疾病中。6,7,8,9关于干扰素(IFN)信号的情况不太清楚，有几项研究认为干扰素信号减少是危重疾病的一个显著特征，7,8,9与其他研究报告的夸大干扰素驱动的炎症在临界和轻度新冠肺炎相比。10,11

然而，新冠肺炎的外周免疫景观可能不那么全面，因为周围的免疫特性与肺内的免疫特性不同，无论是在幅度和质量上，还是在免疫应答的持续时间上。因此，需要更好地理解新冠肺炎肺中的免疫相互作用。在他们的开创性论文中，廖等人。应用单细胞T细胞受体序列测定(scTCR-seq)和scRNA-seq对3例轻度和6例严重新冠肺炎患者及3例健康对照者的BAL进行检测.他们在新冠肺炎中观察到大量的炎症单核细胞、中性粒细胞和T细胞耗竭。在温和的新冠肺炎中，人们观察到对sars-cov-2有更强的适应性免疫反应，CD8的存在就证明了这一点。+具有组织驻留特征的T细胞具有克隆性扩张和增强效应功能。14随后，Bost等人。监测病毒序列在单细胞水平读取，以分离感染与旁观者细胞，并调查病毒诱导的转录变化。结果表明，SARS-CoV-2的主要靶点是上皮细胞，巨噬细胞中也有病毒RNA。15然而，尚不清楚这是否代表病毒直接感染髓系细胞，或吞噬病毒颗粒(或病毒感染的细胞)。最后，Chua等人。对19例新冠肺炎患者的上下呼吸道标本进行了scRNA-seq，支持平衡细胞毒性T细胞信号(表达穿孔素、颗粒酶、干扰素)的观点，等)定义了对SARS-CoV-2的有效免疫反应.16总之，尽管关于新冠肺炎肺炎的scrna-seq已经为重要的假设生成数据集做出了贡献，但是对于轻微和关键的弧菌的免疫机制的深入描述仍然很大程度上还没有被探索，主要是由于分析了小样本的数量。此外，到目前为止的分析还没有包括相关对照组的BAL样本，例如非新冠肺炎肺炎病例。

在此，我们提供了新冠肺炎肺炎的全面的深层免疫图谱，分析了31例轻度或危重疾病患者的BAL，同时纳入13例非肺炎患者，使我们能够可靠地区分非特异性肺部局限性炎症信号和特异性肺相关免疫改变。

BAL标本的ScRNA-seq和细胞分型

我们在22例住院患者的鼻咽拭子或下呼吸道标本上对SARS-CoV-2阳性的患者进行了scRNA-seq检测。我们还收集了13例临床疑似新冠肺炎肺炎患者的BAL，而下呼吸道标本SARS-CoV-2的PCR阴性。这些样品称为非新冠肺炎，包括细菌和[医]鸡肺细胞炎肺炎病例。我们在取样时根据疾病的严重程度对患者进行了进一步分层，方法是区分两组：“轻度”和“危重的”疾病组，后者需要高流量氧疗、机械通气或体外膜氧合。“补充资料表”概述了前瞻性招募的患者组的人口和临床数据，包括共同病征和计算机断层扫描来量化肺损伤。沙一.

Bal样品立即进行scRNA-seq处理。经过质量筛选(材料和方法)，我们从65,166个细胞中获得了1.86亿份独特的转录本，检测到的基因超过150个。其中~51%的细胞来自新冠肺炎。随后的分析涉及维数约简和聚类，确定了几个聚类(图1)。1A)，通过标记基因(补充信息，图1。斯1A-c)可以被分配给淋巴样细胞(CD4)。+和CD8+T细胞、自然杀伤细胞(NK)、B细胞和浆细胞、髓样细胞(单核/巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、浆细胞样树突状细胞/pDC和常规树突状细胞/CDCs)和上皮细胞(包括分泌细胞、基底细胞、纤毛细胞、鳞状细胞、炎症细胞和AT2肺上皮细胞)。我们更详细地描述每种单元格类型，突出显示在补充信息表中检测到的单元格数、读取数和转录本。S2。在疾病状态(新冠肺炎与非AIDS)、疾病严重程度(轻度与危重)或个别患者(图1)之间没有聚类偏差。1B；补充资料，图1。斯1C).

为了提高分辨率，我们处理了廖等人在新冠肺炎BAL上的scRNA-seq数据，包括3名“轻度”患者和6名“危重”患者(n=51 631个单元)(补充资料，图1。斯1D).14我们还获得了7个正常肺样本(n=64,876个细胞)，由Lambrechts等人描述。8例正常肺标本(n=27 266细胞)，由Reyfman等人提出。以进一步提高我们的决议(特别是针对T细胞和DC)。17,18通过从每个数据集中分别对单元格进行聚类并为每个单元分配单元类型标识来集成数据集。然后，我们根据单元类型标识从每个数据集中单元，并执行典型相关分析(CCA)，如前所述，19然后进行基于图形的聚类，生成每个细胞类型的umap，显示其表型异质性.使用单独的聚类策略(请参阅材料和方法)，我们发现超过93%的细胞聚类相似，表明聚类方法的机器人性(补充信息，图1)。斯1E-g)。值得注意的是，由于中性粒细胞在新冠肺炎中很重要，但RNA含量很低，因此在scRNA-seq数据中经常被忽略，因此我们降低了过滤阈值，去除表达着<151个基因(而不是<201基因)的细胞。这导致检测到的中性粒细胞数量相对增加(补充信息，图1)。斯氢).

整合后，分别从5例轻度和26例新冠肺炎危重患者中提取数据，并与10例轻度和3例非急性急性胰腺炎患者进行比较。在数量上，单核/巨噬细胞和中性粒细胞是最丰富的细胞类型，占65.7%。n新冠肺炎细胞数=55,825。1C)。在评估这些细胞类型的相对富集或耗竭时，我们发现新冠肺炎患者中单核细胞和中性粒细胞的频率更高，尤其是在危重患者中(图1)。1C；补充资料，图1。斯1I)。另一方面，新冠肺炎中巨噬细胞和上皮细胞数量较少，尤其是危重患者。CD8+T细胞和NK细胞轻度富集，以轻度疾病为主.当比较轻微和临界新冠肺炎时，CD8增加。+T细胞，巨噬细胞和CDCs在前者中被发现(如图所示)。1D)。这些变化很大程度上是维持时，比较轻微和临界新冠肺炎分别对两个队列(廖等人)。14与本研究相比，补充资料，表S3).

下面，我们更详细地描述每种单元类型的异质性。用于识别每个细胞表型的标记基因列表在补充信息表中突出显示。S4.

CD8的表型异质性+新冠肺炎中的T细胞

我们共检索到23,468个T-细胞和NK-细胞，这些细胞被分成14种表型。2A-C；补充资料，图1。斯2A-C)。为了避免增殖的T细胞分别聚集，我们在这一分析中对细胞周期基因进行了回归(见材料和方法)。总的来说，我们确认了7位CD8。+T细胞簇，5 CD4+T细胞群和2个NK细胞簇。而天真的CD8+T细胞(T细胞)_N)表达天真的T细胞标记(CCR 7, LEF 1和Tcf7)，效应器-记忆(T)_埃姆; GZMK, GZMH, GZMM)和疲劳样T细胞(T细胞)_前)的特征是效应标记(GZMA, GNLY, GZMB, IFNG)。在这里，表达(炎症驱动的)衰竭-定义免疫检查点(HAVCR 2, CTLA 4, LAG 3)杰出的T_前-牢房。此外，我们还鉴定了CD8。+驻留记忆T细胞(T)_雷姆)基于ZNF 683和ITGAE，以及CD8+最近激活的效应记忆T细胞(T细胞)_埃姆拉; CX3CR1, FGFBP 2, FCGR3A)。最后，我们还确定了粘膜相关不变量(T)。_MAIT; SLC4A10, PRSS 35, CCR 6)和伽马三角洲(T)_γδ; TRDC, TRGC 2和TRG-AS1)T细胞。

其次，我们评估了新冠肺炎与非淋病患者T细胞表型的患病率，但未观察到CD8的差异。+表型(图1.二维空间；补充资料，图1。斯二维空间)。当比较轻微和临界新冠肺炎时(如图所示)。2E)，我们找到了T_MAIT-前者的细胞略有增加。有趣的是，T_MAIT-细胞可以积极配合特定的先天免疫特性(例如，熟练的模式识别受体信号传递和/或广泛的非mhc抗原监测)，从而使它们能够对具有病原体相关分子模式(Parmp)的病原体作出快速反应。20

不过，轻微的新冠肺炎和临界新冠肺炎的增幅最大的是CD8。+ T_雷姆-牢房。为了理解这种差异，我们使用Slingshot来推断伪时间轨迹(不包括T)。_MAIT-和T_γδ-牢房)。我们观察了三种不同的轨迹(图)。3A)：CD8+ T_N-与T连接的细胞_埃姆-细胞，随后分支成3种不同的(连接良好的)谱系，即T。_雷姆-细胞，T_前-细胞和T_埃姆拉-细胞，几乎所有CD8+ T_N-细胞(99.6%)为所有三种轨迹所共有(补充资料，图1)。斯2E)。标记基因的图谱、抑制点、细胞毒性标记以及沿着这些轨迹的增殖证实了它们的功能注释。3B，c)。值得注意的是，除了增加抑制性检查点和细胞毒性标记物的表达，CD8+ T_前-细胞以增殖为特征(补充资料，图)。斯2F随着G2M和S基因评分沿轨迹逐渐增加(如图所示)。3B，c)。接下来，沿着这些轨迹绘制了反映T细胞在每种表型状态中的相对数量的密度图(图1)。三维空间)，并分层为正常组织，非新冠肺炎，和温和或临界区。非新冠肺炎T细胞在T末端富集。_雷姆-血统，而在新冠肺炎的情况下，这是T_前-血统(图)3E)。相反，在T的末尾_埃姆拉-正常肺的谱系细胞富集。当比较轻微和临界新冠肺炎时，T细胞_雷姆-谱系在淡淡新冠肺炎的末尾富集，而沿T_前-这种浓缩在关键的新冠肺炎中最为突出(图中所示)。3F)。T值无明显差异_埃姆拉-世系

我们还用scTCR-seq对T-细胞进行了处理，得到了具有tcr序列的3966个T细胞，该序列也被scrna-seq注释(不包括NK-，T)。_MAIT-和T_γδ-牢房)。在TCR共享的基础上，我们可以加强Slingshot所确定的3条轨迹(图1)。第三代)。总体来看，CD8+ T_雷姆-细胞含有最多的T细胞克隆型。绘制TCR沿轨迹的丰富度和均匀度，表明这两个参数沿T减小。_雷姆-血统，特别是新冠肺炎(见图)。3H)，可能是抗原驱动的克隆扩张。值得注意的是，这种扩张在温和的新冠肺炎中更为突出(见图)。3I)。相反，在T_埃姆拉-和T_前-血统、财富没有沿假时间减少。

总的来说，这表明温和的新冠肺炎是以T为特征的。_雷姆-细胞在轨道末端进行活性(可能是抗原驱动的)TCR的扩展和选择，而T_前-细胞在轨道的一半处富集。在临界新冠肺炎里，都是T_雷姆-和T_前-细胞无法扩大，尽管后者主要位于世系末段。

CD8基因表达模型+ T_雷姆-和T_前-世系

然后，我们模拟了T基因的表达。_雷姆-和T_前-谱系，并在每条轨迹中识别出5个具有特定表达模式的基因集。在T_雷姆-血统，第1组和第2组由天真的T细胞标记组成(第1组：CCR 7, LEF 1，Tcf 7；第2组：卖)，其表达沿轨迹下降(如图所示)。3J补充资料，表S5)。第三组为IFN诱导的(抗病毒)基因。IFI 6, IFI44L, ISG 15, 二十国集团, MX2)，激活相关基因(CD 38)和介导效应记忆功能的基因(GZMK，CD 44，KLRG 1)。这些基因在轨迹的一半处表现出高表达。最后2组基因在弹道结束时表达，由细胞毒性或增强效应功能基因组成(第4组：GZMA，GZMB，FASLG，CXCR 3，CCL 5)、促炎和自我调节基因(第5组：ITGA 1, 肿瘤坏死因子, XCL 2，CD7和LGALS 3, SLAMF 1, S100A4)和标记常住记忆形成的基因(ZNF 683，ITGAE).21,22温和新冠肺炎，T_雷姆-细胞主要表达Set 3-5基因，表明效应功能增强(但平衡)(补充信息，图).斯2G，h)，而在关键的新冠肺炎T_雷姆-细胞表达1~2组基因，表明细胞处于一种更天真的状态.事实上，轻微新冠肺炎患者的“常住记忆”效应评分显著高于对照组(P=0.016)，但较低的幼稚T细胞分数(P=0.049，与临界新冠肺炎相比(补充信息，图1)。斯2I).

在T_前-世系，第一组基因包含天真的T细胞标记(LEF 1, CCR 7, Tcf7)，第二个IFN诱导的(抗病毒)基因(MX1, MX2，ISG 15, IFI 44, IFIT 5, IFI 6)，另外三分之一IFNG和IFN诱导的基因(IFI 27, IFI27L2)由T细胞活化相关基因(CD 38, GZMH, GZMA)、趋化因子(CCL 3, CCl 4和CCL 5)，细胞毒性-(NKG 7, GNLY, GZMB)和(炎症)衰竭相关基因(HAVCR 2)(图1.3K补充资料，表S6)。SET 4的特点是促炎(CD 70, COTL, HMGB 1)和抗炎基因(ENTPD 1, ANXA 5, SerpinB 1)，提示这些细胞表现为慢性调节失调的炎症表型。我们还注意到Tim自动调节蛋白家族的表达(TIMD 4)和病毒感染诱导的自动调节基因(LGALS 1, LGALS 3).23,24在第5组中，细胞周期基因(Cdk 1, 尖刀, PCNA, CCNA/B2)、应激相关基因(HSPD 1, HSP 90AA1, BIRC 5)和染色质重塑相关基因(HMGB 2, HMGB 3, EZH 2)增加，表明T细胞在很大程度上适应了由炎症引起的压力(而不是增加任何明显的效应或自动调节反应)。值得注意的是，温和的新冠肺炎T_前-细胞显示SET 2相关基因表达增加，而临界新冠肺炎T表达增强。_前-细胞增强了SET 4-5基因的表达(补充信息，图).斯2J).

总的来说，沿着轨迹的基因表达谱证实了轻微的新冠肺炎显示出CD8。+ T_雷姆-和T_前-细胞具有良好的效应功能，而在临界新冠肺炎中，这种效应功能可能由于持续的炎症相关压力而急剧减少。

CD4表型异质性+新冠肺炎中的T细胞

我们发现了天真的CD4+T细胞(T细胞)_N; CCR 7, Tcf7, LEF 1)，效应记忆T细胞(T细胞)_埃姆; GZMH, GZMK, ANXA 1)，CD4+T-助手-1-类(T)_H1-样)细胞，表达T_H1-类转录因子(Tbx 21, RUNX 3)，免疫检查点(HAVCR 2, LAG 3, PDCD 1和CTLA 4)和细胞毒性基因(NKG 7, GZMB, GNLY, PRF 1)，以及CD4+T-帮手-17(T_H17; RORC, IL17A/F, CCR 6, IL23R)和CD4+调节性T细胞_雷格; Foxp 3, IL2RA, IKZF 2)(图1.2C；补充资料，图1。斯2B)。与非新冠肺炎相比，我们观察到的CD4略少一些。+T_H17-细胞，但更多的T_H1-就像新冠肺炎里的牢房。比较轻微和临界新冠肺炎，我们发现T_H1-在后一种情况下，样细胞显著增加(如图所示)。2D，e).

CD4+ T_雷格-细胞可进一步细分为两种表型(TNFRSF 9高和TNFRSF 9低层；补充资料，图1。斯2K，l)，但由于其复杂而独特的发展过程，25我们把他们排除在后来的弹道分析之外。弹弓显示了额外的表型异质性，同时也识别了中央记忆中的CD4。+ T_厘米-细胞和干细胞样记忆CD4+ T_{供应链管理}-细胞(如图所示)。4A，b)。总体上，有3个轨迹，这是独立确定的基础上，共有TCR克隆型(图一)。4C)。简单地说，T_N-与T紧密相连的细胞_厘米-细胞后面跟着T_埃姆-细胞，分裂成3种不同的轨迹形成T。_H1-就像T_H17-和T_{供应链管理}-单元(补充资料，图1)。斯2M)。标记基因的图谱，抑制点，细胞毒性和转录因子沿着这些轨迹证实了他们的功能注释(图一)。4D)。如前所述，26CD4+ T_H1-样细胞的特征是增殖增加，以及细胞毒性和抑制性检查点的表达，沿着他们的轨迹(图)。4D，e；补充资料，图1。斯2F)。沿着这些轨迹的密度图显示，新冠肺炎在T细胞的早期和晚期富集。_H1-喜欢-和T_{供应链管理}-轨迹，反之亦然，在非新冠肺炎和正常肺，他们被富集一半这些轨迹(图一)。4F)。在T_H17-弹道，新冠肺炎BAL在弹道的前半部分对T细胞有较强的富集作用。整体而言，CD4+来自轻度新冠肺炎的T细胞表现类似于正常肺或非STAT1BAL(如图所示)。4F-g)。TCR的丰富度和均匀度沿T值降低。_H1--就像新冠肺炎的血统，但不像来自非肯德基的血统(如图所示)。4H)。值得注意的是，这一降幅在关键新冠肺炎中最为突出(图中所示)。4I)。相反，T_H17-细胞和T_{供应链管理}-细胞的特征是，TCR的丰富度只有在其轨迹的最末端才略有减少，表明主要是T。_H1-样细胞被选择用于特定的SARS-CoV-2 PAMPs/抗原.

总体上，温和新冠肺炎的特点是T。_H1-类似的细胞在轨道上纠缠一半，而在关键的新冠肺炎T中。_H17-细胞被卡在轨道的前半部分。

CD4基因表达模型+Th1-和TH17-血统

CD4基因表达差异分析+T细胞轨迹确定了几个基因集。在T_H1-类似轨迹，第一个基因集由天真(LEF 1，Tcf 7)和未区分(CCR 7, S1PR1)T细胞标记物。4J补充资料，表S7)。第二组富集了亲和抗炎标记物(CXCR 4, CXCL 2, ANXA 1, SOCS 2, LTB)，而第三组的特征是(轨迹的一半)是一个类似于效应的T。_H1-基于IFNG、颗粒酶(GZMA, GZMK, GZMB), CXCR 3, PRF 1, NGK 7, CCL 5，以及CTLA 4和HAVCR 2。最后，第四个基因集的特点是高HLA表达，自我调节标记。LGALS 1, CCL 3)，部分激活标记(CXCL 13)和应激反应标记(PDIA 6, HSBP 1, VDAC 3, PARP 1)在弹道的末尾，暗示着一种复杂的促炎和抗炎表型的混合物，再加上早期的应激调节。在最后的第五组中，我们注意到线粒体压力(LDHA, PKM, COX 17，VDAC 1, COX 8A)，一种与白细胞介素2(IL2)有关的应激表型(MT1E, MT1X)、蛋白质毒性应激(PSMB 3/B6/D4/A7/C3, HSPB 11, 公园7, EIF4EBP1)和糖酵解(PGAM 1)在T的末尾暗示‘精疲力竭’_H1就像-轨迹27,28总的来说，在温和的新冠肺炎中，T_H1-相似谱系的特征是SET 2基因表达增加，表明T基因增加。_H1-效应器功能。在临界新冠肺炎中，4-5组基因的表达预先占主导地位，这意味着严重的调控失调(补充信息，图1)。斯2N).

在T_H17-谱系，我们还鉴定了5个基因集(图1)。4K补充资料，表S8)：轨迹早期高表达的前2组没有表达T标记。_H17功能。轨道末端高表达的另外三个基因集的特征是T细胞效应功能(SET 3：PDCD 1, CCL 5, CXCR 2, CCR 2和GZMA/B)，细胞毒活性基因的表达(第4组：NKG 7和PRF 1)和T_H17-细胞相关的白细胞介素(第5组：IL17A, IL17F, IL23R，以及IFNG和CCl 4)。值得注意的是，在轻度新冠肺炎中，细胞的特征是SET 3-5基因的表达增加，而危重患者则表现出SET 1-2基因的表达(补充信息，图1)。斯氧).

总的来说，这表明温和的新冠肺炎的特点是T的改善。_H1-和T_H17-效应器功能。T的综合效应_H1-喜欢-和T_H17众所周知，细胞可以通过增强、平衡和调节彼此的活动和持久性来调节对病毒感染相关炎症的免疫反应。29,30

新冠肺炎BAL单核-巨噬细胞分化的轨迹

在来自BAL的63,114个髓系细胞中，我们鉴定了9种表型。5A)。由于缺乏巨噬细胞标记，单核细胞与巨噬细胞分别聚集在一起(CD 68, 管理系统更新1, MRC 1)和单核细胞标记的存在(IL1RN, FCN 1, LILRA 5)。单核细胞可进一步分为fcn 1。高、IL1B高和HSPA 6高单核细胞(图1.5B；补充资料，图1。斯3A)，分别以经典单核细胞标记(IL1RN, S100A8/9)，促炎细胞因子(IL1B, IL6, CCL 3, CCl 4)和热休克蛋白(HSPA 6, HSPA1A/B)。基于CSF1R，CSF3R和SPP 1，可进一步勾画出3个单核巨噬细胞，包括cdl 2。高，CCL 18高和RGS 1高巨噬细胞(补充信息，图1.斯3B)。CCL 2高簇的特征是亲迁移的细胞因子。CCL 2，但也有几个亲.CCL 7, CXCL 10)和抗炎(CCL 13, CCL 22)基因，表明存在中间群体的细胞。相反，CCL 18高和RGS 1高细胞主要表达抗炎基因(CCL 13, CCL 18, PLD 4，FOLR 2)，以及与受体介导的吞噬有关的基因(MerTK, 阿克塞尔)。最后，我们确定了MT1G。高巨噬细胞(表达大量金属硫蛋白，提示氧化应激或免疫细胞的生长因子退出)，一种单核细胞衍生的(FABP 4)。5~6成熟)和组织驻留(FABP 4)高)肺泡巨噬细胞簇。后两个群体的特征是高表达的常驻标记(FABP 4, PPARG)，抗炎(CCL 18, CCL 22)和抗原提呈相关的MHC-I/II基因。

我们观察到fcn 1显著增加。高和IL1B高新冠肺炎中的单核细胞与非致死性的单核细胞，尤其是在危重疾病中。5C；补充资料，图1。斯3C)。反之亦然，FABP 45~6成熟和FABP 4高新冠肺炎中肺泡巨噬细胞减少，轻症和危重病比较，但无显着性差异(P>0.05).FCN 1高轻度和临界新冠肺炎时单核细胞明显减少，肺泡巨噬细胞增多(图1)。5D)。排除应激诱导表型后(HSPA 6)高单核细胞和MT1G高(巨噬细胞)，我们重建了两个单核细胞到巨噬细胞的谱系。它们由fcn 1的一个共同分支组成。高单核细胞向IL1B转化高单核细胞，其次为CCL 2高和CCL 18高单核巨噬细胞。后者随后分支到RGS 1中。高单核巨噬细胞来源的巨噬细胞(rgs 1-谱系)，或通过fbp 4。5~6成熟加入FABP 4高组织内巨噬细胞(肺泡系；图)。5E)。单核细胞标记表达沿两系下降，而巨噬细胞标记表达增加(见图)。5F；补充资料，图1。斯三维空间)，如以前报告的那样。19,31,32密度图显示，新冠肺炎的细胞在这两个系的前半部分都富集了(见图)。5G)，证实了我们对新冠肺炎中单核细胞富集的上述观察。将轻微新冠肺炎和临界新冠肺炎进行比较，也显示出类似的差异(图一)。5H).

模拟沿肺泡系的基因表达显示5个基因集(图1)。5I补充资料，表中9)。第1组和第2组的特征是炎症标记物(CXCL 1-3, CCL 20, CXCL 8, CXCL 10, CCR 1, IL1B)、生存因素(瑞奇1, JAK 1, ZEB 2, CDKN1A)、IFN诱导的(抗病毒)基因(IFITM 1-3, 1-3, IRF 1, MX1/2)、缺氧(HIF1a)和NF-κB(NFKB 1/2, NFKBIZ)早期发出信号，提示单核细胞表现为炎症状态。第三组基因的特征是一种可能的基于CD 47的巨噬细胞抑制表型，其潜在的目的是调节巨噬细胞的活化(因为CD 47是一个公认的‘不要吃我’的信号，努力避免自身免疫)。33,34此外，基于嘌呤能信号的表达P2RX7)、炎症或IL1-调节因子(NLRP 3, IL1B, IL10RA, CTSL, CALM 1, NFKB 1)，内质网(ER)应激能够促进ATP的分泌(UBC, PSMB 9, SEC61G, ATF 5, ATF 3)，非常规贩运(VAMP 5)，与纤维化有关的因素(FGL 2, TGFβ1, COTL 1)和血管炎症(肿瘤坏死因子, AIF 1, RNF 213, CCL 2, CCL 8)在这些单核细胞中的第2组和第3组中，我们强烈怀疑存在细胞外ATP驱动的嘌呤能-炎症信号；特别是考虑到在急性病毒感染的情况下，细胞外ATP从受损的上皮释放的可能性很大。对BAL上清液的ATP测定证实了这一点，表明临界新冠肺炎的ATP水平比非TAIL高出3倍(P<0.01)。P=0.016；图1。5J)。相似的趋势是比较临界和轻度新冠肺炎患者，但由于样本数量有限，没有达到统计意义(P=0.34)。重要的是，这种ATP驱动的嘌呤-炎症信号通路是一个危险的信号级联，它已经被证明能促进ARDS相关的肺纤维化，因此可能在这种情况下起疾病恶化的作用。35,36,37最后，在轨道末端分别表达了4和5个基因。SET 4的特征是伴侣编码基因(卡鲁, CALR, CanX, PDIA 4，HSP 90B1)，这对于mhc分子抗原加载机制的稳健运作至关重要，而在第5组则有明显的抗原呈递迹象(大量mhcⅡ类基因的表达)。此外，SET 5包含参与受体介导的吞噬和吞噬后脂质降解/代谢的基因：APOE脂代谢清道夫受体马可和管理系统更新1，补体激活(C1QA, C1QB, C1QC和CD 46这也可以促进吞噬)，病毒感染相关的炎症方向(CD 81, CD9)，以及抗炎标记物(PPARG, FABP 4).38,39相似的基因集被观察到RGS 1-谱系(补充信息，图)。斯3E和表S10)，除第5组基因外，该基因组显示参与趋化因子信号脱敏的基因的表达(RGS 1)，吞噬(阿克塞尔)和ATP清除(ENTPD 1).40

总之，这表明，轻度新冠肺炎的特点是功能上的亲吞噬和抗原提呈促进功能的髓系细胞，而临界区的特点是疾病恶化的特点与单核细胞巨噬细胞抑制和ATP-嘌呤能信号-炎症，可能会导致相关的纤维化，并可能恶化患者的预后。

新冠肺炎T细胞和单核/巨噬细胞功能的定性评价

其次，虽然假时间推理将表达相似的细胞分配给相同的假时间，但我们探索了假时间上基因表达的差异。我们用REACTOME标记对每个细胞进行评分，并在比较新冠肺炎与非痛觉BAL时，我们观察到在非TRIM T细胞和髓系中IFN-信号持续下降(补充信息，图1)。斯4A)。在轻度和临界新冠肺炎中，我们观察到在CD8中，IFN-(Ⅰ型和Ⅱ型)、白细胞介素(IL 12和IL 6)和寡腺苷酸合成酶(OA)抗病毒反应信号增强。+ T_雷姆-和T_前-血统(图1.5K；补充资料，图1。斯4B，e)。CD4+ T_H1-在轻度新冠肺炎中，IFN-(I型和II型)和白细胞介素-(IL 6，IL 12，IL 21)的表达也有类似的特点(图1)。5L；补充资料，图1。斯4F，g)。此外，TRAF 6诱导的NF-κB和IRF 7的激活以及TGF-BR复合物的激活增强。在T中也观察到了类似的效应。_H17-谱系(补充资料，图1)。斯4H，i)。在轻度新冠肺炎中，肺泡巨噬细胞的特征是吞噬相关途径(清除受体、合成脂质或白三烯)和IFN-信号通路增加(见图)。五米；补充资料，图1。斯4J-m)。相反，IL 10-信号(抑制IFN-反应)、趋化因子受体结合和ATF 4介导的ER应激反应在临界新冠肺炎中增加。

总之，由于IFN信号通路在轻度和临界新冠肺炎中富集，我们评估了IFN基因及其受体的特异性表达，以及与抗病毒反应相关的几种关键的趋化因子/细胞因子(补充信息，图1)。斯5A)。IFN基因IFNG和IFNe，以及IFN受体IFNAR 2和IFNGR 2，在新冠肺炎和非COVID 19中表达上调，提示IFN信号在启动抗SARS-CoV-2反应中起关键作用。这也适用于IL6, CCL 3和CCl 4，以及其他几个干扰素应答基因(IFITM 1/2, MX2, IRF 7；补充资料，图1。斯5C)。在比较新冠肺炎轻度和危重患者时，我们确定了IFNLR 1，IFNA 1，CXCL 9，CXCL 10，IL 15和IL15RA在轻度患者中被上调(补充信息，图)。斯5B)。MHC-Ⅱ的表达也有明显上调(HLA-DRB 5, Hla-DQB 2, Hla-DPB 1等.；补充资料，图1。斯5D)在轻度新冠肺炎患者中。

总的来说，虽然我们的轨迹分析已经表明，相对于临界新冠肺炎而言，细胞表型发生了数量上的变化，但我们在此发现，来自关键细胞的定性免疫细胞也严重功能失调。特别是，我们观察到功能性IFN-信号传导是区别轻与危新冠肺炎患者的特征之一。

新冠肺炎中性粒细胞、DC和B细胞的ScRNA-seq

我们使用了一套广泛的中性粒细胞和单核细胞标记基因来区分14,154个中性粒细胞和单核细胞(补充信息，图)。斯6a，b)，并将这些数据与已发表的scrna-seq数据集进行比较，以确定它们代表了可靠的中性粒细胞标记物。8,14,41(补充资料，图。斯6C-E)。中性粒细胞分为5种表型。6a，b；补充资料，图1。斯6f)。第一组由“祖”中性粒细胞组成，其基础是CXCR 4和CD 63，并以血管生成因子的表达为特征。VEGFA和组织蛋白酶(CTSA, CTSD)(图1.6C)。第二组由少数未成熟的中性粒细胞组成。LTF, Lcn 2, MMP 8/9, PADI 4和ARG 1。第3组和第4组由“炎症成熟的”中性粒细胞组成，它们都表达了强调中性粒细胞抗致病方向的标志性足迹：42第3组表达IFN诱导的基因和钙调素(Calgraulins)。S100A8/9, S100A9和S100A12)，它可以调节炎症，而第4组则表达高水平的细胞因子(IL1B)和趋化因子(CXCL 8，CCL 3, CCl 4)。最后一部分由于其巨噬细胞样特征，即mhcⅡ类和补体激活基因的表达，被定性为“杂交”中性粒细胞。C1QB, C1QC，CD 74)，组织蛋白酶(CTSB, CTSL)和APOE。在新冠肺炎中，所有中性粒细胞亚群的频率都高于非CD，但最显著的变化出现在“祖细胞”和“炎症成熟的”中性粒细胞(图1)。6d)，无论是温和的新冠肺炎和批判的新冠肺炎与非新冠肺炎的比较，虽然并不总是显着的(图一)。6E；补充资料，图1。斯6g)。事实上，新冠肺炎中性粒细胞的富集与疾病严重程度、肺损伤和细菌感染无关(补充资料，表)。S11)，以及年龄、性别和潜在的疾病。总之，这表明中性粒细胞在新冠肺炎肺炎中起着特殊的作用，而不仅仅是严重肺部炎症的标志。

我们还鉴定了1410个树突状细胞(DC)，我们可以将这些树突状细胞(DC)划分为6个已建立的群体。6f，g；补充资料，图1。斯6h，我)。新冠肺炎和非肯德基之间没有显着性差异，而迁移的DC和兰格汉斯细胞样的DC在轻度和临界型DC中的频率更高(图一)。6h，我；补充资料，图1。斯6J).

在1397个B细胞中，我们得到了4个单独的团簇。6J；补充资料，图1。斯6K)。卵泡B-细胞由‘成熟-天真’(CD 27)组成。–)和“内存”(CD 27)+)B细胞。前者的特征是独特的CD 27。–/IGHD+(IGD)/IGHM+(IGM)通过生发中心迁移形成CD 27，从而产生后者。+/IGHD–(IGD)/IGHM–(IGM)记忆B细胞(图1.6k，l)。记忆B细胞进一步分化为分泌抗体的浆细胞(IGHA 1, IGHG 1, JCHAIN)，它们本身可以进一步分为短寿命和长寿命的浆细胞.我们没能识别出长寿命的浆细胞(因为这些细胞是居住在骨髓和脾脏中的不增殖细胞，43,44但能够将短命的血浆细胞分成两个亚组。第一组“活跃”浆细胞表达高水平的PRDM 1(飞艇-1)及XBP 1，表明具有较高的抗体分泌能力，而第二个称为“终端”的浆细胞则被浓缩为CCL 2和CCL 5，但也表现为G2M和S细胞周期评分降低，线粒体基因表达增加，显示持续的压力(图一)。6米)。值得注意的是，后者的特征是BCR克隆性增加，BCR均匀度降低(图1)。6N)。与非新冠肺炎相比，APOT中成熟B细胞和活性浆细胞增多，末端浆细胞减少，但无显着性差异(图5)。6O)。虽然这些影响主要是由关键新冠肺炎和非新冠肺炎(补充信息，图1)驱动的。斯6L轻度新冠肺炎与临界新冠肺炎之间无显着性差异(图二)。6P)。总的来说，这表明新冠肺炎中的末梢浆细胞具有次优分化或激活的特征，这可能会导致出现缺陷或反作用的(可能是低质量的)抗体应答。

SARS-CoV-2病毒颗粒在上皮细胞和免疫细胞中的作用

最后，我们检索到22,215个上皮细胞，它们与Chua等人相似。分为7个不同的簇(图1)。7a，b；补充资料，图1。斯7A-E)，最大的3个团簇由分泌型、纤毛型和鳞状上皮细胞组成。16,45虽然在新冠肺炎患者中上皮细胞的频率较低，但代表肺损伤后上皮重塑的干细胞上皮细胞的基底细胞和离子细胞--一种调节盐平衡的罕见的上皮细胞--明显富集(见图)。7C；补充资料，图1。斯7F)。轻度新冠肺炎与临界新冠肺炎之间无显着性差异(图二)。7D)。有趣的是，ACE 2和TMPRSS 2新冠肺炎中表达量明显增加，表达这些基因的腺上皮细胞分别为2.3%和21%。7E、f)。然后我们评估在哪些细胞中我们检索到SARS-CoV-2基因组的序列读取图，从31例新冠肺炎患者中的17例中鉴定出3773个阳性细胞。令人惊讶的是，这揭示了一个更多的阅读映射到淋巴和髓系比上皮细胞(图一)。7g)。11个sars-cov-2开放阅读框架(Orf)中的每一个使用病毒轨迹的分层显示，编码尖峰蛋白的rna(S)，在病毒进入细胞的过程中与ACE 2相互作用，几乎完全在上皮细胞中检测到，而上皮细胞也是唯一的表达细胞。ACE 2和TMPRSS 2(无花果)7H，i)。有趣的是，差异基因表达分析表明S+-上皮细胞表达IFN刺激的基因(IFI 6/27, ISG 15/20, IFITM 1/3等.；图1.7J)和IFN-信号通路。7K)相对于S--上皮细胞。事实上，病毒必须克服IFN介导的抗病毒反应才能复制和繁殖，46暗示S+-上皮细胞已被感染。相反，核衣壳蛋白(NORF 10和ORF 1a编码mRNAs在髓系和淋巴样细胞中的表达水平远高于上皮细胞(图1)。7H)。进一步分层的细胞类型，相对于BAL中存在的细胞数，显示中性粒细胞和巨噬细胞是最常见的。N+-细胞类型(图1.7L)。差异基因表达N+-VSN–-中性粒细胞鉴定转录因子上调BCL 6，可促进病毒感染后中性粒细胞的存活和炎症反应，以及大量的IFN诱导的基因(IFITM 3, 1-3, MX1/2, ISG 15, RSAD 2等.；图1.7米).47比较时N+-VSN--肺泡巨噬细胞和单核巨噬细胞，我们注意到参与mhcⅡ类表达的基因，在一定程度上也涉及IFN诱导的基因。IFIT 3, IRF 7, MX2、OAS 1、OAS 3等)被过度表达，这一影响在N+-VSN−-单核细胞(补充资料，图1)。斯7g-i)。REACTOME和Go对不同表达基因的通路分析：REACTOME显示IFN-信号转导和Go上调的基因对病毒的应答N+-中性粒细胞(图1.7N，o)。值得注意的是，在不同的中性粒细胞表型中，N在表达钙粒蛋白的炎症成熟中性粒细胞中最强烈地富集(如图所示)。7P)。如预期，更多N出现在临界和轻度新冠肺炎中(补充信息，图)。斯7J，k).48

总体来说S+-(感染的)上皮细胞减少IFN-信号，N+-中性粒细胞的特征是IFN-信号增强，表明中性粒细胞是与SARS-CoV-2病毒颗粒相互作用的主要细胞类型，是获得病毒物质最多的细胞，这与其作为感染的第一天然免疫应答者的作用相一致。49

细胞间通讯破解新冠肺炎BAL的免疫环境

一方面，我们的数据显示中性粒细胞参与清除病毒颗粒/病毒感染的细胞，而在关键的新冠肺炎中T细胞和单核细胞到巨噬细胞系被显著破坏，我们探索了这些细胞类型之间的(预测)相互作用，以获得更精确的洞察力。首先，我们计算了单元类型之间的相互作用(P≤0.05)分别对轻微和临界新冠肺炎，然后我们评估不同的具体相互作用的数量。中性粒细胞的特点是，在临界和轻度新冠肺炎中，特异性相互作用的数量较少，而这种相互作用的频率略高一些。反之亦然，所有其他免疫细胞和上皮细胞之间有许多特定的相互作用，尤其是在轻微的新冠肺炎中(见图)。8a，b；补充资料，图1。斯8).

在关键的新冠肺炎中，单核/巨噬细胞和中性粒细胞之间的特定相互作用几乎总是涉及亲迁移的相互作用(Flt 1, Nrp 1或NRP 2/VEGFA, CXCL 1或CXCL 2或CXCL 8/CXCR 2, CCL 3或CCL 7/CCR 1)，再加上免疫抑制性的相互作用，例如LILB 1或LilrB 2/Hla-F和RPS 19/C5AR1，这也会导致中性粒细胞功能障碍(图一)。8C).50观察到一些刺激的T细胞对中性粒细胞的相互作用，包括IFNG/II型IFNR, PDCD 1/CD 274, LTA/TNFRSF1A或TNFRSF1B(无花果)8D)，而特定的上皮细胞与中性粒细胞之间的相互作用仅限于混合骨髓免疫抑制(RPS 19/C5AR1与病毒感染相关的促炎信号(TNFRSF 14/TNFSF 14)(图1.8E)。在T细胞和单核/巨噬细胞中，出现了一些免疫刺激或自我调节的相互作用(CTLA 4或CD 28/CD 80或CD 86, CCL 5/CCR 5)(图1.8F关键新冠肺炎中T细胞相互作用的特异性上皮细胞仅限于促炎性ICAM-1介导的相互作用(图1)。8g).

在温和的新冠肺炎中观察到了一个非常不同的情况(见图)。8C-g)。在单核/巨噬细胞与中性粒细胞之间的大量相互作用中，我们注意到了白介素信号(双向信号)。IL1B, IL1A，IL1RN/A信号，IL7/IL7R, CXCR 2/CXCL 1或CXCL 8)，但也MRC 1/PTPR(吞噬)和LTbR/LTB(亲炎症)。T细胞与中性粒细胞间的特异性相互作用CCR 1/CCL 3或CCL3L1(亲炎症)，CD2/CD 58(共刺激/免疫途径)和CD 94：NKG2E/Hla-F(抗病毒免疫监测)，而在上皮细胞和中性粒细胞之间，IL1R/IL1A或IL1B或IL1R相互作用最明显(这可以促进产生免疫控制/免疫背景下的中性粒细胞免疫)。42,51,52在上皮细胞和单核/巨噬细胞之间也观察到许多相互作用：燃气6或PROS 1/阿克塞尔(受体介导的吞噬)，ADORA2B/ENTPD 1(胞外ATP降解/抑制)，CD 83/PECAM 1(免疫激活)和信号素与它们的Plexin和NRP受体相互作用(组织重建和修复)。在上皮细胞和T细胞之间，我们主要观察到共同刺激CD 46/日航1, CD40LG/CD 40, IL7R/IL7, 云母或RAET 11/NKG2D受体)和组织修复相互作用(TGFβ1/TGF 2和TGFβB 1/TGFβBR 3)，而T细胞和单核/巨噬细胞之间存在协同刺激(LTA/TNFRSF1A或TNFRSF1B或TNFRSF 14, TNFSF 10/TNFRSF10B)或组织修复因子(CSF 1/CSFR 1, TGF-BR 3/TGFβ1, IL15RA/IL 15)、T细胞稳态和细胞毒性的中介物(FASLG/Fas)和抗病毒免疫监测(NKG2DⅡ受体/海地文职特派团或云母).