EGFRvIII-特异性小鼠CAR-T细胞无法控制大的已建立的胶质瘤
我们采用免疫活性原位GL261小鼠胶质瘤模型，评价EGFRvIII特异性小鼠CAR-T细胞的抗肿瘤活性。亲本GL 261与EGFR的胞外部分转导，其中变异Ⅲ突变与小鼠EGFR跨膜结构域融合(图1)。1A)，它代表了人类GBM中常见的一种突变。21。利用EGFRvIII特异性mr 1抗体的单链可变片段构建了第二代car。22、小鼠CD 28来源的跨膜结构域、小鼠CD 28和CD3ζ细胞内结构域。将截短的小鼠CD 34与CAR共同表达，以检测CAR转导的T细胞(图1)。1B；补充图。1A)。小鼠T细胞表达EGFRvIII特异性CAR能有效杀伤EGFRvIII+GL 261而非亲本GL 261在体外(附图)1B).
图1：EGFRvIII特异性CAR-T细胞控制新建立的原位肿瘤，但不能控制大肿瘤。A用逆转录病毒载体转染GL 261，表达小鼠EGFRvIII。EGFRvIII突变部分与小鼠EGFR跨膜区融合，获得表面表达表位的细胞。左面板：流式细胞术检测野生型GL 261(蓝色)和GL 261表达EGFRvIII(红色)。右侧面板：免疫组织化学染色EGFRvIII在骨科植入肿瘤(标尺代表100μm)。四只小鼠有一个典型的肿瘤。B鼠车结构。将小鼠CD 34的C端部分作为标记基因，用T2A肽从CAR结构中分离，其中包括一个具有移植特异性的单链抗体(ScFv)、一个CD8柄和一个CD 28-CD3ζ作为激活域。MR1为EGFRvIII特异性单链抗体，4g7为人CD 19特异性单链抗体，为阴性对照。C“压力实验”。肿瘤植入后第11天或第17天静脉注射CAR-T细胞对肿瘤控制作用的直接比较。D肿瘤植入后第11天接受TBI或TBI的小鼠的典型MRI图像(轴向)，随后为CAR-T细胞。E生存曲线(n=3对TBI，n=4对于一个实验中的TBI+CAR小鼠，p=0.0288(*)，对数秩检验)和F肿瘤体积量化G典型的MRI图像(轴向平面)的小鼠接受TBI或TBI后，随后的CAR-T细胞在肿瘤植入后第17天。H生存曲线(n=3对TBI，n=4用于TBI+CAR小鼠(来自一个实验)和I肿瘤体积量化源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们测试了EGFRvIII导向的CAR-T细胞在荷瘤小鼠体内的有效性。+GL 261肿瘤肿瘤生长的监测使用1特斯拉磁共振成像(1T-MRI)系统.MRI观察肿瘤时(植入后第10天)，用5Gy全身照射(TBI)作为准备性淋巴耗竭。为了获得过继转移的T细胞的植入和抗肿瘤效果，需要做好准备性淋巴滤过，这是CAR-T细胞治疗的一个标准组成部分。23。TBI后静脉注射2.5×10。6CAR-T细胞(附图)1C)。术后第7天，CAR-T细胞浸润肿瘤(附图)。1D，E)如CD 34免疫组化所示。肿瘤浸润是抗原特异性的，输注人CD 19特异性的CAR-T细胞(作为阴性对照)没有在肿瘤内积聚(补充图)。1F，G)。在这种情况下，CAR-T细胞给药可使50%的小鼠获得肿瘤清除和长期存活。p=0.0028)(附图。氢)、肿瘤接种后早期给药的效果。
为了重述单用car-T细胞治疗不足以根除胶质母细胞瘤的临床观察，我们建立了一个“应激”模型，使用的是小剂量的car-T细胞(1×10)。6)在肿瘤植入后的第11天(早期)或第17天(晚期)给药(如图所示)。1C)。早期应用CAR-T细胞可以控制肿瘤的生长，并能显著提高生存率(图一)。1D-F)。相反，过度使用CAR-T细胞会导致肿瘤控制不良和随后的肿瘤生长，而没有提高生存率(图一)。1g-i)。综上所述，这些数据表明，CAR-T细胞只能控制新建立的肿瘤，但不能控制更大的肿瘤，这种情况更接近临床使用CAR-T细胞的阶段。
局部注射单剂量IL-12可提高car-T细胞的疗效。
为了提高已建立的大型胶质瘤的抗肿瘤活性，我们设计了一种联合免疫治疗方法.我们评估了是否使用IL-12：FC(图1)。2A)与CAR-T细胞联合应用可改善晚期EGFRvIII期肿瘤的控制。+GL 261胶质瘤肿瘤植入后第15天，小鼠接受5Gy的TBI，然后在第20天进行一次肿瘤内注射(300 Ng)IL-12：FC(如图所示)。2B)。然后用1×10处理小鼠。6EGFRvIII引导的CAR-T或非转导的T细胞在第21天静脉注射(图1)。2B)。MRI测量的肿瘤体积表明，单次给药(CAR+PBS或NT+IL-12：FC)只能延缓肿瘤的生长，而全身EGFRvIII特异性CAR灌注联合局部IL-12：FC给药可消除大多数治疗小鼠的肿瘤，对小鼠的整体生存有协同作用(图1)。2C-E)。其次，我们评估了IL-12：FC对第二次颅内肿瘤模型CAR-T疗效的影响.在此，我们用颅内植入B16.F10细胞来再现黑色素瘤的脑转移20,24,25。B16.F10表达GD2，这是一种在神经外胚层起源的肿瘤，包括胶质瘤、黑色素瘤和神经母细胞瘤上表达的肿瘤抗原。26(补充图。2A)。在此背景下，我们使用了gd2特异性的第二代car，它基于从k 666抗体中提取的单链片段变异。27。在这个极具侵略性和低免疫原性的模型中28,29对照组小鼠(NT+PBS)中位生存期为15天，而单用NT+IL-12：FC治疗无明显的生存期。值得注意的是，GD2特异性CAR-T细胞的应用改善了NT+pbs和NT+IL-12：FC组(p=0.01)。此外，与单独治疗(NT+IL-12：FC与CAR+IL-12：FC)相比，IL-12：FC和CAR-T细胞联合治疗可显著提高生存率(NT+IL-12：FC)。p < 0.0001; CAR+PBS vs. CAR+IL-12:Fc, p < 0.001) (Supplementary Fig. 2B-D)。这些数据表明，联合IL-12和CAR-T细胞治疗可以促进有效和持续的抗肿瘤反应，即使在免疫原性较差的模型中也是如此。
图2：EGFRvIII特异性CAR-T细胞与局部给药IL-12：FC联合应用可有效控制晚期原位肿瘤。A将IL 12：FC结构插入哺乳动物表达载体pCEP 4，并将异二聚体IL-12与小鼠IgG 3的FC部分融合。B实验时间表。GL 261 EGFRvIII+第0天在右侧纹状体植入细胞。小鼠植入后第15天接受5 Gy TBI，第17天证实肿瘤植入。第20天，小鼠接受pbs或300 ng IL-12：fc在肿瘤部位接受手术，然后静脉注射1×10。6车-T细胞或非传导细胞。每周监测肿瘤生长情况。C肿瘤体积量化D每组小鼠的典型MRI图像(轴向视图)。E存活曲线(NT+PBS)n=14，CAR+PBSn=19，NT+IL-12：FCn=18，CAR+IL-12：FCn=20来自四个独立实验，(NT+PBS对CAR+PBS)p=0.0375，NT+pbs与NT+IL-12：FCp=0.0001，NT+pbs与CAR+IL-12：FCp < 0.0001, CAR+PBS vs. CAR+IL-12:Fc p=0.0005，NT+IL-12：FC与CAR+IL-12：FCp=0.0176，对数秩检验)。源数据作为源数据文件提供。
局部IL-12治疗脑胶质瘤浸润功能紊乱的CAR-T细胞
为了探讨car-T细胞与IL-12联合作用的机理，我们用23个代表谱系和激活标记的独立参数(补充表)对tme进行了高参数的流式细胞术表征。1)。我们选择了治疗后第8天给药(如图所示)。3A)，截至此时点GL 261_EGFRvIII+肿瘤的大小仍然相当(补充图)。3A)，以及大量浸润的EGFRvIII-CAR-T细胞。为了进行这一分析，从CD 45.1同基因小鼠中产生了EGFRvIII-CAR-T细胞，以区别于内源性T细胞.大部分浸润的car-T细胞为CD8。+T细胞(附图)3B)Car-T细胞被定义为CD 45.1+TCR-β+CD 34+CD8+细胞(图1.3B)。我们观察到除了CAR-T细胞外，接受局部IL-12：FC的脑肿瘤中EGFRvIII导向的CAR-T细胞的数量与只接受CAR-T细胞和PBS的脑瘤相比没有差异(补充图)。3C)，提示肿瘤控制上的差异并不是由于过继转移的T细胞的肿瘤浸润增加所致。
图3：肿瘤内IL-12：FC给药恢复EGFRvIII特异性CAR-T细胞活力.A实验时间表。GL 261 EGFRvIII+第0天在右侧纹状体植入细胞。小鼠植入后第15天接受5 Gy TBI，第17天证实肿瘤植入。第20天，小鼠接受pbs或300 ng IL-12：fc在肿瘤部位接受手术，然后静脉注射1×10。6车-T细胞或非传导细胞。第29天对小鼠进行安乐死，并对脑、脾淋巴细胞进行FACS分析。BCD45.1定义的CAR-T上流式细胞仪数据的手动选通+TCR-β+CD 34+CD8+CAR+IL-12：FC治疗胶质瘤荷瘤小鼠代表脑标本中的细胞。CCellcnn分析(左面板)显示的所有car-T细胞(紫罗兰)和选定群体(红色)的相对标记分布，以弧形变换标记表达的比例直方图表示；方格图显示中位频率和25。TH和75THCar和CAR+IL-12中所选人群的百分位数：FC组(右面板)，n=每种情况下5只老鼠，代表n=2个独立实验。DT-SNE图显示流式细胞术引导下活瘤内CD8的元标记+不同治疗组的CAR-T细胞；每种颜色代表一种元光彩，并与不同的免疫群体相关联。热图显示中位标记在每个元光泽(数值范围：0-1，黑色和白色)。ECD8频率+在每种情况下，n=每种情况下5只老鼠，代表n=2个独立实验。FLAG 3细胞标记的中位表达嗨PD1嗨CAR-T细胞与LAG 3低层PD1低层CAR+PBS和CAR+IL 12：FC条件下的CAR-T细胞，n=每种情况下5只老鼠，代表n=2个独立实验。数据以平均值±扫描电镜表示。二尾未配对曼-惠特尼T试验(C, E, F)。源数据作为源数据文件提供。
然后我们使用表示机器学习算法cellcnn。30作为一种无偏见、无假设的方法，检测IL-12：FC治疗对CAR-T细胞的影响.我们鉴定出一组CAR-T细胞，其中PD1和LAG 3均呈阳性，IFN-γ和TNF水平较低，与IL-12：FC联合作用后，Car-T细胞表达明显下降(图1)。3C)。利用维数降维法(tsne结合FlowSOM元聚类)对流式细胞仪数据进行可视化，证实了两种不同的car-T细胞簇的存在，即LAG 3。嗨PD1嗨和LAG 3低层PD1低层汽车-T细胞(热图，图1)。三维空间，补充图。三维空间)。特别是，我们观察到LAG 3的频率增加了。低层PD1低层联合治疗中的CAR-T细胞与单纯的CAR-T细胞治疗相比较(图一)。3E)，这也是由手动门控(补充图)确认的。3E)。值得注意的是，IL-12治疗(LAG 3)诱导的人群。低层PD1低层与LAG 3相比，CAR-T细胞在再刺激时产生干扰素-γ和肿瘤坏死因子的能力更强。嗨PD1嗨汽车-T型人口(图1.3F)。我们接下来评估了与T细胞衰竭相关的其他免疫检查点(如TIM3、CD 160、CD 244和CD 73)的表达，它们的配体在髓系和肿瘤细胞上都有表达。31。我们确实观察到LAG 3中所有这些附加标记的表达明显减少。低层PD1低层因此，CAR-T细胞表明这确实是一个不那么疲惫的细胞群体(图)。3F)。由于肿瘤反应迅速，未进行纵向CAR-T表型和功能研究.这些结果表明，IL-12可防止肿瘤浸润的CAR-T细胞功能障碍，并促进CAR-T细胞源性细胞因子的产生.
我们还对脾脏中的CAR-T细胞进行了详细的分析，以探讨IL-12对全身效应的贡献。T-sne与Flow SOM整合在一起，使我们能够识别被定义为IFN-γ的两组car-T细胞。嗨和干扰素-γ低层CAR-T细胞(热图，补充图.)3F，G)，其频率不受白细胞介素-12(补充图)的影响。3H)。这加强了在肿瘤部位局部注射IL-12的理由，以激发免疫抑制性TME，并限制其系统性副作用的风险。
IL-12重组胶质瘤TME内内源性T细胞室
众所周知，IL-12具有在tme中吸收和激活淋巴细胞的能力。13,20。我们用TSNE和流式细胞术联合CD 45检测内源性T细胞向脑TME的募集。+TCR-β+CD 34−T细胞(附图)4A，B)。如图所示。4，这个不带偏见的分析发现了三组内源性T细胞：CD4。+T，CD8+T和T雷格细胞，主要是CD 44+记忆T细胞(热图，图)。4A)。在IL-12治疗的胶质瘤中，我们观察到CD4的频率增加。+T细胞与T细胞频率和计数的减少雷格细胞(图1.4A，补充图。4C)。重要的是，这些效应与CAR-T细胞治疗无关.在所有三个T细胞群体中，特别是在CD4中+T细胞，IL-12：FC导致检查点受体LAG 3和PD1表达下降(图1)。4B)。CD 39，一种与腺苷通路有关的抑制剂分子32，在两种CD4中都有不同的表达水平。+T细胞和CD8+T细胞(图1.4B)。然而，与CD 39协同工作的外显子核苷酸酶CD 73。33，联合治疗后表达降低(附图)。4D)。CD8中LAG 3和PD1水平降低+T细胞和T细胞雷格斯伴随着干扰素-γ的增加(如图所示)。4B)。在T雷格高水平的干扰素-γ同时伴有CD 25的低表达和低的抑制功能，可能预示着从“稳定的”过渡到“脆弱的”T。雷格斯34。为了证实这一概念，我们进一步研究了与T相关的规范特征。雷格抑制功能，如CD 73、ICOS、GITR等。我们将umap与FlowSOM元聚类技术结合应用于CD4上。+Foxp 3+T细胞从内源性T细胞团中输出，如图所示。4A(补充图。5A)。用这种方法，我们证实了两个T的存在。雷格簇，定义为IFN-γ。低层和干扰素-γ嗨 T雷格斯分别有低表达和高表达的干扰素-γ(热图，附图)。5A)，验证了干扰素-γ频率的增加。嗨 T雷格斯在IL-12在场的情况下：FC(附图)。5B)。干扰素-γ嗨 T雷格斯，与干扰素-γ不同低层 T雷格斯，CD 73低表达，ICOS和OX 40表达降低，TNF生成增加。这也与细胞增殖减少有关，如较低的Ki 67含量所显示的，这与免疫抑制的丧失相一致。35(补充图。5C)。总之，这些结果证实肿瘤内IL-12足以增加传统T细胞比调节性T细胞的比率，防止协同抑制分子的上调，并维持IFN-γ在TIL中的产生。
图4：IL-12：FC重塑胶质瘤TME内源性室。A在tcr-β上显示Flow SOM引导的元标记+活CD 45 T细胞+单元格和热图显示每个定义的元光泽(值范围：0-1)的中间标记表达式，而pie图表示三种tcr-β的相对频率。+总tcr-β中的T细胞亚群+T细胞在不同条件下(NT+PBS)n=4，NT+IL-12：FCn=−5，CAR+PBSn=5，CAR+IL-12：FCn=5只小鼠，代表n=2个独立实验)。乙所有TCR-β所显示的选定细胞标记的中位表达+T细胞亚群：CD4、CD8和T雷格斯，(NT+PBS)n=4，NT+IL-12：FCn=5，CAR+PBSn=5，CAR+IL-12：FCn=5只小鼠，代表n=2项独立实验)。C在CD11b上用t-sne图显示Flow SOM引导的图元化+CD 45+单元格和热图显示每个定义的元光泽(值范围：0-1)的中间标记表达式，而饼图表示九种cd11b的相对频率。+CD 45+CD11b细胞亚群+CD 45+细胞在不同的条件下，(NT+PBS)n=4，NT+IL-12：FCn=5，CAR+PBSn=5，CAR+IL-12：FCn=5只小鼠，代表n=2项独立实验)。数据以平均值±扫描电镜表示。普通单向Anova与Dunnett多次比较检验(B)。源数据作为源数据文件提供。
IL-12重塑胶质瘤TME内的髓系室
我们进一步分析了联合治疗所观察到的存活率的改善是否与髓鞘室的改变有关，后者在胶质瘤TME中占免疫细胞的很大比例。36。为此，我们进行了多参数分析，结合脑髓样细胞的FlowSOM代谢(图1)。4C，补充图。6A，B)。如图所示。4C，我们鉴定了两个定义为cdc 1(Cdc 1 C)的树突状细胞群体。+CD11b罗氏)和cdc 2(CD11c)+CD11b嗨)，三组不同的单核细胞衍生细胞(Mdcs)(Ly6C)嗨和Ly6罗氏CD11c−MDCS和Ly6C罗氏CD11c+MDCS37)，两簇小胶质细胞(CD11b)嗨CD 45罗氏MHC-II罗氏小胶质细胞或CD11b嗨CD 45罗氏MHC-II嗨反应性小胶质细胞，一簇单核细胞(Ly6C)嗨MHC-II罗氏)和一种中性粒细胞(CD11b)嗨Ly6G+)(图为热图。4C，补充图。6B)。从本质上说，在IL-12存在的情况下，我们观察到Ly6C的频率增加。嗨和Ly6罗氏CD11c−MDCS和反应性小胶质细胞(图1.4C，补充图。6C)。Il-12：fc治疗可诱导小胶质细胞mhc-Ⅱ的上调，很可能依赖于干扰素-γ。38归纳(附图)6d)。同样，我们观察了抑制性配体PD-L1在IL-12治疗组MDCS上的上调作用(补充图)。6d)。此外，我们发现Arginase1(Arg 1)与免疫抑制性吞噬细胞有关。39，在Ly6C中显著降低。罗氏有IL-12存在的MDCS(附图)。6E、F)。这些结果表明，IL-12介导的内源性T细胞和髓系室的重塑，再加上IL-12对CAR-T细胞功能的正交作用，导致胶质瘤的完全根除。
局部注射IL-12缺乏明显的系统免疫激活作用
鉴于在肿瘤控制中观察到的强烈效果，我们试图验证注射后IL-12：fc的作用仍然局限在颅内肿瘤部位，因为全身注射重组IL-12可能会对人体造成严重的不良反应。40。我们分析了IL-12：FC给药后第4天和第11天小鼠血清中IL-12水平，发现IL-12：FC染毒小鼠在系统循环中的IL-12水平没有明显高于对照组(图二)。5A)。IL-12：FC给药后第4天，IL-12诱导的细胞因子IFN-γ水平略有升高(NT+IL-12：FC和CAR+IL-12：FC分别为139±73和175±59 pg/mL)。5B)和CXCL 9(NT+IL-12：FC和CAR+IL-12：FC分别为103±33和134±76)。5C)，但未检出CXCL 10。5D)。这种作用是短暂的，在第11天恢复到背景水平。此外，对血清中促炎症细胞因子IL-6和GM-CSF水平的分析表明，两组间没有差异(图1)。5 E、F)。综上所述，这一数据表明，局部交付IL-12：FC是伴随着最小的系统影响，同时仍然提供了一个显著的促进肿瘤控制。
图5：IL-12：FC的局部给药对系统的影响最小.在IL-12：FC给药后第4天和第11天用细胞因子珠阵列(CBA，Legendplex)检测血清细胞因子和趋化因子。A伊-12，B干扰素-γ，CCXCL 9，DCXCL 10，EIL-6，和FGM-CSF(NT+PBS)n=4，NT+IL-12：FCn=5，CAR+PBSn=4，CAR+IL-12：FCn=一个实验中的5只老鼠)。图为均值±扫描电镜。普通双向Anova与图基多次比较试验。源数据作为源数据文件提供。
