直接和间接内分泌介导抑制人子宫内膜CD8+T细胞毒性

子宫内膜(EM)CD8+T细胞的调节是成功繁殖和抵御病原体的关键。抑制CD8+T细胞对于促进植入和妊娠的耐受性环境是必要的。然而，管理这一进程的机制仍然不明确。性激素可以直接控制免疫细胞上的免疫反应，并通过组织环境间接控制免疫反应。当雌二醇(E)的作用2)、孕酮(P)和转化生长因子(β)对EM CD8+T细胞的杀伤活性、穿孔素和颗粒酶活性被E直接抑制。2另外，极化的EM上皮细胞与P，而不是E共同孵育。2，增加转化生长因子β的分泌。这些发现表明E2直接作用于CD8+T细胞，抑制细胞毒活性；P通过诱导转化生长因子β产生间接作用。了解调节子宫内膜CD8+T细胞的机制对于优化生殖成功和制定预防生殖器感染和妇科癌症的保护策略至关重要。

人类女性生殖道(FRT)中的粘膜免疫系统(FRT)受到精确的调节，以优化受精、着床和怀孕的条件，同时提供性传播感染(STIs)的保护。1。与FRT中的其他部位不同，子宫内膜必须保护自己免受性传播的病原体的侵害，同时允许异基因精子的存在，并支持免疫上不同的胎儿。FRT中这种独特平衡的关键是性激素，雌二醇(E)。2)和孕酮(P)，它们由卵巢分泌，其水平在月经周期期间波动，从而调节先天免疫和适应性免疫的多个方面。2,3,4,5。在增殖期，E2在低浓度下存在。然而，E2排卵时水平迅速下降，在分泌期，在受精和着床期间再次升高。相反，在整个增殖期和排卵期，P水平仍然很低，然后在分泌中期达到高峰。E2P直接作用于FRT免疫细胞、上皮细胞和成纤维细胞，调节细胞因子、趋化因子和生长因子的产生，进而调节天然免疫系统和适应性免疫系统。性激素的这些直接和间接作用对于成功的生殖是必不可少的，并且影响对性传播感染易感性的方式，在上(子宫内膜，内膜)和下(外宫颈，阴道)FRT的位置特异性。

T细胞是frt中适应性免疫保护的核心，是子宫内膜白细胞的主要组成部分(30-60%)。6,7,8,9。测定CD8+T细胞的细胞毒性潜力，White等。用重定向裂解法评价FRT混合细胞悬液杀伤靶细胞的能力10。这些研究表明，子宫内膜CD3+CD8+T细胞的毒性活性受月经周期的影响。细胞毒活性在增殖期升高，分泌期抑制。有趣的是，绝经后妇女子宫内膜的细胞毒性活性明显高于绝经前妇女周期中任何一点的活性。细胞周期依赖性抑制，CD8+T细胞总数无明显变化。最近，我们利用延时成像系统测量了子宫内膜纯化的CD8+T细胞对子宫内膜的直接杀伤作用，证实了月经周期细胞毒性活性的变化和绝经后活性的增加。11。子宫内膜CD8+T细胞毒性活性的最大抑制与受精和着床可能发生的时间一致，因此可能是避免母体子宫内膜CD8+T细胞识别和排斥精子和胎儿细胞的一种机制。1。然而，尚未解决的是月经周期中激素变化的程度，它直接或间接地调节子宫内膜中CD8+T细胞的细胞毒性活动。

众所周知，性激素在局部和系统地作用，对适应性免疫和CD8+T细胞有着广泛的免疫效应。E2影响T细胞的成熟、分化和功能。其他人已经证明CD8+T细胞表达ER。α和ERβ受体。例如，在啮齿动物中，E2通过ER的信号α被证明是CD8+T细胞完全分化所必需的。12,13。在人外周血单个核细胞(PBMC)中，逆转录病毒介导的CD8+T细胞与E共同孵育。2据报道，他们的颗粒酶B和干扰素-γ的表达增加。14。相反，通过使用人CD8+T细胞，P在体外刺激时会降低IFN-γ的产生，但其机制尚待确定。15。除产量下降外，其他研究表明P通过诱导IFN-γ基因高甲基化而损害抗原非特异性CD8 T记忆细胞的免疫保护功能。16.

除了性激素的直接作用外，其他可溶性介质还能调节CD8+T细胞的细胞毒性。例如，转化生长因子β通过抑制穿孔素抑制肠道CD8+T细胞毒性，而T-bet、Eomes或颗粒酶B无改变。17。我们最近报道，绝经前和绝经后子宫内膜CD8+T细胞的毒性作用也易被tfgβ抑制，但绝经后β的抑制作用减弱。11。在动物实验中，我们发现转化生长因子β是由来自FRT的上皮细胞和成纤维细胞在激素控制下产生的。2治疗增加生物活性转化生长因子的基底外侧分泌β在啮齿动物身上18,19。然而，转化生长因子β调节子宫内膜CD8+T细胞功能的机制尚不清楚。

性激素和转化生长因子的作用βCD8+T细胞在人体内的细胞毒活性对妇女的健康有着重要的影响，特别是与成功妊娠、免疫性不孕和性传播疾病的预防有关。本研究的目的是评价E的作用。2、P和TGFβ调节子宫内膜CD8+T细胞的杀伤能力。我们的结果表明E2和转化生长因子β直接作用于子宫内膜(EM)CD8+T细胞，显著抑制细胞毒活性及细胞内穿孔素和颗粒酶A水平。相反，P对CD8+T细胞无直接影响，但能刺激TGF。βEM上皮细胞分泌。这些研究提供了对控制子宫内膜细胞毒性活动以增加生殖潜能的机制的深入了解。

雌二醇和转化生长因子β抑制子宫内膜CD8+T细胞的细胞毒活性

我们曾证明EM CD8+T细胞的细胞毒活性在月经周期的分泌期受到抑制，更年期后增强。10,11。在本研究中，我们研究性激素是否直接参与抑制CD8+T细胞的细胞毒活性。用E预处理T细胞48h。2或P在体内已知有生理效应的浓度20或用转化生长因子β测定细胞杀伤前2小时。11。用cfse标记的异基因靶细胞与对照组和处理后的CD8+T细胞共培养细胞毒活性，用延时成像法测定死亡细胞数。11。根据我们对最优杀伤的早期研究，我们选择了1：1的效应靶比，并测量了培养前6小时的细胞平均杀伤率。如图所示。1在典型的时间历程研究中，相对于靶细胞，我们发现在异基因EM CD8+T细胞存在的情况下，死亡靶细胞的数量显著增加。此外，用E预处理CD8+T细胞2(无花果)1(A)或转化生长因子(β)。1(C)，但不包括P(图1)。1B)细胞杀伤明显减少。图形1D-f表明激素和转化生长因子β处理对细胞毒性的影响，分别是死亡细胞总数和死亡靶细胞数的翻倍变化，后者是单独比较不同背景死亡率的实验。与我们有代表性的调查结果相一致，相对于对照，E2(无花果)1(D)和转化生长因子(β)。1(F)，但不包括P(图1)。1(E)细胞杀伤明显减少。图形1F证实了我们先前的结果11转化生长因子β治疗EM CD8+T细胞后，CD8+T细胞的杀伤活性明显降低。

E抑制Em、CD8+T细胞穿孔素和颗粒酶A的表达2

为了探讨抑制细胞毒性T细胞活性的机制，我们检测了CD8+T细胞与E预孵育后穿孔素、颗粒酶A(GZA)和颗粒酶B(GZB)的表达。2或P.EM组织被消化以获得混合细胞悬液，并在流式细胞术分析之前对细胞内的细胞毒性分子进行染色。11。图形2A包含有代表性的穿孔素、GZA和GZB CD8+T细胞的直方图覆盖，表明穿孔素和GZA对E的反应呈下降趋势。2但不是P。对五个不同科目的实验进行分析(图一)。2(B)，证明E2显著降低CD8+T细胞穿孔素和GZA的胞内含量(MFI)。相反，E2对GZB无显著影响。激素治疗也影响细胞表达细胞毒性分子的百分比，如图所示。2与E孵育后，穿孔素和GZA细胞的阳性细胞百分比显著下降。2。总的来说，这些研究表明E2降低EM CD8+T细胞穿孔素和GZA的表达，这与细胞毒性降低有关。此外，由于P对穿孔素、GZA和GZB细胞内表达或阳性细胞百分比均无影响，提示这些变化是激素特异性的。

雌二醇对穿孔素和颗粒酶A的EM CD 103+和CD 103-CD8+T细胞表达的抑制作用

在以前的研究中，我们证明人类EM CD8+T细胞由组织驻留细胞和非驻留CD8+T细胞组成，分别为CD 103+和CD 103−。8,11。比较CD 103+和CD 103−CD8+T细胞的细胞毒性，CD 103+细胞的直接杀伤活性和细胞毒分子的表达均低于CD 103−T细胞。11。因此，在本研究中，我们探讨了E的观察效应2在降低细胞毒性分子表达方面，CD 103+和CD 103−T细胞的表达均受到影响。EM组织混合细胞悬液与E孵育2流式细胞仪测定颗粒含量前48小时。图形3A举例说明用雌二醇治疗前后穿孔素、GZA和GZB的含量。如图所示。3B，使用来自多个患者的匹配样本，E2显著抑制组织驻留(CD 103+)和非驻留(CD 103−)CD8+T细胞中穿孔素和GZA的含量。相反，E2对GZB无影响。有趣的是，如图所示。3C、E2抑制含穿孔素的CD 103+和CD 103−CD8+T细胞百分率，但对GZA或GZB阳性细胞百分比无影响。这些发现表明E2调节CD 103+和CD 103−CD8+T细胞，抑制细胞毒性分子的水平是独特的，因为每一种对E的细胞毒性反应都是独一无二的。2是分开的和不同的。这与我们先前的研究结果一致，即绝经期状态同样会影响居民和非居民的T细胞。11，表明组织驻留并不会改变激素控制的敏感性。

转化生长因子β抑制EM CD8+T细胞穿孔素、颗粒酶A和B含量

其次，我们探讨了转化生长因子β介导的细胞毒性抑制的机制。混合细胞悬液中的CD8+T细胞在48h后用穿孔素、GZA和GZB分析与转化生长因子(β)孵育，如直方图所示(见图)。4(A)细胞内含量的分析(图1。4(B)转化生长因子β可显著降低细胞内三种细胞毒性分子的浓度。在我们的病人中，我们观察到穿孔素的表达范围很广，从0.5%到32.6%不等，如本研究和我们先前发表的报告所示11。在无花果中呈现的有代表性的情节。2和4来自两个不同的病人。图形2是来自一个低穿孔素表达的病人，而图。4来自一个高表达穿孔素的病人。这些资料是反映病人之间表达范围的例子。我们还发现，转化生长因子β降低了穿孔素阳性的CD8+T细胞的百分率，但对表达GZA和GZB的细胞百分比没有影响。4c)。接下来我们研究了转化生长因子β对CD 103+和CD 103−CD8+T细胞区细胞毒性分子的影响。5a)。如图所示。5B、β可显著降低CD 103+和CD 103−CD8+T细胞中穿孔素、GZA和GZB的表达。有趣的是，转化生长因子β减少了穿孔素阳性细胞的数量，但对GZA或GZB阳性细胞无明显影响。5c)。

孕酮促进极化EM上皮细胞分泌转化生长因子β

除了它们的直接作用外，性激素还通过作用于组织环境中的相邻细胞间接调节免疫细胞。众所周知，转化生长因子β是由子宫内膜上皮细胞和基质细胞合成和分泌的。18,19。我们在啮齿动物模型中的研究表明，极化的EM上皮细胞优先分泌生物活性的转化生长因子β进入基底外侧室。18。因此，我们分析极化的人EM上皮细胞产生转化生长因子β。如图所示。6A、转化生长因子β由基底优先释放的极化上皮细胞构成，向底层组织方向分泌。因为我们以前已经证明人的极化上皮细胞对E有激素反应221，我们假设E2上皮细胞分泌转化生长因子β可能是调节CD8+T细胞杀伤活性的次要机制。为了检验这一点，我们将极化的EM上皮细胞培养到汇合处，并与E共同孵育。2或P在收集基底外侧介质前48h。意料之外，如有代表性的实验所示(图)。6(B)我们发现，与对照组相比，P增加了转化生长因子β的基底外侧分泌，E2对转化生长因子β的产生无影响。为了更全面地分析这一反应，我们对6个实验数据进行了规范化处理，将转化生长因子β的产生表示为相对于对照组细胞的折叠变化，并比较了不同分泌背景的对照细胞的实验结果。如图所示。6(C)正常化后，P而不是E2连续刺激EM上皮细胞分泌转化生长因子β。总之，这些研究表明，在月经周期中，在孕酮的影响下，EM上皮细胞分泌大量的转化生长因子β进入组织室，抑制CD8+T细胞的溶解活性。

我们的研究表明E2转化生长因子β通过下调细胞内穿孔素、GZA或GZB的表达，直接抑制EM CD8+T细胞的杀伤活性。此外，我们还证明了E2直接作用于CD8+T细胞抑制杀伤，P无直接作用。但P能抑制EM上皮细胞分泌转化生长因子β，这可能是体内控制细胞毒活性的间接机制。总体上，如图所示。7我们的研究结果显示，人类子宫内膜中激素依赖的直接和间接机制能够抑制绝经前妇女在月经周期分泌期的CD8+T细胞溶解能力，如果没有这种机制，成功的植入和怀孕是不可能发生的。

CD8+T细胞是免疫保护的关键效应细胞，但其在子宫内膜中的功能受到严格调控，以避免排斥半异基因胎儿。1,24。我们先前的研究表明，与绝经后妇女相比，绝经前妇女EM CD8+T细胞毒性活动受到抑制，尤其是在月经周期的分泌期，这表明性激素是CD8+T细胞毒性的关键调节因子。10,11。然而，性激素在抑制EM、CD8+T细胞的细胞毒性作用方面的直接作用还未见报道。因此，我们研究性激素是否直接参与抑制绝经前妇女CD8+T细胞的细胞毒性活动。

我们发现E2直接抑制EM CD8+T细胞的杀伤活性，杀伤能力的降低是由于CD8+T细胞中细胞毒性分子穿孔素和GZA表达减少所致。与我们的研究相反，我们的研究没有显示E的作用。2关于GZB表达式，Navarro等人。14发现E2增加GZB在血液中的表达。观察到的差异很可能是因为他们使用了含有CD8+T细胞的Buffy外套血悬液，这些T细胞经逆转录病毒传递和激活，而我们则使用纯化的EM CD8+T细胞来测量E的作用。2。此外，为了检测GZB的产生，他们使用了含有CD4+和CD8+T细胞的总T细胞，而我们使用的是纯化的CD8+T细胞。活化状态是否改变EM CD8+T细胞对E的反应性2仍有待确定。

与E相反2P对EM CD8+T细胞的杀伤活性和细胞毒颗粒含量无直接影响。这种缺乏效应可能是由于此前报道的CD8+T细胞缺乏核P受体所致。25并与P治疗外周血CD8+T细胞后P细胞因子产生和T细胞增殖减少的结果作了对比，作者将此归因于P膜受体。15。这些差异表明P效应对P受体的存在或外周血CD8+T细胞与EM CD8+T细胞功能差异有一定的特异性。

证实了我们先前的结果，我们发现在短期治疗后，mtfβ迅速抑制了EM的细胞毒性功能。11。在本研究中，我们证明TFGβ的抑制作用是由于细胞内细胞毒性分子(穿孔素、GZA和GZB)的减少所致。鉴于在我们的实验环境中，细胞在细胞毒性分析之前和细胞内毒性分子评估前分别用转化生长因子β预处理2h和48h，其快速调节细胞毒性能力的机制尚不清楚，有待进一步研究。其他研究表明穿孔素和颗粒酶协同诱导CD8+T细胞识别的靶细胞凋亡。26。除了减少GZA和GZB外，我们的发现还显示穿孔素的细胞内含量和阳性细胞百分比都有所下降。这与其他报道的结果是一致的：转化生长因子β通过减少胃肠道穿孔素阳性的CD8+T细胞数量而抑制细胞毒性功能。17这可能是转化生长因子β调控组织中CD8+T细胞杀伤活性的一般机制之一。据我们所知，我们的发现首先证明了E2培养的转化生长因子β既能降低穿孔素阳性CD8+T细胞的百分率，又能降低细胞内毒性分子的含量。

我们和其他人已经证明转化生长因子β是由frt的上皮细胞和成纤维细胞在啮齿动物模型的激素控制下产生的。18,19。有趣的是，在人的子宫内膜中，转化生长因子β的表达在月经周期的分泌期增加。27，当EM CD8+T细胞的细胞毒活性受到最大抑制时10,11。我们的研究扩展了这些发现，证明P直接作用于人EM上皮细胞，刺激转化生长因子β的分泌。有趣的是，我们发现E2对上皮细胞转化生长因子β的产生没有影响，这与我们以前在啮齿动物模型上的研究结果形成对比。18。与我们的结果一致的是，早期对非人类灵长类动物的研究还发现，P在子宫内膜中增加了β2的mrna。28。我们以前已经证明了E的广泛作用。2治疗上皮细胞，包括刺激细胞内基因，如胞浆5‘-核苷酸酶和P受体29与其他具有广泛抗菌、抗病毒和抗真菌活性的抗菌肽一起分泌。21,30。我们在本研究中的发现强调了激素对上皮细胞的选择性作用。其分泌后是否对磷有反应，其他激素依赖的步骤是否进一步加工转化生长因子β以提高生物活性仍有待确定。31,32。综合来看，这些发现表明E2P通过间接作用于上皮细胞，增加转化生长因子β的产生，从而精确地调节子宫内膜的适应性免疫。

月经周期分为增殖期和分泌期，在此期间发生受精和着床。另一些研究表明，排卵后不久，在月经周期的分泌期，P水平急剧上升，维持10-12天。33。伴随着P的增加，E中分泌上升。2这是植入所必需的。相反，周期的增殖期主要是E。2。这些激素变化控制着绝经前妇女子宫内膜的周期性重塑，以优化植入条件。根据我们在本研究中的发现，我们建议在绝经前妇女中，E。2直接抑制EM、CD8+T细胞的杀伤活性，降低细胞内穿孔素和GZA的含量。在排卵和子宫内膜特有的情况下，P诱导上皮细胞产生转化生长因子β，进而作用于EM CD8+T细胞，进一步抑制细胞毒活性，降低穿孔素、GZA和GZB的表达，在月经周期分泌期达到最大抑制作用。7).

在我们之前的研究中，我们发现绝经后妇女的细胞毒活性显著增加。10,11。绝经后性激素水平(E)2P)下降，保持低位不变。我们在这项研究中的结果表明，性激素的降低消除了EM CD8+T细胞的直接和间接抑制机制，从而增加了细胞毒性活性和细胞内细胞毒性分子的含量，这与我们先前的研究结果一致。11.

我们和其他人已经证明，CD8+T细胞在子宫内膜由CD 103+和CD 103−T细胞组成，可能分别代表组织驻留T细胞和非驻留记忆T细胞。我们发现CD 103−细胞毒性活性和细胞内毒性分子含量明显高于CD 103+EM CD8+T细胞。11。在这里，我们研究了E的调节效应。2转化生长因子β优先于任何一组。我们发现E2转化生长因子β同样影响CD 103+和CD 103−CD8+T细胞，降低细胞毒分子的含量。这些发现表明，组织型和非常驻型CD8+T细胞同样容易受到性激素的调节，而向组织居住状态的转变不会改变性激素和组织环境对调节的敏感性。我们的结果也与我们先前观察到的绝经后妇女CD 103−和CD 103+CD8+T细胞相比，GZB表达降低，GZA表达增加。11。这提示绝经后性激素抑制的消除会引起细胞内细胞毒性分子含量的变化。

考虑到月经后的细胞毒活性在月经周期的卵泡期恢复。10,11提示P和β的缺失可逆转细胞内颗粒含量和溶细胞活性，也可能是新的CD8+T细胞进入子宫内膜。从体外中和转化生长因子β部分恢复肠道CD8+T细胞穿孔素表达的研究中可以看出，细胞溶解能力是可以恢复的。17。此外，我们使用一种能阻断EM CD8+T细胞中转化生长因子β信号的抑制剂，在某些样本中挽救了细胞毒活性。11。细胞溶解电位是随着月经周期的变化而恢复，还是随着月经周期的开始而增加CD8+T细胞进入子宫内膜，仍有待确定。进一步阐明EM细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性及其对成功繁殖和预防包括HIV在内的性传播疾病的意义，将为开发针对FRT的疫苗和免疫疗法提供必要的信息。

关于研究的局限性，除了在我们的研究中涉及的机制外，还有待于探索调节性激素对细胞毒性活动的替代机制。例如，当我们检测到E之后细胞毒性分子水平明显降低的时候2治疗，观察到的效果是否由E的直接作用所致2细胞毒性分子的产生或CD8+T细胞活化程度的降低仍有待确定。此外，除穿孔素/颗粒酶途径外，Fas/FASL通路还介导细胞死亡。34。在初步研究中，我们观察到EM CD8+T细胞在静息条件下与激素共同孵育后，对细胞产生sFASL无明显影响。还需要进一步研究Fas/FASL通路是否被E显著改变。2T细胞刺激后，Fas/FASL通路对EM CD8+T细胞毒性作用的潜在贡献。

另一个在本研究中未涉及的重要方面是性激素改变T细胞脱颗粒的程度。在以往的研究中，我们发现绝经后CD8+T细胞的脱颗粒能力明显增强。11暗示性激素在调控脱颗粒能力中的潜在作用。今后需要进行研究，以调查E在多大程度上2P直接修饰CD8+T细胞脱颗粒。此外，除了细胞毒性分子外，frt CD8+T细胞在刺激后还能分泌和分泌一系列细胞因子和趋化因子，包括干扰素-γ和肿瘤坏死因子α。35。在初步研究中，我们观察了E对CD8+T细胞分泌干扰素-γ和肿瘤坏死因子α的影响。2但是，刺激后细胞因子的产生是否被性激素所改变仍有待于今后的研究。

虽然我们的研究主要集中在CD8+T细胞上，但要充分了解月经周期中细胞毒性活性的调控，就需要对CD4+T细胞和NK细胞进行功能评价。我们以前证实绝经后妇女EM中CD4+T细胞比例下降9。然而，E是否2而P改变EM CD4+T细胞在月经周期中的存在和功能是未知的。子宫内膜NK细胞与CD8+T细胞具有重叠的细胞毒性作用，其数量从增殖期的约3%增加到分泌期的30%。36,37,38围绕着螺旋动脉39，由于趋化和增殖增加。性激素是否直接影响子宫内膜NK细胞的细胞毒作用尚不清楚。以前使用外周血NK细胞的研究显示，月经周期对细胞毒性的影响是自相矛盾的。40,41。然而，其他人已经证明，子宫内膜NK细胞在增生早期比月经周期的其他阶段具有更低的细胞毒性。42。这些发现共同提示性激素可以调节多种细胞类型的细胞毒性活动，这是一个更大的计划的一部分，以优化FRT成功繁殖的条件。

总之，我们的研究证实了两种调节子宫内膜CD8+T细胞毒性功能的激素依赖性调节机制，其中一种机制与E的直接作用有关。2另一种是P介导的上皮细胞产生转化生长因子β的间接作用。对E的回应2转化生长因子β、CD 103+和CD 103−CD8+T细胞溶解电位被抑制。这些结果对于我们了解月经周期、怀孕期间和绝经后细胞毒性活动的激素调节，以及预防和控制性传播感染和妇科癌症的治疗药物的发展至关重要。