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肿瘤内IL-12在胶质母细胞瘤临床前模型中的应用

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发表时间:2021-01-20 14:21作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

多形性胶质母细胞瘤(glioblaummultiforme,GBM)是最常见、最具侵袭性的原发性脑癌,迫切需要有效的治疗。以嵌合抗原受体(CAR)为基础的免疫治疗是一种很有前途的治疗方法,但常被高度免疫抑制的肿瘤微环境(TME)所阻碍。在一种免疫能力强的原位GBM小鼠模型中,我们发现仅针对肿瘤特异性表皮生长因子受体变异体III(EGFRvIII)的CAR-T细胞不能完全控制已建立的肿瘤,但结合单个局部给药的IL-12,可获得持久的抗肿瘤反应。IL-12不仅增强了car-T细胞的细胞毒性,而且改变了tme,促进了促炎性CD4的浸润。+T细胞,调节性T细胞(Treg)数量减少,髓系室激活。重要的是,免疫治疗-使IL-12的好处是实现最小的系统性影响。因此,我们的研究结果表明,局部注射IL-12可能是治疗GBM的一种有效的辅助治疗手段。

导言

摘要多形性胶质母细胞瘤是成人最常见的原发性恶性脑肿瘤,约占胶质瘤的60-70%。1。标准治疗包括肿瘤切除、放射治疗和伴发替莫唑胺。由于这些肿瘤的浸润性,在大多数情况下,无论是在原始切除的边缘还是在脑实质的远处结构,都会发生复发。2。结果,患者预后不佳,中位生存期为14.6个月,平均5年生存率<5%。3,4.

T细胞重定向于肿瘤特异性的嵌合抗原受体(CAR)可能适合治疗颅内肿瘤,因为T细胞能够访问中枢神经系统(CNS)并迁移到疾病的浸润部位。以CD 19为导向的car-T细胞治疗不仅对软脑膜白血病浸润有效。5但也有脑实质B细胞淋巴瘤沉积6.

成人双侧脑室注射IL13Rα2-car-T细胞后,局部和远距离清除颅内和脊髓沉积的病例报告表明了该方法在脑卒中中的应用潜力。7,8。然而,与在血液系统恶性肿瘤中观察到的持续的完全缓解形成对比的是,6,在大多数gbm患者中,car-T细胞治疗并没有产生临床效果。9,10。肿瘤异质性和抗原丢失以及高度免疫抑制性肿瘤微环境可能是实现持久抗肿瘤免疫的关键障碍。

一种适应性免疫抑制反应(如程序性细胞死亡配体-1(pd-L1)、吲哚胺-2,3-去氧酶1(IDO 1))和T细胞浸润等增强免疫抑制分子,损害了car-T细胞的效能。雷格斯10,11。这些结果强调需要额外的治疗策略来对抗敌意的TME和克服肿瘤异质性。

IL-12是一种具有较强抑瘤活性的促炎细胞因子,是一种很有前途的联合免疫治疗方法.IL-12可直接支持T细胞的持续细胞毒活性,改善抗原呈递,减轻抗原阴性逃逸,重塑TME内内源性免疫抑制细胞。12,13。Car-T细胞与IL-12联合应用可增强小鼠颅外肿瘤(包括白血病和卵巢癌)的抗肿瘤反应。14,15,16,17。然而,系统性的IL-12缺乏耐受性。18,而通过工程T细胞传递也与严重的毒性有关。19。因此,一种在tme中实现IL-12无全身毒性的传递方法是可取的。13,20.

在此,我们建议使用单个肿瘤内剂量的重组单链IL-12与小鼠IgG 3的FC部分(下称IL-12:FC)结合全身CAR-T细胞治疗。在同基因的GBM小鼠模型中,我们证明了这种联合治疗能彻底根除已建立的胶质瘤,并证明了IL-12对EGFRvIII特异性CAR-T细胞适应度的影响,以及对作为抗肿瘤免疫基础的TME的重塑的影响。这种局部传递的IL-12只造成轻微的全身影响.我们的结果表明,局部注射IL-12可以克服CAR-T细胞治疗GBM所遇到的障碍,并为临床研究中的联合治疗方法提供理论依据。

结果

EGFRvIII-特异性小鼠CAR-T细胞无法控制大的已建立的胶质瘤

我们采用免疫活性原位GL261小鼠胶质瘤模型,评价EGFRvIII特异性小鼠CAR-T细胞的抗肿瘤活性。亲本GL 261与EGFR的胞外部分转导,其中变异Ⅲ突变与小鼠EGFR跨膜结构域融合(图1)。1A),它代表了人类GBM中常见的一种突变。21。利用EGFRvIII特异性mr 1抗体的单链可变片段构建了第二代car。22、小鼠CD 28来源的跨膜结构域、小鼠CD 28和CD3ζ细胞内结构域。将截短的小鼠CD 34与CAR共同表达,以检测CAR转导的T细胞(图1)。1B;补充图。1A)。小鼠T细胞表达EGFRvIII特异性CAR能有效杀伤EGFRvIII+GL 261而非亲本GL 261在体外(附图)1B).

图1:EGFRvIII特异性CAR-T细胞控制新建立的原位肿瘤,但不能控制大肿瘤。

A用逆转录病毒载体转染GL 261,表达小鼠EGFRvIII。EGFRvIII突变部分与小鼠EGFR跨膜区融合,获得表面表达表位的细胞。左面板:流式细胞术检测野生型GL 261(蓝色)和GL 261表达EGFRvIII(红色)。右侧面板:免疫组织化学染色EGFRvIII在骨科植入肿瘤(标尺代表100μm)。四只小鼠有一个典型的肿瘤。B鼠车结构。将小鼠CD 34的C端部分作为标记基因,用T2A肽从CAR结构中分离,其中包括一个具有移植特异性的单链抗体(ScFv)、一个CD8柄和一个CD 28-CD3ζ作为激活域。MR1为EGFRvIII特异性单链抗体,4g7为人CD 19特异性单链抗体,为阴性对照。C“压力实验”。肿瘤植入后第11天或第17天静脉注射CAR-T细胞对肿瘤控制作用的直接比较。D肿瘤植入后第11天接受TBI或TBI的小鼠的典型MRI图像(轴向),随后为CAR-T细胞。E生存曲线(n=3对TBI,n=4对于一个实验中的TBI+CAR小鼠,p=0.0288(*),对数秩检验)和F肿瘤体积量化G典型的MRI图像(轴向平面)的小鼠接受TBI或TBI后,随后的CAR-T细胞在肿瘤植入后第17天。H生存曲线(n=3对TBI,n=4用于TBI+CAR小鼠(来自一个实验)和I肿瘤体积量化源数据作为源数据文件提供。

接下来,我们测试了EGFRvIII导向的CAR-T细胞在荷瘤小鼠体内的有效性。+GL 261肿瘤肿瘤生长的监测使用1特斯拉磁共振成像(1T-MRI)系统.MRI观察肿瘤时(植入后第10天),用5Gy全身照射(TBI)作为准备性淋巴耗竭。为了获得过继转移的T细胞的植入和抗肿瘤效果,需要做好准备性淋巴滤过,这是CAR-T细胞治疗的一个标准组成部分。23。TBI后静脉注射2.5×10。6CAR-T细胞(附图)1C)。术后第7天,CAR-T细胞浸润肿瘤(附图)。1D,E)如CD 34免疫组化所示。肿瘤浸润是抗原特异性的,输注人CD 19特异性的CAR-T细胞(作为阴性对照)没有在肿瘤内积聚(补充图)。1F,G)。在这种情况下,CAR-T细胞给药可使50%的小鼠获得肿瘤清除和长期存活。p=0.0028)(附图。)、肿瘤接种后早期给药的效果。

为了重述单用car-T细胞治疗不足以根除胶质母细胞瘤的临床观察,我们建立了一个“应激”模型,使用的是小剂量的car-T细胞(1×10)。6)在肿瘤植入后的第11天(早期)或第17天(晚期)给药(如图所示)。1C)。早期应用CAR-T细胞可以控制肿瘤的生长,并能显著提高生存率(图一)。1D-F)。相反,过度使用CAR-T细胞会导致肿瘤控制不良和随后的肿瘤生长,而没有提高生存率(图一)。1g-i)。综上所述,这些数据表明,CAR-T细胞只能控制新建立的肿瘤,但不能控制更大的肿瘤,这种情况更接近临床使用CAR-T细胞的阶段。

局部注射单剂量IL-12可提高car-T细胞的疗效。

为了提高已建立的大型胶质瘤的抗肿瘤活性,我们设计了一种联合免疫治疗方法.我们评估了是否使用IL-12:FC(图1)。2A)与CAR-T细胞联合应用可改善晚期EGFRvIII期肿瘤的控制。+GL 261胶质瘤肿瘤植入后第15天,小鼠接受5Gy的TBI,然后在第20天进行一次肿瘤内注射(300 Ng)IL-12:FC(如图所示)。2B)。然后用1×10处理小鼠。6EGFRvIII引导的CAR-T或非转导的T细胞在第21天静脉注射(图1)。2B)。MRI测量的肿瘤体积表明,单次给药(CAR+PBS或NT+IL-12:FC)只能延缓肿瘤的生长,而全身EGFRvIII特异性CAR灌注联合局部IL-12:FC给药可消除大多数治疗小鼠的肿瘤,对小鼠的整体生存有协同作用(图1)。2C-E)。其次,我们评估了IL-12:FC对第二次颅内肿瘤模型CAR-T疗效的影响.在此,我们用颅内植入B16.F10细胞来再现黑色素瘤的脑转移20,24,25。B16.F10表达GD2,这是一种在神经外胚层起源的肿瘤,包括胶质瘤、黑色素瘤和神经母细胞瘤上表达的肿瘤抗原。26(补充图。2A)。在此背景下,我们使用了gd2特异性的第二代car,它基于从k 666抗体中提取的单链片段变异。27。在这个极具侵略性和低免疫原性的模型中28,29对照组小鼠(NT+PBS)中位生存期为15天,而单用NT+IL-12:FC治疗无明显的生存期。值得注意的是,GD2特异性CAR-T细胞的应用改善了NT+pbs和NT+IL-12:FC组(p=0.01)。此外,与单独治疗(NT+IL-12:FC与CAR+IL-12:FC)相比,IL-12:FC和CAR-T细胞联合治疗可显著提高生存率(NT+IL-12:FC)。p < 0.0001; CAR+PBS vs. CAR+IL-12:Fc, p < 0.001) (Supplementary Fig. 2B-D)。这些数据表明,联合IL-12和CAR-T细胞治疗可以促进有效和持续的抗肿瘤反应,即使在免疫原性较差的模型中也是如此。

图2:EGFRvIII特异性CAR-T细胞与局部给药IL-12:FC联合应用可有效控制晚期原位肿瘤。

A将IL 12:FC结构插入哺乳动物表达载体pCEP 4,并将异二聚体IL-12与小鼠IgG 3的FC部分融合。B实验时间表。GL 261 EGFRvIII+第0天在右侧纹状体植入细胞。小鼠植入后第15天接受5 Gy TBI,第17天证实肿瘤植入。第20天,小鼠接受pbs或300 ng IL-12:fc在肿瘤部位接受手术,然后静脉注射1×10。6车-T细胞或非传导细胞。每周监测肿瘤生长情况。C肿瘤体积量化D每组小鼠的典型MRI图像(轴向视图)。E存活曲线(NT+PBS)n=14,CAR+PBSn=19,NT+IL-12:FCn=18,CAR+IL-12:FCn=20来自四个独立实验,(NT+PBS对CAR+PBS)p=0.0375,NT+pbs与NT+IL-12:FCp=0.0001,NT+pbs与CAR+IL-12:FCp < 0.0001, CAR+PBS vs. CAR+IL-12:Fc p=0.0005,NT+IL-12:FC与CAR+IL-12:FCp=0.0176,对数秩检验)。源数据作为源数据文件提供。

局部IL-12治疗脑胶质瘤浸润功能紊乱的CAR-T细胞

为了探讨car-T细胞与IL-12联合作用的机理,我们用23个代表谱系和激活标记的独立参数(补充表)对tme进行了高参数的流式细胞术表征。1)。我们选择了治疗后第8天给药(如图所示)。3A),截至此时点GL 261_EGFRvIII+肿瘤的大小仍然相当(补充图)。3A),以及大量浸润的EGFRvIII-CAR-T细胞。为了进行这一分析,从CD 45.1同基因小鼠中产生了EGFRvIII-CAR-T细胞,以区别于内源性T细胞.大部分浸润的car-T细胞为CD8。+T细胞(附图)3B)Car-T细胞被定义为CD 45.1+TCR-β+CD 34+CD8+细胞(图1.3B)。我们观察到除了CAR-T细胞外,接受局部IL-12:FC的脑肿瘤中EGFRvIII导向的CAR-T细胞的数量与只接受CAR-T细胞和PBS的脑瘤相比没有差异(补充图)。3C),提示肿瘤控制上的差异并不是由于过继转移的T细胞的肿瘤浸润增加所致。

图3:肿瘤内IL-12:FC给药恢复EGFRvIII特异性CAR-T细胞活力.

A实验时间表。GL 261 EGFRvIII+第0天在右侧纹状体植入细胞。小鼠植入后第15天接受5 Gy TBI,第17天证实肿瘤植入。第20天,小鼠接受pbs或300 ng IL-12:fc在肿瘤部位接受手术,然后静脉注射1×10。6车-T细胞或非传导细胞。第29天对小鼠进行安乐死,并对脑、脾淋巴细胞进行FACS分析。BCD45.1定义的CAR-T上流式细胞仪数据的手动选通+TCR-β+CD 34+CD8+CAR+IL-12:FC治疗胶质瘤荷瘤小鼠代表脑标本中的细胞。CCellcnn分析(左面板)显示的所有car-T细胞(紫罗兰)和选定群体(红色)的相对标记分布,以弧形变换标记表达的比例直方图表示;方格图显示中位频率和25。TH和75THCar和CAR+IL-12中所选人群的百分位数:FC组(右面板),n=每种情况下5只老鼠,代表n=2个独立实验。DT-SNE图显示流式细胞术引导下活瘤内CD8的元标记+不同治疗组的CAR-T细胞;每种颜色代表一种元光彩,并与不同的免疫群体相关联。热图显示中位标记在每个元光泽(数值范围:0-1,黑色和白色)。ECD8频率+在每种情况下,n=每种情况下5只老鼠,代表n=2个独立实验。FLAG 3细胞标记的中位表达PD1CAR-T细胞与LAG 3低层PD1低层CAR+PBS和CAR+IL 12:FC条件下的CAR-T细胞,n=每种情况下5只老鼠,代表n=2个独立实验。数据以平均值±扫描电镜表示。二尾未配对曼-惠特尼T试验(C, E, F)。源数据作为源数据文件提供。

然后我们使用表示机器学习算法cellcnn。30作为一种无偏见、无假设的方法,检测IL-12:FC治疗对CAR-T细胞的影响.我们鉴定出一组CAR-T细胞,其中PD1和LAG 3均呈阳性,IFN-γ和TNF水平较低,与IL-12:FC联合作用后,Car-T细胞表达明显下降(图1)。3C)。利用维数降维法(tsne结合FlowSOM元聚类)对流式细胞仪数据进行可视化,证实了两种不同的car-T细胞簇的存在,即LAG 3。PD1和LAG 3低层PD1低层汽车-T细胞(热图,图1)。三维空间,补充图。三维空间)。特别是,我们观察到LAG 3的频率增加了。低层PD1低层联合治疗中的CAR-T细胞与单纯的CAR-T细胞治疗相比较(图一)。3E),这也是由手动门控(补充图)确认的。3E)。值得注意的是,IL-12治疗(LAG 3)诱导的人群。低层PD1低层与LAG 3相比,CAR-T细胞在再刺激时产生干扰素-γ和肿瘤坏死因子的能力更强。PD1汽车-T型人口(图1.3F)。我们接下来评估了与T细胞衰竭相关的其他免疫检查点(如TIM3、CD 160、CD 244和CD 73)的表达,它们的配体在髓系和肿瘤细胞上都有表达。31。我们确实观察到LAG 3中所有这些附加标记的表达明显减少。低层PD1低层因此,CAR-T细胞表明这确实是一个不那么疲惫的细胞群体(图)。3F)。由于肿瘤反应迅速,未进行纵向CAR-T表型和功能研究.这些结果表明,IL-12可防止肿瘤浸润的CAR-T细胞功能障碍,并促进CAR-T细胞源性细胞因子的产生.

我们还对脾脏中的CAR-T细胞进行了详细的分析,以探讨IL-12对全身效应的贡献。T-sne与Flow SOM整合在一起,使我们能够识别被定义为IFN-γ的两组car-T细胞。和干扰素-γ低层CAR-T细胞(热图,补充图.)3F,G),其频率不受白细胞介素-12(补充图)的影响。3H)。这加强了在肿瘤部位局部注射IL-12的理由,以激发免疫抑制性TME,并限制其系统性副作用的风险。

IL-12重组胶质瘤TME内内源性T细胞室

众所周知,IL-12具有在tme中吸收和激活淋巴细胞的能力。13,20。我们用TSNE和流式细胞术联合CD 45检测内源性T细胞向脑TME的募集。+TCR-β+CD 34T细胞(附图)4A,B)。如图所示。4,这个不带偏见的分析发现了三组内源性T细胞:CD4。+T,CD8+T和T雷格细胞,主要是CD 44+记忆T细胞(热图,图)。4A)。在IL-12治疗的胶质瘤中,我们观察到CD4的频率增加。+T细胞与T细胞频率和计数的减少雷格细胞(图1.4A,补充图。4C)。重要的是,这些效应与CAR-T细胞治疗无关.在所有三个T细胞群体中,特别是在CD4中+T细胞,IL-12:FC导致检查点受体LAG 3和PD1表达下降(图1)。4B)。CD 39,一种与腺苷通路有关的抑制剂分子32,在两种CD4中都有不同的表达水平。+T细胞和CD8+T细胞(图1.4B)。然而,与CD 39协同工作的外显子核苷酸酶CD 73。33,联合治疗后表达降低(附图)。4D)。CD8中LAG 3和PD1水平降低+T细胞和T细胞雷格斯伴随着干扰素-γ的增加(如图所示)。4B)。在T雷格高水平的干扰素-γ同时伴有CD 25的低表达和低的抑制功能,可能预示着从“稳定的”过渡到“脆弱的”T。雷格斯34。为了证实这一概念,我们进一步研究了与T相关的规范特征。雷格抑制功能,如CD 73、ICOS、GITR等。我们将umap与FlowSOM元聚类技术结合应用于CD4上。+Foxp 3+T细胞从内源性T细胞团中输出,如图所示。4A(补充图。5A)。用这种方法,我们证实了两个T的存在。雷格簇,定义为IFN-γ。低层和干扰素-γ T雷格斯分别有低表达和高表达的干扰素-γ(热图,附图)。5A),验证了干扰素-γ频率的增加。 T雷格斯在IL-12在场的情况下:FC(附图)。5B)。干扰素-γ T雷格斯,与干扰素-γ不同低层 T雷格斯,CD 73低表达,ICOS和OX 40表达降低,TNF生成增加。这也与细胞增殖减少有关,如较低的Ki 67含量所显示的,这与免疫抑制的丧失相一致。35(补充图。5C)。总之,这些结果证实肿瘤内IL-12足以增加传统T细胞比调节性T细胞的比率,防止协同抑制分子的上调,并维持IFN-γ在TIL中的产生。

图4:IL-12:FC重塑胶质瘤TME内源性室。

A在tcr-β上显示Flow SOM引导的元标记+活CD 45 T细胞+单元格和热图显示每个定义的元光泽(值范围:0-1)的中间标记表达式,而pie图表示三种tcr-β的相对频率。+总tcr-β中的T细胞亚群+T细胞在不同条件下(NT+PBS)n=4,NT+IL-12:FCn=−5,CAR+PBSn=5,CAR+IL-12:FCn=5只小鼠,代表n=2个独立实验)。乙所有TCR-β所显示的选定细胞标记的中位表达+T细胞亚群:CD4、CD8和T雷格斯,(NT+PBS)n=4,NT+IL-12:FCn=5,CAR+PBSn=5,CAR+IL-12:FCn=5只小鼠,代表n=2项独立实验)。C在CD11b上用t-sne图显示Flow SOM引导的图元化+CD 45+单元格和热图显示每个定义的元光泽(值范围:0-1)的中间标记表达式,而饼图表示九种cd11b的相对频率。+CD 45+CD11b细胞亚群+CD 45+细胞在不同的条件下,(NT+PBS)n=4,NT+IL-12:FCn=5,CAR+PBSn=5,CAR+IL-12:FCn=5只小鼠,代表n=2项独立实验)。数据以平均值±扫描电镜表示。普通单向Anova与Dunnett多次比较检验(B)。源数据作为源数据文件提供。

IL-12重塑胶质瘤TME内的髓系室

我们进一步分析了联合治疗所观察到的存活率的改善是否与髓鞘室的改变有关,后者在胶质瘤TME中占免疫细胞的很大比例。36。为此,我们进行了多参数分析,结合脑髓样细胞的FlowSOM代谢(图1)。4C,补充图。6A,B)。如图所示。4C,我们鉴定了两个定义为cdc 1(Cdc 1 C)的树突状细胞群体。+CD11b罗氏)和cdc 2(CD11c)+CD11b),三组不同的单核细胞衍生细胞(Mdcs)(Ly6C)和Ly6罗氏CD11cMDCS和Ly6C罗氏CD11c+MDCS37),两簇小胶质细胞(CD11b)CD 45罗氏MHC-II罗氏小胶质细胞或CD11bCD 45罗氏MHC-II反应性小胶质细胞,一簇单核细胞(Ly6C)MHC-II罗氏)和一种中性粒细胞(CD11b)Ly6G+)(图为热图。4C,补充图。6B)。从本质上说,在IL-12存在的情况下,我们观察到Ly6C的频率增加。和Ly6罗氏CD11cMDCS和反应性小胶质细胞(图1.4C,补充图。6C)。Il-12:fc治疗可诱导小胶质细胞mhc-Ⅱ的上调,很可能依赖于干扰素-γ。38归纳(附图)6d)。同样,我们观察了抑制性配体PD-L1在IL-12治疗组MDCS上的上调作用(补充图)。6d)。此外,我们发现Arginase1(Arg 1)与免疫抑制性吞噬细胞有关。39,在Ly6C中显著降低。罗氏有IL-12存在的MDCS(附图)。6E、F)。这些结果表明,IL-12介导的内源性T细胞和髓系室的重塑,再加上IL-12对CAR-T细胞功能的正交作用,导致胶质瘤的完全根除。

局部注射IL-12缺乏明显的系统免疫激活作用

鉴于在肿瘤控制中观察到的强烈效果,我们试图验证注射后IL-12:fc的作用仍然局限在颅内肿瘤部位,因为全身注射重组IL-12可能会对人体造成严重的不良反应。40。我们分析了IL-12:FC给药后第4天和第11天小鼠血清中IL-12水平,发现IL-12:FC染毒小鼠在系统循环中的IL-12水平没有明显高于对照组(图二)。5A)。IL-12:FC给药后第4天,IL-12诱导的细胞因子IFN-γ水平略有升高(NT+IL-12:FC和CAR+IL-12:FC分别为139±73和175±59 pg/mL)。5B)和CXCL 9(NT+IL-12:FC和CAR+IL-12:FC分别为103±33和134±76)。5C),但未检出CXCL 10。5D)。这种作用是短暂的,在第11天恢复到背景水平。此外,对血清中促炎症细胞因子IL-6和GM-CSF水平的分析表明,两组间没有差异(图1)。5 E、F)。综上所述,这一数据表明,局部交付IL-12:FC是伴随着最小的系统影响,同时仍然提供了一个显著的促进肿瘤控制。

图5:IL-12:FC的局部给药对系统的影响最小.

在IL-12:FC给药后第4天和第11天用细胞因子珠阵列(CBA,Legendplex)检测血清细胞因子和趋化因子。A伊-12,B干扰素-γ,CCXCL 9,DCXCL 10,EIL-6,和FGM-CSF(NT+PBS)n=4,NT+IL-12:FCn=5,CAR+PBSn=4,CAR+IL-12:FCn=一个实验中的5只老鼠)。图为均值±扫描电镜。普通双向Anova与图基多次比较试验。源数据作为源数据文件提供。

讨论

在免疫抑制性TME面前支持CAR-T细胞功能的方法是实现对包括GBM在内的实体肿瘤的持久抗肿瘤免疫的方法。在此,我们在一种胶质瘤的原位同基因模型中表明,单次肿瘤内注射IL-12:FC和系统输注CAR-T细胞可导致晚期肿瘤的根除,而单次治疗都不能控制肿瘤的生长。CAR-T细胞与局部IL-12联合应用同样提高了CAR-T细胞对侵袭性和低免疫原性B16.F10肿瘤的治疗效果。我们证明,CAR-T和局部IL-12联合治疗的好处是多方面的,因为IL-12的使用会影响过继转移的CAR-T细胞、内源性T细胞室以及TME中的髓样细胞。

在血液学和实体瘤的临床前模型中,IL-12已被证明能提高car-T细胞的疗效。14,16。在此,我们发现在胶质瘤TME中,IL-12治疗导致car-T细胞表达高水平的PD1和LAG 3的比例降低,这两种抑制性受体与CD8的功能降低有关。+T细胞31。IL-12暴露导致PD1比例增加。低层LAG 3低层Car-T细胞能够在tme内维持其效应功能,这表现在它们能够在再刺激时分泌促炎细胞因子,如干扰素-γ和肿瘤坏死因子,并下调与T细胞功能障碍相关的抑制性受体。41.

在内源性T细胞室内,我们的结果表明,IL-12的使用会重新调节CD4之间的平衡。+效应T细胞与CD4+ T雷格有利于CD4的细胞+效应T群(IFNγ)+)。T的缩减雷格斯在GL 261和gcs 005脑胶质瘤前模型中,IL-12治疗对TIL室的调节作用已被证明是一种重要的调节作用。20,42,43,44。我们观察到CD4增加。+效应记忆T细胞,提示IL-12在介导CD4细胞浸润中起重要作用。+T细胞以前的研究表明CD4的耗竭+T细胞导致IL-12治疗完全失效。43表明这些效应细胞在IL-12介导的疗效中起主要作用.最近一项利用GL 261胶质瘤模型的研究表明,缺乏CD 73可以提高抗pd 1和抗ctla-4免疫检查点的治疗效果。45。在我们的系统中,联合应用IL-12和car-T细胞可降低CD4上CD 73的表达。+和CD8+T细胞逆转晚期胶质瘤TME中ATP/腺苷平衡的研究33.

在直接修饰T细胞的同时,有报道称IL-12也能使髓系室向炎性表型倾斜。12,43。髓系室在GBM免疫抑制中起着重要作用,免疫抑制性髓系细胞的蓄积在肿瘤分级较高时更为明显。36。结果表明,与单纯接受Car-T细胞的小鼠相比,IL-12诱导小鼠脑TME中MDCS和反应性小胶质细胞增加,提示IL-12有重建髓系室的能力。MHC II级增加+MDCS和小胶质细胞可能支持抗原提呈46因此,这可能是内源性CD4浸润增加的原因之一。+T细胞Arg 1表达的降低证实了CNS侵袭髓系细胞(MDCS)的增强作用。Arg 1水平与TME内髓系细胞炎症能力降低有关39,47。相反,IL-12的存在导致MDCS上PD-L1的上调。因此,虽然IL-12诱导的Pd-L1在MDCS上的表达并没有导致肿瘤的逃逸,但它却为抗Pd-L1抗体治疗与CAR-T和IL-12联合应用提供了数据驱动的理论基础。

虽然IL-12支持抗肿瘤免疫的潜力早已被人们所认识,但其临床应用却因其狭窄的治疗指标而受到限制。瞬变48或可调节的表达式19在肿瘤特异性T细胞提供替代途径来限制IL-12在肿瘤部位的传递.然而,在nfat反应启动子下分泌单链形式的IL-12的临床应用表明,这种修饰并没有阻止IL-12和IFN-γ的峰值水平,造成了显著的毒性。19。在本研究中使用单剂量IL-12:FC的直接局部注射,可以在限制全身毒性的同时维持肿瘤微环境中观察到的局部益处;我们只发现IL-12诱导的细胞因子如干扰素-γ和CXCL 9的瞬时上调,在注射后11天内得到解决。在第一阶段的可行性研究中,IL-12的脑内表达被证明是安全的,其中一种编码药物诱导的IL-12基因的腺病毒被传送到切除腔。49.

我们的工作目标是结合局部注射IL-12和CAR-T细胞治疗的免疫学探索。虽然我们相信我们的发现有临床相关性,但在临床翻译之前还必须考虑一些额外的因素。首先,肿瘤抗原的表达可以是异质性的。例如,与我们的模型相反,EGFRvIII并不是在所有GBM病例上都表达的,而且在肿瘤中它的表达常常是可变的。此外,使用疫苗或car-T方法针对EGFRvIII的临床研究已经描述了抗原丢失和肿瘤逃逸。10,50,51。因此,IL-12:fc/car-T细胞治疗GBM可能需要多种抗原的car靶向治疗。52.

其次,在标准治疗失败的进展性GBM的临床背景下,通常使用高剂量的皮质类固醇来减轻脑水肿。皮质类固醇可以混淆来自car-T和IL-12:fc的免疫反应。在这种情况下的一项临床研究中,应该包括一些在试验中没有接受皮质类固醇的患者。在以前的一项针对复发的GBM的CAR-T细胞试验中,招募这样的病人是可行的。10。值得注意的是,短期服用糖皮质激素治疗汽车免疫毒性并不会减少car-T植入或活动。53。总的来说,考虑到GBM标准治疗后的不良结果,我们的预期是成功的免疫治疗将更早地用于皮质类固醇的使用较少考虑的治疗。

总之,我们的数据表明,IL-12可以形成TME,并将其重新编程到支持T细胞介导的抗肿瘤免疫的环境中。虽然单用IL-12治疗并不足以持续根除肿瘤,但结合检查点抑制剂或激动剂抗体的联合治疗已经在临床前模型中产生了完全的反应和抵抗。20,43,48。然而,这种方法的临床应用可能由于检查点阻断抗体在血液、脑屏障和肿瘤床上的有限穿透而受到阻碍,而全身毒性的发生率是显著的。在这里,我们证明单剂量的肿瘤内IL-12:FC足以维持CAR-T细胞的适应能力,并能介导大鼠胶质瘤的完全反应。

综上所述,我们的研究结果支持使用IL-12来克服car-T细胞治疗GBM所遇到的障碍。10。这种组合方法可能会创造一种环境,在这种环境中,car-T细胞可以很容易地定位于局部和远处的肿瘤部位。10,54-能介导持续的抗肿瘤免疫。我们现在计划将这种单一剂量的肿瘤内白细胞介素-12联合治疗方法转化为对GBM患者的临床研究。


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