2型常规树突状细胞在幼年小鼠和成年小鼠中的作用，而不是分层个体发育的环境信号

传统的树突状细胞(CDC)是幼稚T细胞的关键激活因子，可以在成人中诱导适应性免疫，但在早期被认为发育不足或功能不成熟。在此，我们发现，在早期，当免疫系统发育时，cDC 2表现出双重造血起源，并像其他髓样细胞和淋巴样细胞一样，呈波浪状发育。发育不同的cDC 2在早期生活中，尽管与命运映射有区别，但在转录和功能上是相似的。然而，在早期和成人生活中，cdc 2暴露于不同的细胞因子环境中，这些细胞因子影响着它们的转录水平，改变了它们感知病原体、分泌细胞因子和分化T细胞的能力。我们进一步证明，早期的cDC 2，尽管与成人生活中的cDC 2不同，在功能上是有能力的，并且可以诱导T细胞反应。因此，我们的结果突出了利用cDC 2提高早期免疫力的潜力。

免疫接种是诱导保护性免疫的可靠手段，但在婴儿中效果有限。1。与成年宿主相比，新生的免疫系统表现出数量和质量上的差异，最终导致早期免疫反应减弱，这是忍受与共生微生物和环境抗原的突然接触所必需的。2,3。早期免疫系统的独特特性也使婴儿感染的风险增加。3。抗原呈递和T细胞启动是适应性免疫应答和建立保护性免疫的前提条件。因此，通过根据新生儿和婴儿特定年龄的免疫参数来设计疫苗来改善T细胞启动被认为是提高早期免疫效果和免疫力的一种可能性。3,4.

经典的或传统的树突状细胞(CDCs)是幼稚T细胞的有效激活因子，已成功地成为诱导成人适应性免疫反应的靶点。5,6,7,8。然而，在早期，这些细胞被认为发育不足或功能不成熟.在小鼠和人的新生儿中，cdc室比成人小。9,10,11人和小鼠新生儿CDCs的主要组织相容性复合物Ⅱ(MHCII)和共刺激分子的基础水平较低，使其刺激T细胞的能力减弱。12,13,14,15。早期的小鼠cdc室还表现出一种内在的偏见，即由于IL-12p70的延迟产生T-助手型2型(Th2)免疫反应。16,17。这种Th2偏倚在脐带血cdcs中也很明显，与成人外周血cdc相比，与成人外周血cdc相比，cdc显示出致病刺激后IL-12p70的产生和共同刺激分子的上调。13,14,18。然而，早期用DC生长因子FMS酪氨酸激酶3配体(FLT3L)来扩增CDCs可以改善小鼠的天然免疫和适应性免疫防御。19,20，表明早期CDCs有启动功能性免疫反应的潜力。

疾病预防控制室由发育不同的亚群组成，具有独特的免疫功能。5,6,21。Cdc 1是CD8的强跨表达和激活因子。+T细胞通过产生白细胞介素-12(IL-12)和干扰素-γ(IFN-γ)促进Th1分化22,23,24。相反，cdc 2被认为是更有效的cd4激活剂。+T细胞及其诱导Th2、Th17和T-滤泡辅助细胞分化的研究25,26,27,28,29。小鼠新生cdc室以cdc 1为主，而cdc 2是大多数成年器官中cdc 2的主要亚型。9,10,30,31。考虑cdc 1在成人产生IL-12和IFN-γ中的主导作用23,24在cdc 1和cdc 2的相对频率保持稳定的整个生命过程中，不太可能解释cdc 1和cdc 2在早期生命中所观察到的t2偏倚。15。这些数据表明，另一层年龄依赖性调节影响疾病预防控制中心的功能。新生儿cdc 1对IFN-α信号不敏感，产生的IL-12较少，IL-10较多，激活CD4的能力降低，说明了这一点。+T细胞及其表位的选择+病毒感染过程中的T细胞9,16,17,32,33.

很少有研究对cdc 2早期生命进行过研究。新生小鼠脾脏CD8−与成体相比，CDCs产生的IFN-γ较低，异基因反应T细胞的活性降低。9。虽然CD8在新生儿脾脏中的表达不能可靠地区分cDC 1和cDC 217,34这些数据提示新生儿cDC 2激活T细胞的能力降低。同样，新生儿肺中的cdc 2表达比成人cdc 2低的共刺激分子。32,35,36,37，虽然它们能促进Th2介导的变态反应，并诱导一些CD8。+呼吸道合胞病毒感染T细胞增殖30,32,38。这些数据表明，在早期，cdc 2在某些情况下具有激活T细胞的潜力，这就引发了这样一个问题：这种能力是否可以在更广泛的意义上加以利用，例如在脾脏启动T细胞反应，脾脏是产生抗体的主要部位之一。39.

第一批血液和免疫细胞来源于胚胎外卵黄囊祖细胞，对于巨噬细胞或肥大细胞等某些细胞，卵黄囊衍生细胞在出生后可以在组织中持续很长一段时间。40,41,42。CDCs在小鼠和人类胚胎发生过程中首次出现，当时他们被认为对胎儿的耐受性做出了重要贡献。9,10,40,43。然而，早期CDCs的起源尚未被研究。在成人中，造血干细胞(HSCs)下游的CDCs是从能够产生浆细胞样DC(PDC)和称为共同DC祖细胞(CDP)的骨髓祖细胞中发育出来的。44,45,46,47。C型凝集素受体DNGR-1在小鼠CDPs中的表达Clec9a)区分cdc限制的祖细胞。48。CDPs进一步分化为前CDCs，继续表达DNGR-1。48，退出骨髓，最终分化为周围器官的cdc亚型，并对环境信号作出反应。49。这个Clec9a启动子在cdc 1中也有活性，在pdc上有较低的活性，但在cdc 2和其他淋巴样或髓系细胞中不活跃。48,50,51,52。用表达cre-重组酶的小鼠杂交Clec9a启动子罗莎LOX-停止-LOX-黄色荧光蛋白(YFP)或罗莎LOX-停止-LOX-番茄小鼠，我们已经生成了忠实跟踪细胞的老鼠，这些细胞属于cdc系，在稳定的状态下，在炎症条件下。48,53,54。利用这些小鼠，我们发现成人脾脏中的cdc 2主要来源于cdp/precdc。48,53,54，这与其他研究是一致的。55,56.

在这里，我们开始调查cdc 2在早期和成人生活中的差异，并阐明cdc 2的年龄依赖性功能调节的原因。我们发现，cDC 2类似于其他淋巴样细胞和髓样细胞类型，以波的形式发育。Cdc 2来源于早期不同的造血来源，在表型和转录上相似，在功能上能够诱导T细胞反应。然而，在早期和成人生活中，cdc 2具有独特的识别病原体、产生细胞因子和诱导T细胞分化的能力，而T细胞分化是在早期和成人生命中由不同的细胞因子信号所形成的转录印迹。因此，利用cDC 2在早期的独特方面，可以提供一种有效的手段来提高疫苗的效力和保护性免疫。

早期cdc 2表现出个体遗传多样性。

为了研究早期CDCs的表型和起源，我们首先在Clec9aCRE/+罗莎汤姆老鼠。在此背景下，我们将新生儿期定义为出生后的前10天。57。在稳态小鼠脾脏中，cdcs被鉴定为cd11c。+MHCII+细胞5，最早可发现于胚胎16天(E16，图1)。1A，b和补充图。1)。CD11c频率+MHCII+随着年龄的增长，细胞数量稳步增加，在4周龄左右达到成人水平(如图所示)。1A，b和补充图。1)，确认以前研究的结果9,10。CD11c+MCHII+细胞可进一步分裂为CD 24。+和CD11b+细胞5。CD 24+Cdcs包括xcr-1。+依赖于batf 3的cdc 1，以及非典型batf 3独立的cdc 1的子集。+表达CD172a和CX3CR1但缺乏XCR-1的CDCs(图1)。1A)58,59,60。如预期，CD 24+CDCs在早期以CDCs为主，但随年龄增长而减少，CD11b所占比例较低。+Cdc 2随年龄增长9(无花果)1C)。值得注意的是，xcr-1+Cdc 1是CD 24中最常见的细胞类型。+细胞在大多数年龄检查，虽然在2天大鼠和成年小鼠非典型的CD8。+CDC和cDC 1所占比例相等(图1)。1D)。脾脏CD11b+Cdc 2可分为NOTCH 2-和RUNX 3依赖型Esam。高Cdc 2和esam低层Cdc 2，与这些转录因子无关。61,62,63(无花果)1A和补充图。1A，B)。值得注意的是，埃萨姆高与成年小鼠相比，新生小鼠cdc 2室内的细胞较少，但Esam的比例较低。高CDC 2室内的细胞在2周至3周龄期间达到成人水平(图1)。1E和补充图。1A，B)，这与脾结构的组织结构相吻合。

我们下一次评估Clec9a-通过分析番茄在脾脏白血球细胞中的表达情况，了解其随年龄的变化。Clec9aCRE/+罗莎汤姆老鼠。Cdc 2缺乏dngr-1的表达，因此番茄标记是判断细胞起源的真正指标。48。与我们以前的观察结果及其CDP的起源一致5,48,54,55,56，成人脾脏的cdc 2与番茄的标记接近完全。Clec9aCRE/+罗莎汤姆小鼠(93±1.28%)。在新生小鼠中，cDC 2的标记明显降低(20.6±4.48%)，表明个体遗传的异质性。番茄频率+CDC 2细胞随年龄增长而增加，至4周龄左右达到成体标记(86±1.4%)。1F，g).

我们以前已经证明了CRE水平的增加(纯合子)Clec9aCRE(小鼠)导致DC前体标记显著增加和CDCs分化，因为一小部分前体以随机方式被“逃脱”标记。48。此外，由于lxp位点之间距离的不同，命运报告的选择也会影响标记效率。64。排除新生cdc 2的减少标记是特定命运报告使用或由于小鼠杂合子的“祖逃逸”造成的人造产物。CRE，我们分析了纯合子Clec9aCRE/CRE罗莎汤姆老鼠和Clec9aCRE/CRE罗莎YFP老鼠。在这两种模型中，相对缺乏Clec9aCRE-在新生儿cDC 2中观察到介导的命运标记(附图)。1C，D)。重要的是，番茄标记与两个cdc 2亚组(Esam)中的任何一个都没有关联。高或埃萨姆低层各年龄组细胞的标记频率相似(补充图)。1E)。与成年小鼠的观察相比较48,54, Clec9aCRE-介导的小白鼠番茄标记仍局限于CD11c+MHCII+CDCs和类似pDC或前CDCs的细胞基于低CD11c和MHCII表达(补充图。1F，G).

由于我们在DC个体发育方面的大部分工作来自于成年小鼠的研究，接下来我们证实DNGR-1表达的CDC祖细胞存在于早期的骨髓和脾脏中。与巨噬细胞树突状细胞祖细胞(MDPs)相似的细胞(系(LIN))−CD11c−MHCII−CD11b低层CD 115+CD 135+CD 117高)，CDP(LIN)−CD11c−MHCII−CD11b低层CD 115+CD 135+CD 117低层)，以及前CDCS(LIN)−MHCII−CD11b低层CD11c+CD 135+CD172aINT)可在新生小鼠骨髓中发现(补充图)。2A，B)。值得注意的是，推测的MDPs更频繁，而cdp和cdc前样细胞在新生儿中的频率低于成人骨髓(补充图)。2B)。重要的是，前CDC样细胞在2天和1周大鼠骨髓中一致表达DNGR-1。氢和补充图。2C)。因此，1周龄和2周龄的cds和前期cdcs中未检出番茄，而mdps或公共淋巴祖细胞(Clps)则未检出。Clec9aCRE/CRE罗莎汤姆小鼠，如定义的表型(补充图。2E)。这些数据证实了Clec9a-驱动型CRE在早期活跃于DC前驱物中。重要的是，1周龄和2周龄小鼠的CDCs标记程度与成年小鼠相似，尽管1周龄时的标记还没有完全达到成人水平(补充图1)。2E81.15±2.77%PND 7，94.67±1.72%2周，93.61±2.93%成人)。在2天和1周大鼠的脾脏中也发现了具有单峰DNGR-1表达的CDC样细胞(见图).1I和补充图。二维空间)，并以与骨髓相似水平的番茄标记(补充图)。2 E、F)，表明CRE介导的前CDCs标记在骨髓中完成。由于CRE蛋白合成和dna重组之间存在时间延迟，主动循环的前体细胞可以逃避标记。45,48,49。如果新生儿中的cDC 2由于其前体阶段的快速转移而未被标记，我们期望在分化的cDC 2中比在其直接祖细胞中更高的标记率。然而，在1周龄和2周龄时，用番茄标记的脾前疾控中心比从同一只小鼠中分化出cdc 2的程度更大(补充图1)。2F)。这与成年小鼠形成对比，后者脾cDC 2和前CDCs的标记相似(补充图)。2F)。为了进一步排除早期cdc 2缺乏可检测番茄的可能性，因为它们没有足够的时间积累足够的荧光蛋白，我们对番茄进行了分类。+和番茄−CD11c+MHCII+CD11b+1周龄细胞Clec9aCRE/CRE罗莎汤姆并在DC生存因子FLT3L和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在下培养小鼠。24小时后，番茄−细胞仍然是番茄−，支持这样的观点，即这些细胞是独立于Clec9a-表达祖细胞(附图)。2G)。因此，类似善意的细胞Clec9a表达疾病预防控制中心的祖细胞存在于早期Clec9aCRE小鼠在早期可以被用来追踪CDCs。

命运图显示cdc 2在早期生命中有淋巴样的贡献。

为了探讨cdc 2在早期生命中的起源，我们首先进行了交叉。Clec9aCRE/CRE罗莎YFP缺乏生长因子FLT3L的小鼠，这是所有DC发展所必需的65。在两周大的时候Clec9aCRE/CRE罗莎YFPFlt3l−/−小鼠cDC 1和cDC 2均明显减少(图2)。2A)。因此，早期的cdc 2需要flt3l来开发，这与它们是否来自Clec9a-是否表达祖细胞。造血在出生前就开始了，在小鼠中，卵黄囊祖细胞有助于产生淋巴和髓系免疫细胞。41,42,66,67。为了评估早期卵黄囊红髓祖细胞对cdc 2室的贡献，我们对孕妇进行了治疗。CSF1R迈尔-艾克雷-梅尔罗莎YFPE8.5用4OH-他莫昔芬筑坝41,67并在E18.5，以及出生后2周和4周分析后代小鼠的脾脏。重要的是，CD 24+NOR CD11b+与肝枯否细胞和脾巨噬细胞相比，任何年龄组的CDCs均为阳性对照(图一)。2B和补充图。3A)。转录因子c-myb对卵黄囊造血是可有可无的，但对最终造血干细胞的发展至关重要。68. 多年期-缺乏的小鼠胚胎致死，但能存活到E16.5。此时CD 24+和CD11b+CDCs，而不是脾巨噬细胞，在脾脏中减少。多年期−/−相比较少白蚁控制胚胎(图一。2C)。因此，CD11c+MHCII+细胞独立于卵黄囊来源的红髓祖细胞，晚期胚胎发生需要c-Myb来发育，这表明它们是由最终的造血产生的。

Cps可以在过继转移过程中产生cdc样细胞。69,70,71,72,73我们已经证明，当髓系cdc祖细胞受损时，淋巴细胞对cdc的产生有贡献。74。用FLT3LCLPs体外培养时Clec9aCRE/+罗莎汤姆小鼠产生CD11c+MHCII+主要类似于cdc 1的CDC样细胞。然而，也很少产生cDC 2样细胞。这些仍然是番茄阴性，这表明中电可以产生汤姆。−Cdc 2(补充图2)3B)。重组激活基因-1在CLPs中首次检测到，通过促进抗原受体基因的体细胞重排来促进B和T细胞的发育。75。因此，我们对新生儿脾脏白细胞进行了YFP标记。Rag1CRE罗莎YFP小鼠出生后2-3天和7-9天，以及成年期。由于谱系决策是随机的，本构CRE的宿命映射不是绝对的，应在种群水平和正、负控制种群的背景下加以考虑。尽管B细胞在所有年龄阶段都表现出几乎完全的YFP标记(如图所示)。二维空间中性粒细胞标记(11±2.86%PND2-3，6.63±2.32%PND7-9，2.27±0.82%成人)。二维空间)和骨髓红系细胞(5.32±1.88%PND2-3，1.87±0.8%PND7-9)(附图)。3C)，作为阴性对照，如预期的那样低。66。值得注意的是，在2至3天和7至9天内Rag1CRE罗莎YFPYFP标记小鼠cDC 2分别为29±5.30%和13.43±3.16%。二维空间和补充图。3C)，而cdc 2则来自成人脾脏。Rag1CRE-介导的YFP标记不超过阴性对照群体的标记(图一)。二维空间和补充图。3C)。重要的是，yfp标记在esam之间是可比较的。高(16.15±1.01%)和ESAM低层(15.21±1.07%)cDC 2在7~9日龄小鼠(附图)。三维空间)，再次支持在这两个子集中类似的早期生命异质性。值得注意的是，CD 24+Cdc 1显示出更多的证据Rag1CRE与cDC 2在新生小鼠和成年小鼠中的表达历史比较(见图)。二维空间)。IL-7受体(Il7r)-cre小鼠已被用来证明在成年小鼠中淋巴祖细胞对CDCs没有贡献。76。因此，我们以这些小鼠为独立模型，绘制淋巴受限祖细胞的命运图。重要的是，cdc 2从2天和1周开始。Il7rCRE罗莎RFPRfp标记强烈的小鼠，但cdc 2的标记从1周开始低于2天大鼠(图1)。2E).

CXCR 4克里尔小鼠在胚胎和成年小鼠中连续标记最终造血阶段，而不标记卵黄囊祖细胞。77。因此我们脉冲CXCR 4克里尔罗莎MTmG在E12.5时使用他莫昔芬，推测胎儿肝脏HSCs将被标记，从而使我们能够评估它们对脾脏DC的贡献。在E18.5时，作为阴性对照的小胶质细胞没有像预期的那样标记绿色荧光蛋白(GFP)。77。相反，我们观察到E18.5脾脏中单核细胞和巨噬细胞的标记，与胎肝HSCs的后代一致(附图)。3E)。重要的是，gfp标记的cdcs也支持了胎儿肝脏祖细胞在早期生命中对cdc 2的贡献的观点(补充图)。3E).

因此，命运图表明，在早期生命中，稳定状态的cdc 2池有淋巴样的贡献，而不是成年期。与cdc 2的观测相结合Clec9aCRE随着年龄的增长，这些数据表明cdc 2的发育是以波的形式调节的，胎儿肝内淋巴祖细胞的贡献早，但随着年龄的增长，逐渐被真正的cdcs所取代。Clec9a-表达祖细胞。从今以后，我们将参考cd11c。+MHCII+CD11b+细胞Clec9aCRE罗莎汤姆缺乏番茄表达的老鼠−DC2(图2)1F).

汤姆+Cdc 2和Tom−DC2在早期生活中表现相似。

表型分析显示，原型cDC 2标记CLEC4A4、CD172a、CD 26、Esam或CD4在Tom上的表达无明显差异。+Cdc 2和Tom−DC2从1周龄开始Clec9aCRE/CRE罗莎汤姆老鼠(图1.3A)。MHCII和共刺激分子CD 80在Tom中的表达也是相似的。+汤姆−细胞(图1.3A)。通过胞质分析，我们发现具有典型树突状细胞形态的cdcs细胞，以及在tomm内具有圆形形态和小细胞质的细胞。+Cdc 2和Tom−DC2(附图)3F)。汤姆+Cdc 2和Tom−1周龄小鼠脾脏中dc2位于发育中的白髓，与CD3密切相关。+T细胞(图1.3B)。因此，Clec9a-阴性祖细胞产生cdc 2样细胞，其表型和组织定位与cdc 2的来源相似。Clec9a-表达祖细胞。

汤姆+Cdc 2和Tom−早期生活中的dc2在转录上是相同的。

虽然环境对细胞特性有很大影响，但发育过程中不同造血来源产生的髓细胞和淋巴样细胞在发育过程中可能有不同的转录和功能类型。42,78,79,80,81,82。为了解决个体发生转录印迹cdc 2的问题，我们比较了tomm的基因表达谱。+Cdc 2和Tom−DC2从1周龄开始Clec9aCRE/CRE罗莎汤姆老鼠和汤姆的老鼠+CDC 2来源于成年小鼠。我们用纯合子Clec9aCRE/CRE罗莎汤姆老鼠确保最高的外显率Clec9aCRE以及1周的时间点，因为个体发育的异质性足够突出，足以对两个种群的细胞进行分类(附图)。1C)，尽管埃萨姆高致以萨姆低层这一年龄组的分布仍略低于成年小鼠(图1)。1E)。主成分分析(PCA)+Cdc 2和Tom−从1周龄小鼠中分离出的dc2与成年汤姆分离。+Cdc 2，确定年龄是变异的主要贡献者(图1)。4A)。主成分2允许在Tom之间进行一些分离。+来自Tom的cdc 2−DC2来自幼鼠，表明基因表达差异与差异个体发生有关(图。4A)。通过对差异表达基因的无监督层次k均值聚类，我们定义了14个具有不同表达特征的聚类(补充图)。4A)。在这些集群中，大多数集群发现了来自幼鼠和成年小鼠的细胞之间的差异。Clec9aCRE表达历史(附图)4A)，再次强调基因表达的最大差异与年龄有关。簇8和14在Tom中鉴定出具有明显表达特征的基因−DC2与Tom的比较+来自幼鼠和成年小鼠的cdc 2(补充图1)。4A)，识别由个体发育引起的假定变异。

汤姆的配对比较+Cdc 2和Tom−幼鼠DC2鉴定出167个差异表达基因(Log)2折叠变化(原木)2(FC)>1，调整数p-值(PADJ)<0.05(图)。4B和补充数据1)。在这个比较中，汤姆+CDC 2显示细胞周期基因的富集(图1)。4C)，这可能反映了这样一个事实，即这些细胞在数量上不断膨胀，并逐渐取代了Tom−DC2随年龄增长。最值得注意的是，有几个基因与先天淋巴细胞(ILCs)的生物学有关，例如RORC, Tcf7, IL18r1, Ccr6, 林戈4，和LTA，在Tom中表现出更高的表达−DC2比Tom+Cdc 2(图2.4B)。用流式细胞仪检测了部分rorγt-表达细胞。−DC2但不在Tom中+Cdc 2从1周龄开始Clec9aCRE/CRE罗莎汤姆老鼠(图1.4D，E)。这些细胞缺乏典型的ILC标记CD 127和CD 90。83,84,85并表达典型的cDC 2标记，包括CD11c、MHCII、CD172a、CLEC4A4、Esam和CD 26，与ILCs(LIN)不同−CD11b−CD 90+CD 127+)，CD11c阴性(附图)。4B、C)。值得注意的是，RORγt的频率+TOM内的细胞−DC2种群随年龄和RORγt的增加而下降+成人cDC 2池中未见细胞。4E)，增加了这些RORγt的可能性。+细胞可能构成一个独特的DC2群体，它在生命早期就会出现，并且随着年龄的增长而消失。

为了解决这个问题，我们接下来进行了基于液滴的单细胞RNA测序(scRNA-seq)。我们对纯化的脾MHCII进行了分类。+9天大的细胞Clec9aCRE/CRE罗莎汤姆小鼠，排除CD 19后+B细胞和F4/80高巨噬细胞(附图)5A)。使用这种方法，我们期望识别所有主要的dc子集，包括cdc 1，非标准cd8。+CDCS、Tom+Cdc 2和Tom−DC2和CD11c低层MHCII低层PDC，以及RORγt-表达型ILCs的一小部分，表达MHCII，但缺乏CD11c(补充图)。4B和5A)。基于无监督图的聚类通过统一流形近似与投影(UMAP)的降维方法将15个聚类可视化(图1)。4F)86,87。我们在所有簇中都发现了一些增殖细胞(处于G2M和S期)，但从比较分析中排除了第4、7、9和14簇，因为它们主要由增殖细胞组成(图1)。4F)。每个簇的同一性是利用差异表达的基因，结合对CDCs和其他免疫细胞的特征基因的先验知识来确定的(补充图)。5B-E)。第5组查明CD 19-B细胞表达(附图)。5B)，表示一种可能的分类杂质或rna与蛋白质表达之间的不一致。88。Cdc 1被划分为5个集群(1、2、4、9和13)。Xcr1, Cd24a, IRF 8，和TLR 3(补充图。5B、C)。我们进一步添加了CRE中插入的Clec9a轨迹48,89进入参考转录组并找到CRE仅在第1、2、4、9和13组中表达，符合Clec9a早期cdc 1的表达17。第8组构成西格莱赫和CCR 9表达pDC和簇6和14RORC, 罗拉, Il7r, IL18r1，和毒理，将它们识别为ILC 383,84。簇12与E2依赖的非标准CD8相似。+基于CX3CR1, Cd24a, 锡尔帕(CD172a)TCF 4(编码E2-2)表达58,60(补充图。5B、C)。根据cdc 2的表达，cdc 2分布在簇0、3和7上。锡尔帕, ITGAM, IRF 4，以及已发表的标志性基因90(补充图。5B，D)。值得注意的是，第3组更类似于Esam。低层，而簇0类似于Esam高Cdc 259(补充图。5F)。此外，我们还发现第10组细胞类似于迁移的cdcs。90(补充图。5E)。虽然这个集群显示出核心cdc 2和esam的表达，但我们无法为集群11分配一个清晰的标识。高Cdc 2标记基因(附图)5D，F)。值得注意的是，RORC在第11簇的基因特征中发现，该群体在Tom中表现出较高表达的基因丰富。−DC2在汤姆配对比较中的应用+Cdc 2和Tom−DC2在大批量RNA-seq(图.4G和补充图。5B).

我们下一次认出汤姆+Cdc 2和Tom−通过添加番茄以及未重组的文字记录罗莎指向参考转录组91。形成归一化比率番茄每个细胞读取到未重组的预测转录本的每个单元的规范化读取。罗莎轨迹(Tom/Unrec之比)(ROSA)明确分离B细胞(第5组)和cDC 1(簇1、2、4、9和13)，作为阴性和阳性对照。番茄分别表达(图1.4H)。因此，我们设置了一个阈值并确定了汤姆−(比率Tom/Unrec.)ROSA<−0.5)和汤姆+细胞(Tom/unrec之比)。罗莎>0.5，图1。4H). 汤姆+和汤姆−细胞均匀分布在cDC 2团簇0、3和7的UMAP中(如图所示)。4I)，以及成对比较汤姆+和汤姆−簇0和3内的细胞在基因表达上没有多少差异，这表明这些细胞在转录上是相似的(补充数据)2)。值得注意的是，第11组内的细胞主要是汤姆−，再次表示此集群对应于rorγt-表达的tm。−DC2(图2)4I).

在成人中，cdc 2可分为表达cDC2A的T-bet和T-bet阴性的cDC2B，受rorγt和C/EBPα的控制。92。这种分裂在早期似乎是站得住脚的，因为星系团0显示了T-bet的丰富。+CDC2A标记基因(附图)5G)，而簇3更像T-bet−CDC2B(附图)5G)。有趣的是，第11组中的细胞与T-bet不一致。−CDC2B但更像T-bet+CDC2A(附图)5G)，与ESAM在RORγt上的高表达相一致。+DC2(附图)4C)。为了深入了解RORC-为了表达集群11、cdc 2(集群0、3和7)和ILC 3(集群6和14)，我们使用了Palantir算法。93。在第11组中设置起始点确定了两个终端状态，一个在ILC集群14中，一个在cDC 2集群0中(补充图)。5H)。然而，在从簇11中退出时，分化潜能迅速减弱，并且簇11细胞到达末端状态的分支概率很低(补充图1)。5H)。因此，命运映射RORCCRE罗莎RFP小鼠94只确定了少数RFP+Cdc 2在2周龄小鼠中的一部分也染色阳性的γt(补充图)。5I)。作为RFP+细胞只占幼鼠脾DC2总室的一小部分，rorγt。+细胞不太可能是Tom的祖细胞。−早期的DC2。

因此，与荧光激活细胞分类(Fcs)分析相一致，scrna-seq发现，1周龄小鼠的cdc 2含有在成人中也发现的两种主要cdc 2亚型，尽管来源不同，tomm。+Cdc 2和Tom−DC2在cDC 2簇间分布均匀，说明它们构成转录上相同的细胞。TOM基因表达差异+Cdc 2和Tom−1周龄大鼠rna-seq中的dc2与一种独特的rna-seq相关。RORC-表达cDC 2，其转录与Esam非常相似，但与ESAM不同。高Cdc 2，只存在于早期。

年龄决定了基因表达的最大差异。

在确定个体发育为转录变异的次要贡献者后，我们接下来将重点放在年龄引起的基因表达差异上。汤姆的配对比较+从1周龄和成年小鼠的cDC 2中鉴定出1490个差异表达基因(log2FC>1，padj<0.05)。5A和补充数据3)。汤姆+1周龄小鼠的cdc 2显示细胞周期相关基因的丰富(图一)。5B)，可能反映了不断扩大的DC池内稳态增殖的增加。汤姆+来自成人的cdc 2由于与炎症反应有关的基因而被富集，这可能表明成人cdc 2的激活或功能成熟水平有所提高。15。最值得注意的是干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-α(如图所示)信号下游基因的鉴定.5B)从成年小鼠中富集cDC 2。这些细胞因子受体的表达在1周龄小鼠和成年小鼠中是相当的(补充数据)。3这些数据表明，在新生小鼠和成年小鼠的脾脏中，有一种独特的细胞因子环境作用于cDC 2。我们证实了pd-l1的高表达(由镉274基因)和CD 38(CD 38)，由I型和II型IFN信号调节。95,96，关于汤姆+Cdc 2与2周龄小鼠比较(图1)。5C)。重要的是，这些标记在cdc 2上的表达减少。伊夫纳−/−与野生型对照小鼠相比(见图)。5D)，支持不同的细胞因子环境作用于早期和成年期脾cDC 2的观点，并表明基因表达的年龄依赖性差异至少部分是由干扰素-α引起的。

在不同年龄差异表达的基因中，我们发现了几种模式识别受体(Prrs)在Tom中的高表达。+来自成人的cdc 2，包括Clec7a(Dectin-1的编码)，TLR 7，和TLR 5(补充图。6A)。相反，表达Clec4n(Dectin-2的编码)，TLR 4，和TLR 2早期生活水平较高(附图)。6A)，而其他PRR的表达，例如Tlr 6, TLR 9，和Nod 1Cdc 2在1周龄小鼠和成年小鼠中具有可比性(补充图)。6A)。与以前观察到的肺32,35,36,37，cdc 2在成年小鼠体内表现出较高的协同刺激分子表达，包括CD 80, CD 40, 镉274(pd-l1的编码)和Tnfsf 4(编码OX40L)5A)。协同刺激分子的低表达可能表明早期cDC 2激活T细胞的能力降低，但共刺激信号也能平衡效应T细胞的反应。Tnfsf 4和镉274例如，可以抑制T细胞中IL-17A的产生。97,98。有趣的是，成人cdc 2进一步表现出更高的骨形态蛋白2的表达。BMP 2)，这也抑制了T细胞产生白细胞介素-17A。99(补充图。6B)。恰恰相反，汤姆+1周龄小鼠的cdc 2表现出更高水平的促进Th17和Treg分化的因素，例如Lgals 3, Il6ra, 拉格斯1，和Sema4a100,101,102,103,104,105,106(补充图。6B)。由于年龄是转录变异的主要贡献者，上述基因在Tom之间的表达是相似的。+Cdc 2和Tom−DC2来自1周龄小鼠。综上所述，这些数据表明，早期和成人生活中独特的细胞因子环境作用于cDC 2，形成它们的转录特征和诱导免疫反应的能力。

与成人cdc 2相比，早期cdc 2在体外诱导了明显的T细胞反应。

上述结果提示，cDC 2在早期和成年时诱导效应T细胞分化的能力可能不同。为了在体外解决这一可能性，我们对纯化的Tom进行了分类。+Cdc 2和Tom−来自Young和Tom的DC2+来自成年小鼠的cdc 2，并以卵清蛋白(Ova)肽323-339(Ova)刺激它们。323–339)。Cdc 2的种群从2周龄到2.5周大，因为在这个年龄的Esam。高致以萨姆低层子集分布已达到成人水平和Esam高细胞支配cDC 2室(图1)。1E)。虽然dgr-1在dc 2中没有已知的功能，也没有表达，但我们使用小鼠杂合子作为研究对象。CRE在功能测试中，因为Clec9aCRE/CRE小鼠缺乏功能性DNGR-148。在T细胞极化细胞因子存在或不存在的情况下，利用成年小鼠幼稚的OT-Ⅱ转基因T细胞培养肽脉冲DC2群体。选择成人T细胞作为应答者，因为新生儿T细胞表现出内在的Th2偏见2。值得注意的是，汤姆+Cdc 2和Tom−幼鼠和汤姆的DC2+成年小鼠的cdc 2在所有实验条件下都能刺激幼稚T细胞的类似增殖(如图所示)。5E，f和补充图。6C，D)，表明成人的cDC 2在刺激T细胞的能力方面没有表现出更高的激活水平。与成人cdc 2相比，Tom+Cdc 2和Tom−年轻小鼠的DC2在非极化(Th0)和Th1条件下也能诱导OT-II细胞类似的效应分化。5G和补充图。6d)。我们没有观察到细胞内染色法在Th0条件下刺激T细胞产生IL-4，但用cDC 2刺激的年轻小鼠和成年小鼠T细胞培养上清液中Th2细胞因子水平相似(补充图1)。6f)。因此，早期的脾cdc 2并没有表现出内在的Th2偏倚，这与来自肺的新生儿cdc 2形成了鲜明的对比。30。与Th17分化阳性调节因子的高表达相一致，Tom+Cdc 2和Tom−在Th17条件下，幼鼠产生的DC2比成年小鼠产生的IL-17A高出两倍(图1)。5F，g)。同样，在Treg条件下，更多的OT-ⅡT细胞在用幼鼠DC群体刺激时产生Foxp 3阳性(图1)。5F，g)。因此，尽管表现出增殖相关基因的表达增加(如图所示)。5B)幼鼠的cDC 2诱导的T细胞增殖与成年小鼠相似，而诱导Th17和Treg的分化程度较高，表明T细胞分化的能力存在质的差异，而不是数量的差异。

埃萨姆高埃萨姆低层Cdc 2有不同的转录程序，可能刺激不同类型的T细胞反应。62接下来，我们将讨论这两个子集是否具有不同的功能。因此，我们对以萨姆进行了分类。高埃萨姆低层汤姆+Cdc 2来自2周龄和成年小鼠，并评估其刺激Th17和Treg分化的能力。埃萨姆高埃萨姆低层幼鼠的cDC 2诱导的Th17分化程度高于成年小鼠(图1)。5H)。同样，Esam高幼鼠的cdc 2诱导的Treg分化程度高于成年小鼠，而eSAM的诱导率较高。低层幼鼠和成年小鼠的cDC 2诱导了类似的Treg分化(图1)。5H)。因此，ESAM的早期生活和成年生活之间存在着功能上的差异。高埃萨姆低层Cdc 2，虽然似乎有一定程度的子集特定的功能调节。埃萨姆高汤姆−DC2含有一个功能未知的RORγt表达细胞(1.15±0.38%)，如图所示。4E)，我们下一次穿越RORC-EGFP老鼠Clec9aCRE/+罗莎汤姆老鼠。然后我们选了埃萨姆高汤姆+Cdc 2和esam高汤姆−DC2从2周龄开始RORCEGFPClec9aCRE/+罗莎汤姆老鼠，而不包括绿色荧光蛋白+并比较其促进Th17和Treg分化的能力。重要的是，尽管排除了RORγt+细胞ESAM高汤姆+Cdc 2和esam高汤姆−DC2具有相似的诱导Th17和Treg分化的能力(补充图)。6g)，确认RORγt的存在+细胞不影响Tom的能力。−Cdc 2诱导T细胞分化.

为了确定早期的cdc 2是否也能吸收和处理抗原，我们首先培养了tm。+Cdc 2和Tom−2周龄和汤姆的dc2+成人cdc 2Clec9aCRE/+罗莎汤姆用荧光标记乳胶珠的小鼠在细胞松弛素D存在或不存在的情况下体外培养2h，所有群体均以同样的效率接受荧光标记的珠子(附图)。六小时)。珠的摄取由吞噬作用介导，而细胞松弛素D(补充图)则对此有抑制作用。六小时)。这样，汤姆+Cdc 2和Tom−DC2的吞噬能力没有差异。我们接下来要培养汤姆+Cdc 2和Tom−幼鼠和成年汤姆的DC2+CDC 2与细胞追踪紫罗兰(CTV)标记的OT-ⅡT细胞在OVA存在下在Th17条件下(图1)。5I)。如前所述，汤姆+Cdc 2和Tom−幼鼠的DC2诱导产生IL-17A的T细胞频率高于成年的cDC 2(图1)。5I)。这样，汤姆+Cdc 2和Tom−来自幼鼠的DC2在处理抗原和以抗原特异性方式诱导幼稚T细胞增殖的能力上与成年小鼠相当。汤姆+Cdc 2和Tom−幼鼠的DC2促进了类似的Th17和Treg的分化，但与成熟的cDC 2相比，Th17和Treg的分化增加，支持了不同环境线索影响DC诱导T细胞分化能力的观点。虽然这些细胞因子可以通过对微生物区系的反应来调节，但生长在无菌(GF)和特定无病原体(SPF)条件下的成年小鼠cDC 2在Th0、Th17和Treg条件下诱导了类似的OT-Ⅱ细胞分化，但在PDL-1和CD 38的表达方面并没有重述幼龄cDC 2的表型(补充图)。6I，J)。这些数据表明，cdc 2在早期生活中的功能差异并不仅仅是由于这一年龄的微生物负荷降低所致。

与成年期cdc 2相比，早期cdc 2在靶向抗原传递时诱导了明显的T细胞反应。

在证实来自幼鼠的cDC 2可以在体外激活T细胞后，我们接下来询问来自幼鼠的cDC 2在体内直接传递抗原后是否具有这种能力。我们依靠一种已建立的方法将模型抗原ova与c型凝集素受体clec4a4/dcr 2的抗体偶联成cdc 2。25,107。汤姆+Cdc 2和Tom−DC2在表型上是相同的，我们不能单独针对任何一个细胞群体，但CLEC4A4是由汤姆共同表达的。+Cdc 2和Tom−DC2(图2)3A)。我们给两周大的孩子注射了Clec9aCRE/+罗莎汤姆有抗DCIR2-OVA或特异性无关的同型对照抗体的小鼠。12小时后，我们对纯化的脾汤姆进行了分类。+Cdc 2和Tom−DC2，并与CTV标记的成年小鼠的OT-ⅡT细胞共培养。6A)克服任何早期T细胞固有的分化偏见。2。在这个实验装置里，汤姆+Cdc 2和Tom−DC2以抗DCIR2-OVA为靶标诱导OT-Ⅱ增殖，而非同型对照抗体(图1)。6A)。这样，汤姆+Cdc 2和Tom−2周龄小鼠的dc2可作为抗dcr 2和过程抗体抗原复合物的靶点，用于CD4。+T细胞，尽管在没有佐剂的情况下，OT-Ⅱ的增殖能力很低，正如预期的那样。107.

早期的免疫反应是Th2偏向的，但这种倾向可以通过使用Th1佐剂(如cpG-B)来克服。108,109。CPG-B信号通过TLR 9表达，该信号在cDC 2大片段mRNA测序中同样表达(补充图)。6A)。尽管如此，汤姆+Cdc 2和Tom−2周龄和汤姆的dc2+CpG-B刺激后，成年小鼠的cDC 2表现出明显的细胞因子谱.对CpG-B汤姆的回应−幼鼠的DC2是最有效的细胞因子产生者，分泌的IL-6、IL-12p40和TNF-α含量高于成人的cDC 2(图1)。6B)。有趣的是，tm中IL-6和TNF-α的含量显著升高。−DC2与Tom的比较+来自幼鼠的cDC 2，增加了这些细胞具有明显的炎症潜能的可能性。与来源无关的是，幼鼠产生的cDC 2产生的IL-10和IL-27水平高于成年小鼠(图1)。6B和补充图。7A)。虽然白细胞介素-27的产量很低，并不能在所有样本中检测到，但值得注意的是，儿童外周血中的白细胞介素-27比成人的DC产生的白细胞介素-27增加。110。因此，尽管有相似的表现TLR 9幼鼠表达的cDC 2对CpG-B的细胞因子反应与成年小鼠的cDC 2有不同的细胞因子反应，提示TLR 9下游有明显的信号传递，证实了年龄对cDC 2有明显的免疫反应性的影响。

接下来我们将测试对CpG-B刺激的不同反应是否会影响cDC 2激活T细胞并诱导其分化的能力。以CpG-B为佐剂，给2.5周龄或成年小鼠注射抗DCIR2-OVA.12小时后，我们对汤姆进行了分类+Cdc 2和Tom−来自幼鼠和汤姆的DC2+从成年小鼠中分离出cdc 2，并与ctv标记的OT-ⅡT细胞共同培养。6C，d)。3.5d后分析T细胞增殖、细胞因子生成和Foxp 3的表达。在这次分析中，汤姆+Cdc 2和Tom−幼鼠的DC2和成年小鼠的cDC 2诱导了类似的OT-ⅡT细胞增殖。6C)。靶向是细胞型特异性的，因为cDC 1不能促进T细胞增殖。6C)。重要的是，T细胞受汤姆刺激+Cdc 2和Tom−年轻小鼠的DC2产生的肿瘤坏死因子-α比用cDC 2刺激的成年小鼠的T细胞更多(如图所示)。6d)。值得注意的是，这与来自胎儿组织的人脾cdc 2形成鲜明对比，后者通过arginase 2抑制T细胞来源的tf-α。43。汤姆刺激T细胞−幼鼠的DC2也比成年小鼠用cDC 2刺激的T细胞产生更多的干扰素-γ(图二)。6d和补充图。7b)。TOM刺激T细胞后，IFN-γ的产生也增加。+幼鼠的cDC 2与成人的cDC 2相比较(图1)。6d和补充图。7b)，尽管差异没有达到统计意义。这样，汤姆+Cdc 2和Tom−幼鼠的DC2诱导T细胞产生更多的肿瘤坏死因子-α，Th1的分化程度高于成年的cDC 2。Th1分化增强可能与幼鼠在CpG-B刺激下cDC 2中IL-12p40的产生略有增加有关(图一)。6B然而，其他因素，如共刺激分子，很可能是。5A)，也作出贡献。值得注意的是，tdc 2刺激的T细胞与成年小鼠产生Th2细胞因子和Foxp 3表达相似(图1)。6d和补充图。7b)未见Th17细胞因子的产生。在一起，早年的汤姆+Cdc 2和Tom−DC2在体内具有诱导T细胞增殖的能力，但在CpG-B刺激作用下，早期cdc 2诱导的Th1反应较成人cDC 2增加。

与成人生活相比，早期的CDC室在诱导免疫能力上表现出数量和质量上的差异，这使得一些人认为早期CDCs在功能上可能是不成熟的。在这里，我们开始界定的原因，年龄依赖性的功能差异的CDCs。我们证明，早期的cdc 2表现出一个独特的造血来源，类似于其他髓样细胞和淋巴样细胞，在发育过程中的特定时间顺序发育。与其他在波浪中形成的细胞类型形成对比42,80,81,82细胞起源对细胞功能的影响很小，因为早期个体遗传上不同的cDC 2在转录和功能上相似，出生后2周内可使幼稚T细胞处于与成年小鼠的cDC 2相当的水平。相反，我们的数据表明，早期和成人时期的细胞因子环境中，cDC 2具有独特的基因表达谱，从而改变了它们对致病刺激的反应能力、分泌细胞因子和诱导T细胞分化的能力。因此，早期的cdc 2在功能上是有能力的，但在转录上预先倾向于对病原体有不同的反应，并诱导不同的T细胞反应。

在早期，cdc 2的大部分来源于Clec9a-负祖先在这里表示为Tom−DC2这些细胞在出生后的最初几周内被善意产生的细胞所取代。Clec9a-表达髓系cdc祖细胞，表示为Tom。+Cdc 2.与Clec9a-cre表达史，我们发现证据表明淋巴对早期cdc 2室的贡献Rag1CRE和Il7rCRE随着年龄的增长而下降的老鼠。Rag1CRE同时标记卵黄囊衍生淋巴肌样初级祖细胞的后代。66和Il7rCRE卵黄囊来源的巨噬细胞中有表达史。111。因为我们排除了卵黄囊的来源，但证明cdcs是多年期-依赖，我们的数据表明HSC来源的淋巴系统对早期CDCs的贡献。这样的淋巴祖细胞很可能起源于胎儿肝脏的祖细胞，因为我们发现脾cDC 2早在E16.5就有了(图一)。2C和补充图。1D)，在那个阶段，造血尚未定植骨髓112,113。这一概念得到了宫内的进一步支持。CXCR 4克里尔命运映射77。有人提出了一种产生CDCs的淋巴途径。69,71,72,73,74但对成年小鼠的稳态cdc池没有贡献。48,74,76。我们的数据表明，在早期生命中，淋巴细胞对小鼠的疾病预防控制中心室有一定的贡献。这种分层的个体发育让人联想到在发育过程中以波浪形式发展的其他免疫细胞，包括巨噬细胞、肥大细胞、白细胞介素(ILCs)、B细胞和T细胞。42,80,81,114,115。虽然分层免疫发育可以生成逐步适应的免疫种群。80,81,82汤姆+Cdc 2和Tom−DC2表现出明显相同的表型、转录谱和相似的细胞功能，这与其他比较人和小鼠淋巴或髓系祖细胞产生的CDCs的研究是一致的。74,116。汤姆之间可能存在功能上的差异。+Cdc 2和Tom−在我们尚未探索的情况下，dc2；然而，当真正的cdc祖细胞没有足够的数量来生成完整的cdc时，淋巴管生成可能会补偿dc生成。74。这一假说与新生小鼠骨髓CDPs和前CDCs的低频率相一致。Cdc样细胞在早期是否起源于淋巴祖细胞(如clps)，还是来自已经分化的淋巴样细胞(如pdc或lcs)的转换。117,118,119需要调查。我们和其他人建议，CDCs和其他单个核吞噬细胞主要应根据其个体发育来定义。5,114,120然而，我们的数据暗示，如果不同来源的种群在所有被检查的标准中都是相同的，那么对细胞定义的个体遗传学观点可能就不可信了。74,79,121,122,123.

继续先前的研究9,10,17我们用大标记板用流式细胞仪分析了疾病预防控制室的年龄。我们证明了脾CDCs的主要亚群，包括cdc 1，非典型CD8。+CDCS以及ESAM高埃萨姆低层Cdc 2，早在出生后1周就存在于小鼠脾脏中。这些发现进一步证实了使用不带偏见的解剖1周龄小鼠疾病预防控制中心室使用scRNA-seq。在此分析中，cdc 1在多个集群中分离，可能反映了这个区域内的功能异质性。17,124。非标准CD8+与pDC或cdc 1相比，cdc更接近cdc 2，这与成年小鼠的大体积转录组分析一致。59,60。虽然非标准CD8+CDCs最近被建议在成年小鼠中形成一种具有pdc和cdc 2特性的过渡性细胞型。125，我们的数据显示非典型的CD8。+CDCS作为一种独特的DC亚群，在早期与cDC 2有着密切的相似之处。在scrna-seq中，早期的cdc 2分布在两个与esam相似的主要簇中。高埃萨姆低层成人脾脏中的亚群62，尽管在不同的年龄被描述，但它们也分别与T-bet阳性和T-bet阴性cdc 2相似。92。我们还发现了一群类似移行性CDCs的细胞，最近在成人脾脏中观察到。92。重要的是，scRNA-seq揭露了汤姆−DC2和Tom+Cdc 2转录相同。虽然散在rna-seq发现了tomm基因表达的差异。−汤姆的DC2+Cdc 2，我们可以将这些基因与一组独特的RORC-表达类似于cDC 2但缺乏cdc 2的细胞。Clec9aCRE表达历史。相应地，RORγt+利用流式细胞仪鉴定TOM中的细胞−早期DC2与RORγt+成人脾中未见cDC 2。RORCCRE-介导的命运定位和轨迹分析表明，这些细胞不太可能作为cDC 2或其他CDC亚群的祖细胞。事实上RORC-表达簇11，与假定的rorγt-调控的cDC2B分离。92(集群3)进一步支持RORγt+汤姆−DC2是一种独特的CDC亚型，存在于生命早期。

虽然在成人脾脏高细胞构成cDC 2的优势群体，该亚群在1周龄以下小鼠中占cDC 2的少数。埃萨姆高埃萨姆低层Cdc 2可激活CD4+T细胞，但它们促进效应细胞分化的能力可能不同。62,92,126。我们主要在2周至2.5周龄小鼠中对cdc 2进行了描述。高埃萨姆低层子集分布已经达到成人水平，因为充分的Tom+Cdc 2和Tom−DC2可以被分离出来，用于探测细胞功能。在这个时候，脾汤姆+Cdc 2和Tom−DC2具有启动T细胞活化的能力，但在体外极化条件下诱导Th17和Treg分化程度明显高于成人cDC 2。这些观察结果可能与cDC 2在早期和成年期独特的基因表达谱有关。早期的cdc 2表达了更高水平的促进tregs的因素，例如拉格斯1, ALDH 2，和Sema4a100,101,102,103,106提示cDC 2在早期具有较高的耐受性潜力，这也与其对CpG-B刺激后IL-10的产生相一致。较高水平Il6ra幼鼠的cdc 2可增加IL-6的转运104促进Th17的分化，同时减少Th17的表达。Tnfsf 4(OX40L)及镉274(pd-l1)早期，可抑制Th17的分化。97,98,127,128。其中一些与年龄相关的转录变化可能与1周龄和成年小鼠cDC 2组成的微小差异有关。尽管如此，我们还是认为年龄是影响变异的最主要的因素，因为我们证明了高埃萨姆低层Cdc 2在早期和成年期的功能不同。

Cdc 2具有年龄依赖性的基因表达谱，可以改变其诱导T细胞分化的能力，这一观点在早期和成年时通过靶向抗原传递到cdc 2，然后在体内外抗原呈递，这一观点得到了进一步的支持。25,107。这一方法使我们能够(A)比较不同年龄的细胞在体内的功能，同时排除年龄依赖的其他免疫成分作为混杂因子的功能调节，以及(B)展示靶向cdc 2诱导T细胞反应的潜力。之所以选择cpg-b作为佐剂，是因为尽管有相似之处。TLR 9跨年龄的表情，汤姆+Cdc 2和Tom−2周龄小鼠的DC2在体外CpG-B刺激后产生了明显的细胞因子，其中IL-12p40、IL-6、IL-10和IL-27水平较高，随着年龄的增长，cDC 2具有明显的免疫反应性。IL-27是一种多向性细胞因子，具有多种细胞类型的促炎和抗炎作用。129，但在小鼠免疫后，其表达与保护性CD8有关。+T细胞反应130。儿童外周血白细胞介素-27产生率高于成人DC。110但是cdc 2衍生的IL-27是否在早期免疫中起作用还有待进一步研究.尽管会产生更多的白细胞介素-10，这会抑制CD4。+T细胞反应131，早年汤姆+Cdc 2和Tom−在CpG刺激的背景下，DC2在DCIR 2介导的抗原靶向作用下，与成人的cDC 2相比，诱导了类似的OT-ⅡT细胞增殖。然而，早期的cDC 2诱导T细胞产生更大的Th1分化和肿瘤坏死因子-α的产生.人胎儿DC2抑制T细胞分泌肿瘤坏死因子-α43提示cDC 2功能在出生后动态变化。胎儿和新生儿cDC 2的转录谱，可能在单细胞水平上，可能提供更深入的过程，参与塑造早期的cdc 2功能。年轻小鼠和成年小鼠细胞因子生成和T细胞刺激能力的差异不仅仅是在PRR表达水平上的调节，而且可能与下游信号事件、共刺激分子或表观遗传修饰有关。因此，当细胞通过具有不同年龄差异基因表达的PRRs刺激细胞时，cDC 2功能上的年龄依赖性差异很可能会被放大，并且必须测试额外的佐剂是否有能力促进cDC 2介导的T细胞启动和随着年龄的增长而分化。

我们的研究表明，脾脏的cDC 2不存在Th2偏倚，这与发育中的肺中的cDC 2形成了鲜明的对比。在此器官中，IL-33诱导cdc 2表达OX40L，从而促进Th2的倾斜。30。因此，位点特异性的细胞因子环境似乎在不同器官和年龄的印记CDC功能中起主要作用。这与以前的研究是一致的。38,92我们观察到，与年轻小鼠相比，成年小鼠的cDC 2基因丰富，参与了IL-2、IFN-γ、TNF-α和IFN-α下游信号转导通路。在我们手中，来自GF小鼠的cDC 2并没有重现新生的cDC 2的表型和功能特征。虽然GF小鼠完全没有辅助性，但在SPF环境中，cDC 2预计在出生的头几天内会遇到多种微生物信号。因此，我们认为，这些观察并不排除微生物衍生的信号或响应于共栖物的信号在影响cDC 2功能中发挥作用的可能性。在断奶过程中，肠道微生物引起了一种称为“断奶反应”的细胞因子反应，这是正常免疫发育所必需的。132。由于cDC 2在我们的手中已经被评估在这一时期，这是有趣的推测，细胞因子或其他因素的变化，以反应变化的辅助性或饮食在断奶期间参与塑造疾病预防控制中心的功能随着年龄的增长。这种影响甚至可以通过对祖种群的持久改变来实现，类似于训练有素的免疫概念。

新生儿极易感染白色念珠菌, 百日咳波氏杆菌，和肺炎链球菌，这会导致早期生命危险的并发症。1,133,134。防御这些病原体需要Th17的反应。135,136。我们的实验证明，早期的cdc 2完全能够激活幼稚的cd4。+T细胞和支持Th1和Th17分化的细胞突出了利用这些细胞促进早期保护性免疫的潜力。例如，在针对cdc 2功能的特定年龄参数的佐剂中，可以通过向cdc 2提供特异性抗原来实现这一目标。