雌激素对Monge病过度红细胞增多症的保护作用

Monge‘s病(慢性高原病(CMS))是由长期暴露于高原缺氧引起的一种适应不良的疾病。CMS的特征之一是红细胞过多，红细胞压积极高。在安第斯人口中，男女之间的CMS流行率有很大差异，而女性很少。此外，更年期后女性的CMS发生率急剧上升。在本研究中，我们评估性激素(睾酮、孕酮和雌激素)在CMS和非CMS细胞中的作用，使用一个特征良好的体外红系平台。虽然我们发现睾酮对红细胞的产生有轻微的(不显著的)增加，但我们观察到雌激素在生理浓度下会急剧降低CD235a。+细胞(糖蛋白A；红细胞的标志)，从未处理的CMS细胞的56%到处理的CMS细胞的10%，以一种阶段特异性和剂量反应的方式。在分子水平上，我们确定雌激素对GATA 1有直接影响，显著降低GATA 1的信使RNA(MRNA)和蛋白质水平。p < 0.01) and its target genes (阿拉斯2, BclxL，和EPOR, p < 0.001). These changes result in a significant increase in apoptosis of erythroid cells. We also demonstrate that estrogen regulates erythropoiesis in CMS patients through estrogen beta signaling and that its inhibition can diminish the effects of estrogen by significantly increasing HIF1, VEGF, and GATA1 mRNA levels. Taken altogether, our results indicate that estrogen has a major impact on the regulation of erythropoiesis, particularly under chronic hypoxic conditions, and has the potential to treat blood diseases, such as high altitude severe erythrocytosis.

慢性高原病(CMS)，又称Monge‘s病，是一种由长期(多年或终生)长期暴露于高原缺氧引起的进行性衰弱综合征。1,2,3,4,5,6,7,8,9。在全球范围内，CMS不是一种罕见的疾病；据估计，有超过1亿人生活在高海拔地区(>2500米)，有发展CMS的风险。4,7,8,10,11,12,13。在这项研究中，我们利用了一项“自然实验”，在这一实验中，安第斯山脉高海拔地区的人类适应了慢性缺氧，而在同一海拔地区的其他安第斯人似乎没有适应。这些不适应的个体有CMS或Monge‘s病。那些已经适应高海拔和不显着疾病的人被称为非CMS群体。除安迪安人外，其他两大高海拔人口，埃塞俄比亚人和藏族人也被广泛研究。8,9,14,15,16,17,18.

红细胞增多症(EE)是CMS的重要特征之一，这种过度的病理生物学反应具有有害的作用，因为高红细胞压积会增加血液粘度，减少流向缺氧敏感器官(如大脑和心脏)的血流量，从而导致青年人心肌梗死或中风。从表型的角度来看，CMS患者大多患有严重的红细胞增多症，同时伴有神经和心血管疾病。3,7,8,11,12,19,20。CMS的症状包括头痛、头晕、呼吸困难、心悸、睡眠障碍、精神疲劳、精神混乱、肺动脉和全身高血压、心力衰竭和红细胞增多症。在所有的体征和症状中，红细胞压积仍然是一个明确的数量特征，并且与疾病密切相关，尤其是在安第斯地区的人群中。3,7,8,11,12,19,20.

安第斯山脉有关CMS的重要流行病学观察之一是，CMS主要影响男性，而在女性中很少。7,21,22,23,24。更年期后女性的CMS发病率也急剧上升。7,23,24。这表明性别和性激素在改变疾病表现中的作用。然而，大多数研究都集中在男性EE的基础上，认为睾酮水平与促红细胞生成素过多有关。25,26,27,28,29，但这些研究缺乏直接的证据或机制来证实这一假说。25,26,27,28,29。据我们所知，没有任何研究能清楚地确定性激素的作用和Monge‘s病中显著的性别差异的机制基础，也没有任何研究试图了解绝经前女性罕见这种疾病的原因。

随着下一代测序技术的进步，人们在理解高原居民耐缺氧或敏感的遗传基础方面取得了重大进展。2,8,18,30,31,32,33,34,35,36,37。我们的小组和其他人已经发现了一些候选基因，这些候选基因在CMS与非CMS受试者之间存在差异表达。其他人也证实了我们在这一领域的发现，例如去甲基化酶SENP 1的作用，这一点已得到其他团体的证实。38,39,40。此外，我们利用这个独特的安第斯种群的诱导多能干细胞(Ips)，建立了一个模拟低氧引起的CMS患者过度红细胞增多的体外模型。36。使用我们的模型系统，我们相信我们能够进一步理解这种性别差异在高海拔地区过度的红细胞生成物的性别差异。

患者标本和iPS细胞株

所有研究对象(CMS和非CMS)都是居住在秘鲁Cerro de Pasco的安第斯山脉的成年男性和女性。∼4338m.CMS患者符合基于青海CMS评分的CMS或Monge‘s病诊断标准，详见我们以前的研究。36,41。每一名受试者都签署了一份知情的书面协议，协议由加州大学、圣地亚哥分校和秘鲁利马的佩鲁纳·卡耶塔诺·赫雷迪亚大学批准。来源于CMS和非CMS对象的ips细胞系已经产生，并已被我们的研究小组很好的描述。36,41.

利用细胞因子产生红细胞

RBCs是在常氧和低氧条件下产生的，这是按照我们以前建立的基于多盖小组的体外实验平台进行的。36,42。利用这一体外模型和ips细胞，我们使用适当的cd标记和血红蛋白功能分析对红系分化进行了深入的研究。36。从本地CD 34中生成RBCs+细胞，多盖伊小组的治疗方案被修改后加入低氧疗法，正如我们以前在CMS和非CMS受试者中所描述的那样。43,44.

缺氧方案与FACS分析

Eb期红系细胞在5%CO中37℃培养1周。2/空气。1周后，这些细胞被转移到37°C，5%O的低氧孵化器中。2，5%CO2三个星期。随后，用FACSDiva软件(Version6.0；BD)对细胞进行FACS分析(FACSCanto CellAnalyzer，BD)，并以糖肽A作为评价红细胞生成和成熟的指标。

爆炸形成单位-红血球(bfu-e)测定

FACS-分类的iPS衍生CD 34+来自CMS和非CMS受试者的细胞在密度为10的情况下被镀。5在含2%胎牛血清的H 4034培养基中，每35 mm培养皿中的细胞数。盘子用5%CO在37℃下孵育。2和5%O2连续14天，对BFU-E菌落进行评分，并进行统计学处理。t进行测试，以确定不同样本之间差异的显着性。

红系分化过程中性激素(睾酮、孕酮和雌激素)的添加

(A)剂量反应实验睾酮、孕酮和β-雌二醇是从西格玛购买的，与不同浓度的培养基混合，广泛覆盖这些激素的已知生理范围。通过评估5~100 NM(5，10，50和100 NM)的浓度，对每种激素产生剂量-反应曲线。

(B)时程实验在红系分化过程中，在不同时间点添加性激素。在低氧红细胞分化的EB期，在第1周、第2周和第3周添加激素，如下图所示。

雌激素α和β拮抗剂的添加

MPP(甲基哌啶-吡唑，α-拮抗剂)，THC(四氢大麻酚，β-拮抗剂)和PHTPP(4-[2-苯基-5，7-双(三氟甲基)吡唑，[1，5-a]嘧啶-3-基]苯酚，a-β-拮抗剂)从Sigma购买，加入10 NM浓度(根据中试剂量-反应结果)。

BclxL抑制剂的添加

BclxL特异性抑制剂从ABCAM(抑制剂#1，A-1155463；抑制剂#2，A-1331852)购买，加入浓度为1M(根据中试剂量-反应实验)。

凋亡分析

采用APC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒和碘化丙啶(PI)(BioLegend)进行细胞凋亡分析。分析是根据制造商的指示进行的。用冷生化染色液冲洗两次细胞，然后以0.5×10细胞/ml的浓度重新悬浮在Annexin V结合缓冲液中，将100 l细胞悬液转入新管，加入5 ml APC Annexin V和PI溶液。细胞在室温下(25°C)在黑暗中温育15 min。最后，在每管中加入400个AnnexinV结合缓冲液，用FACSariaII系统(BD生物科学)进行流式细胞仪分析。

基因表达检测的实时PCR分析

Eb期红系细胞分别于缺氧培养1、2、3周后(含雌激素和不含雌激素)。用RNeaseMini试剂盒从EBS中提取RNA。利用上标Vilo IV系统(Invitrogen)从总RNA中提取互补DNA.用PowerSYBR Green(应用生物系统)的GeneAmp 7900序列检测系统进行实时PCR.使用的引物序列如下：

GATA1-L，5‘-CCTGTTGCCAATG-3’和GATA 1-R，5‘-CTCTCTACT GTAGATAC-3’；VEGF-L，5‘-ATCTTCACACACCTCCTCAGGC-3’和VEGF-R，5‘-CAAGGCCCAGGGGATTTC-3’；EPOR-L，5‘-GCAGGTGGGCACA-3’和EPOR-R‘；HIF1B-L，5‘-CCGAATGACATCAGATG-3’和HIF1B-R，5‘-GTTCCCTCTCCATCATCATC-3’；Bcl-XL-L，5‘-GCAGTATTGTGAGGTCGGATCGC-3’和Bcl-XL-R，5‘-CAAAAGTATCCCAGCCGCCG-3’。用GAPDH-L、5‘-CTGCACTCCCAACGACC-3’和GAPDH-R、5‘-CTGCTGCTGGCTGGTCC-3’引物对结果进行归一化。

蛋白质水平定量的westernblot分析

采用RIPA缓冲液和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(ABCAM)的标准蛋白分离方案分离蛋白质。从Santa Cruz(M-20)和ABCAM(ab69479，ab32370)中获得抗GATA 1、VEGF和BclxL的抗体。用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离了20 g裂解液上清液，并将其转移到硝化纤维素膜上。用增强型化学发光试剂(Bio-Rad实验室)和ChemiDoc XRS+分子成像仪(Bio-Rad实验室)研制了该印迹。

慢病毒载体及其介导的IPSCs诱导敲除和过表达(OE)细胞的研究

GATA1-OE是一种适合于慢病毒系统的表达载体，是从GE保健公司购买的.抗雌激素GATA 1-[f(GATA-1)-VP 16]45,46由向量生成器生成。用0.5g/ml普罗霉素(Sigma-Aldrich)筛选细胞。用实时聚合酶链反应(PCR)验证了每种结构的表达。

雌激素可防止缺氧诱导红细胞在不同红系期产生。

在我们之前的研究中，我们重新描述了低氧诱导的胞质雄性不育细胞的EE反应。36。我们还使用本机CD 34验证了我们的结果。+两种模型系统检测CMS患者的EE表型43。本研究利用此体外实验平台，研究了性激素对雄性不育细胞和非CMS细胞在缺氧条件下对BFU-e和CD235a等特定红系期的影响。值得注意的是，雌激素显著降低了bfu-e集落的产生以及cd235a的相对比例。+雄性CMS中的细胞(更成熟的RBCs)。1)和雌性红系细胞。2)。图形1显示雌激素、孕酮和睾酮对红系祖细胞和CD235a的影响。+雄性CMS和非CMS细胞中的RBCs。在CMS细胞中，BFU-e集落数减少到添加雌激素前的一半(图1)。1A)。睾酮引起轻微而不显著的增加(p在群体生产中。孕酮也能减少增殖，但不明显(P=0.74)(图1。1A)。在CD 235 a+阶段，雌激素有一个显著的作用，减少至少6倍的红细胞比例(图一)。1B)。事实上，我们观察到CD235a的比例大幅下降。+细胞(10%对56%)(P < 0.01) with the addition of estrogen (Fig. 1B)。这些结果表明，由于低氧对红细胞产生的影响被雌激素减弱，细胞质雄性不育细胞对缺氧的过度反应不仅是由雌性细胞质雄性不育细胞决定的，而且还受激素环境的影响。为了证实这一观点，我们首先研究了在细胞水平上，雄性和雌性细胞是否对缺氧有相似的反应。通过分析雌性CMS和非CMS细胞，我们进行了有趣的观察.首先，绝经后的CMS和非CMS细胞表现出与男性细胞相似的低氧反应。2)。在我们的体外模型中，绝经后的CMS雌性细胞在低氧状态下表现出EE表型，即类似于雄性CMS的表型反应。事实上，CMS细胞产生的BFU-e集落数是非CMS细胞的两倍(见图).2A)。在CD 235 a+相较于非CMS细胞，CMS细胞产生的RBCs数量约为非CMS细胞的30倍(图1)。2B)。其次，性激素在绝经后女性细胞和男性细胞中表现出相似的反应。雌激素的加入导致RBCs数量的显著减少(图1)。2C)，而睾酮和孕酮的添加并没有导致任何明显的变化。

a该图表描绘了ipsc衍生的CD 34在缺氧条件下产生的bfu-e集落的数量。+来自CMS和非CMS个体的细胞中添加了下列性激素：(一)雌激素(粉色棒)，(二)孕酮(绿棒)，(三)睾酮(蓝棒)，和(Iv)不添加激素(灰色棒)。雌激素显著(P < 0.05, t试验)降低了CMS细胞中BFU-E的生成.每组的科目数目如下：n=4.“+”表示值的平均值，每个方框内的水平线表示中值。**P < 0.01 and *P < 0.05. b该图显示性激素对红细胞生成的影响(CD235a的相对比例)。+在缺氧条件下加入以下性激素的CMS和非CMS细胞：(1)雌激素(粉红棒)，(2)孕酮(绿巴)，(Ⅲ)睾酮(蓝棒)，(Iv)不添加激素(灰巴)。雌激素显著降低成熟红细胞的比例(CD235a)+在CMS细胞中。P值<0.001(t测试)。每组的科目数目如下：n=4.“+”表示值的平均值，每个方框内的水平线表示中值。**P < 0.01 and *P < 0.05.

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aBFU-E期CMS和非CMS绝经后女性细胞的低氧反应。与非CMS细胞相比，CMS细胞表现出过度的红细胞增多反应(EE).这种反应与BFU-e期的雄性细胞相似.*P < 0.05 (t测试)。bCD235a期CMS和非CMS绝经后女性细胞的低氧反应。与缺氧条件下的非CMS细胞相比，CMS细胞产生大量的RBCs。*P < 0.01 (t测试)。c雌激素可减少雌性CMS细胞过度的红细胞分泌表型。雌激素的加入明显抑制了缺氧状态下CMS细胞的过度反应。该图显示性激素对红细胞生成的影响(CD235a的相对比例)。+)在缺氧条件下加入以下性激素的CMS和非CMS细胞：(1)雌激素(粉红棒)，(Ii)孕酮(绿巴)，(Iii)睾酮(蓝棒)，(Iv)不添加激素(灰条)。雌激素显著降低成熟红细胞(CD 235)的比例。+细胞质雄性不育细胞(CMS)。P值<0.001(t测试)。每组的科目数目如下：n=4.“+”表示值的平均值，每个方框内的水平线表示中值。**P < 0.01 and *P < 0.05.

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加入雌激素的剂量和时间对红系细胞至关重要。

添加性激素的剂量或时间可能会改变细胞的反应。为了解决这一问题，我们测试了不同剂量的雌激素、睾酮和孕酮(图5至100 NM)。3A)。雌激素对CMS患者的促红细胞生成素反应有明显的负效应，呈剂量依赖性(图一)。3A)。在5~10 NM(生理雌激素水平：0.1~10 NM)时，红细胞生成量显著下降，50~100 NM导致红细胞产量极低。对于睾酮，我们观察到轻微的增加，但变化不显著(图)。3A).

我们还测试了红系分化过程中不同时间点的激素添加对红细胞产生的影响，如“方法”部分所示。IPS细胞在每周加入细胞因子后分化为红系祖细胞，直到形成成熟的RBCs，如“方法”一节中的原理图所示。例如，在EB阶段的第一周，大多数细胞是CD 45。+，在第二周，他们是CD 71。+在第三周，他们是CD235a。+。因此，通过在不同时间点添加性激素，我们研究了这些激素对红系前体特定阶段的影响。对于睾酮和孕酮，我们没有观察到明显的变化(图)。3B)。然而，时间对于雌激素来说是至关重要的。事实上，雌激素在第二周的EB期表现出最强的红细胞减少(图一)。3B)。因为我们在之前的研究中36在EB期的第2周，GATA 1等转录因子的表达发生了明显的变化，我们推测雌激素可能通过特定的信号通路影响CMS和非CMS细胞的促红细胞生成素。

雌激素对细胞质雄性不育表型的调节作用及其对GATA 1和凋亡的影响

为了确定雌激素在CMS患者中调节红细胞生成的信号通路，我们研究了我们已经证明是关键中介的基因的表达，例如SENP 136,43和GATA 136,43。有趣的是，我们观察到在添加雌激素之前，雄性和雌性CMS中SENP 1的水平是相似的，而SENP 1 mRNA水平随雌激素的增加而没有明显的变化。雌激素可显著降低雄性和雌性CMS细胞GATA 1和VEGF的mRNA水平。4A)。VEGF水平下降约5倍，GATA 1水平下降>10倍(如图所示)。4)。此外，几个GATA 1靶基因的表达也随着雌激素的增加而急剧下降。图形4BALAS 2、EPOR和BclxL的表达水平下降约50%。此外，雌激素的加入导致男女细胞GATA 1、VEGF和BclxL水平在蛋白质水平上急剧下降(图一)。4C-E)，重申雌激素在调节它们中的关键作用。雌激素对GATA 1、VEGF和BclxL表达的影响甚至对非CMS细胞也有显著影响，如图所示。4。然而，对CMS细胞中RBCs水平的反应是显著的。1和2)，导致我们主要关注CMS细胞，在每个实验中以非CMS细胞作为对照。为了验证GATA 1是雌激素下游关键靶点的假设，我们使用了抗雌激素的GATA 1-[f(GATA-1)-VP 16]。45,46并研究了其是否能消除其对红细胞生成的影响。当我们过度表达抵抗雌激素的GATA 1和常规GATA 1时，我们发现，与野生型GATA 1不同，雌激素抵抗GATA 1能够阻止雌雄细胞中雌激素介导的红细胞生成减少(图一)。5A)。GATA 1和GATA 1靶基因BclxL是调节红细胞凋亡的关键。因为雌激素改变了这些基因的表达。4)检测雌激素与细胞凋亡的关系。事实上，我们发现雌激素显着地促进了红系细胞的凋亡(如图所示)。5B)。随着雌激素的加入，CMS细胞的凋亡率(60%)比未处理的CMS细胞(25%)高出一倍以上。我们确实通过雌激素抵抗GATA 1和BclxLOE来阻止雌激素介导的凋亡。5B)。我们进一步评价了BclxL通过在BclxLOE背景上添加特异性BclxL抑制剂来预防雌激素介导的凋亡的作用。事实上，我们观察到雌激素介导的细胞凋亡随着抑制剂的加入而急剧增加，这表明bclxL在调节雌激素诱导的细胞凋亡中起着关键作用(图一)。5B)。这表明雌激素调节女性红细胞生成的机制之一是通过增加红细胞凋亡来实现的。

雌激素β信号在缺氧条件下调节CMS患者HIF1、VEGF和GATA 1 mRNA水平的作用

为了进一步探讨雌激素对缺氧所致EE影响的分子基础，我们利用有效的雌激素α-和β-拮抗剂，研究了它们对低氧所致EE表型的影响。有趣的是，我们发现雌激素β信号在CMS和非CMS个体的红细胞生成反应中起主要作用。当我们阻断β信号传导时，雌激素对红细胞产生的抑制作用被取消。在分子水平上，我们观察到随着β-拮抗剂的加入，HIF1(α，β)，VEGF和GATA 1的mRNA水平显著升高(图1)。6)。β抑制剂使Arnt和HIFmRNA水平分别增加2倍和1.5倍。VEGF增加7倍，GATA 1增加2.2倍。这有力地表明雌激素通过雌激素β信号通路减少红细胞的产生，特别是在缺氧条件下。

流行病学研究表明，安第斯地区CMS流行率存在性别差异。7,23。此外，更年期后女性EE发生率的急剧增加，进一步证实了性激素在这一疾病的病因中起作用的假设。7,23。此前的研究表明，CMS患者血清睾酮和孕酮水平与血红蛋白水平存在相关性。24,27,28,29,47但在高原CMS患者中，雌激素对红细胞生成的影响尚不清楚。所有性激素都有可能直接影响促红细胞生成素和铁代谢，而铁代谢则直接导致低氧状态下红细胞压积的增加。48,49,50,51,52,53,54,55,56,57。生理因素，如通气、心肺反应和氧合，也取决于性激素，也可能导致两性之间的红细胞压积水平的差异。25,58,59,60,61,62,63,64,65。我们的体外模型系统为研究细胞水平的性激素在红细胞中的作用提供了一个独特的机会。在本研究中，我们展示了雌激素在CMS红系细胞中的重要作用，并为雌激素对红细胞生成的影响提供了机制基础。

在我们的实验中，我们做了一些重要的观察，显示雌激素如何在分子水平上调节缺氧诱导的红细胞生成。首先，雌激素可以显著改变GATA 1(一种必需的促红细胞生成素转录因子)的表达和下游活性，这可以从其靶基因的表达变化中反映出来。特别是，我们对雌激素抵抗GATA 1和拯救EE表型的实验显示，GATA 1可能与雌激素直接相互作用。在高海拔地区，雌激素的作用变得更加重要，因为我们先前的研究表明GATA 1是与Monge‘s病的发病机制相关的一个中心节点。36。它与HIF1a和SENP 1，它们是与CMS相关的重要基因。36,43,66,67。因此，雌激素对GATA 1的直接作用是调节CMS患者红细胞生成的有效机制。第二，我们的结果表明，凋亡是调节CMS患者红细胞数量的重要因素，与雌激素有直接和因果关系。事实上，雌激素的加入使红系细胞的凋亡率和抗凋亡基因的OE增加了一倍。BclXL减轻其对RBCs的影响。第三，雌激素诱导的VEGF表达水平的下降也是本研究的一个重要发现，因为VEGF已经被证明可以调节促红细胞生成素和GATA 1等关键促红细胞生成素水平。68,69,70。VEGF可能受雌激素直接调控，或通过HIF信号间接与雌激素相关。第四，通过与特异性雌激素受体抑制剂的药理实验，我们发现雌激素β信号通路是雌激素调节CMS患者红细胞生成的主要途径。事实上，抑制β信号传导对HIF、VEGF和GATA 1的表达水平有直接影响。第五，雌激素受体的结合是调节GATA 1作用的关键因素。在我们的拯救实验中，一种耐ER的GATA结合蛋白的OE增加了红细胞的产量，说明了直接结合的重要性。Du等人的研究。71通过染色质免疫沉淀和双荧光素酶分析，证明雌激素β与GATA 1启动子直接结合。总之，由于GATA 1是自我调节的，雌激素对GATA 1的影响似乎是CMS患者雌激素信号传递中最关键的一步。在我们之前的研究中，我们发现SENP 1(一种去瘤酶)通过移除SUMO单元来激活GATA 1，从而使它进入细胞核，并启动其遗传程序在CMS患者中产生EE。36.

雌激素已经在海平面上的一些血液疾病中被研究过，例如白血病和贫血。72,73。其他雌激素调节的疾病，如乳腺癌，在HIF和雌激素信号之间表现出复杂的调节和相互作用。74,75。在哺乳动物中，雌激素的使用会导致严重的贫血，这种贫血已经被证明是由红细胞凋亡引起的。45,46,76。缺乏ERβ的小鼠在衰老过程中发生慢性骨髓增生病，类似于人慢性粒细胞白血病77.

值得注意的是，马卡根是秘鲁地区的天然草本植物，经常被高原个体食用，作为降低红细胞压积的一种潜在疗法，但其作用的机制基础尚不清楚。78。可能是马卡根与性激素相互作用，导致红细胞压积的变化。事实上，最近的一项研究表明，雌二醇水平的增加是在食用了马卡根之后发生的。79，但仍需进一步研究，以确定其行动方式。从治疗的角度来看，我们的研究是了解雌激素在CMS病理生物学中的作用的第一步。