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独立和累积的腹腔疾病易感位点与不同的疾病表型有关

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发表时间:2021-01-18 14:15作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

由于不完全了解的原因,腹腔疾病的表型差异很大。我们研究了已建立的腹腔疾病易感性变异(SNPs)是否单独或累积地与不同的表型相关。我们还测试了基于基因组相关(GWA)数据的多基因风险评分(PRS)是否能够解释表型变异。对625例完全表型的腹腔疾病患者和1817例健康对照者进行了39个非HLA腹腔疾病SNPs表型关联的检测。为了评估它们的累积效应,建立了加权遗传风险评分(WGRS 39),并将其按梯田分层。在病例的PRS模型中,我们从最大的腹腔疾病GWA研究中进行了汇总统计,并在8岁时检验了它们之间的联系。P值阈值(PT)具有表型。经多次检测校正后,共有10个SNP与不同的表型相关(PEMP 2≤0.0 5)。这个TLR 7/TLR 8基因座与疾病的发生有关。Sh2b3/ATXN 2, ITGA 4/UBE2E3IL2/IL217岁后的位点。后三个位点与更严重的小肠粘膜损伤有关,Sh2b3/ATXN 2患有1型糖尿病。在最高的wGRS 39梯田的病人有OR>1.62,在儿童时期有腹腔疾病相关的症状,一个更严重的小肠粘膜损伤,吸收不良和贫血。复发性皮炎仅与疱疹性皮炎有关(PT=0.2,PEMP 2=0.02)。独立的腹腔疾病易感位点与不同的表型相关,表明遗传因素在决定疾病表现中起着重要作用。此外,腹腔疾病易感性SNP的增加可能会导致更严重的疾病进程。

导言

食物抗原一般不会引起健康个体的全身免疫反应,而是导致口腔耐受性的诱导。然而,在大约1-2%的个体中,摄入食物中的面筋会导致腹腔疾病的发展,这是一种免疫介导的肠病[1]。在一些病人中,腹腔疾病早在儿童时期就开始发展,而在另一些病人中,对面筋的耐受性在相当大的年龄时就丧失了。这种疾病的一个特点是依赖于面筋的小肠粘膜损伤,从轻微的炎症变化到伴有隐窝增生的全绒毛萎缩。2]。肠病常伴有吸收不良及腹泻等肠胃症状,但亦有不同的肠外表现,影响皮肤及肌肉骨骼系统。2, 3]。这种多方面的临床表现因一些相关的情况而进一步多样化,例如1型糖尿病和自身免疫性甲状腺疾病[2].

腹腔疾病的易感性在家庭中存在,而腹腔病人的亲属则面临着更高的风险。4]。疾病易感性主要由编码DQ 2或DQ 8异二聚体的人白细胞抗原(HLA)单倍型决定,这些单倍型对疾病的发展是必要的,但还不够。2]。全基因组关联(Gwa)和后续研究已经确定了43个非HLA危险位点中的94个SNPs,它们本身就适度地改变了疾病的风险[5,6,7,8]。然而,将它们的独立累积效应结合到遗传风险评分(GRS)中,可以提高对疾病风险的预测[9]。此外,通过将小效应位点,包括那些没有达到基因组广泛意义的位点组合成一个多基因风险评分(PRS),就可以检测数千个危险等位基因对腹腔疾病易感性的影响。7, 10].

目前,关于非HLA危险SNPs与不同腹腔疾病表型的联系的信息有限。因此,本研究的目的是研究先前发现的腹腔疾病易感性SNP是否与不同的疾病表型相关,并了解可能的生物学途径和过程。此外,本研究的目的是研究GRS或PRS是否为导致本病临床异质性的因素提供线索。

材料和方法

学习人口

在坦佩雷大学和坦佩雷大学医院,一份全国性的报纸广告和芬兰Coeliac协会的援助共招募了1048名经活检证实的腹腔疾病患者。研究议定书得到坦佩雷大学医院区域道德委员会的批准,所有研究对象或幼儿法定监护人都给予书面知情同意。所有参与者都接受了一位医生或一位在腹腔疾病方面具有专业知识的研究护士的采访。结构化访谈包括关于腹腔疾病诊断的问题、诊断时和儿童时期的症状以及相关的医疗条件。所有相关医疗信息均从患者记录中得到确认。抽取全血样本进行遗传分析。由于亲属的存在可能导致遗传偏见(1型错误的膨胀),目前的研究只考虑了每个家庭一个腹腔病例,导致625个病例分组为相关的表型(表)。1)。患者的中位年龄为41岁,从0.5岁到79岁不等。该个体是随机从具有完整基因型数据的家庭成员中选择的。健康对照组(n1817)与性别和HLA-类型有关的信息来自FINRISK和健康2000人口队列[11]。伦理委员会的批准可从国家公共卫生研究所的伦理委员会和赫尔辛基和乌西马医院区的流行病学和公共卫生伦理委员会获得。

表1诊断时625例腹腔疾病患者的人口学数据、临床特征和腹腔疾病相关表现

基因分型与质量控制

用Taqman化学、SSP DQB 1和DRB 1低分辨率试剂盒(Olerup SSP AB,Saltsj Baden,瑞典)或DELFIA进行hla-dq分型。®腹腔疾病杂交试验试剂盒(PerkinElmer Life and Analysis Science,Wallac Oy,Turku,芬兰)[12, 13]。对于缺失HLA分型结果的患者和对照组,用HIBAG R软件包进一步推测缺失的GWAS SNP为HLA单倍型。14].

所有参与者都在Illumina 610-四芯片阵列(Illumina Inc.,San Diego,CA,USA)上对SNP集进行了基因分型[5]。选择有腹腔疾病风险的SNPs。我们包括在早期GWAS中发现的39个非HLA腹腔疾病SNPs[5在我们的样本中直接进行基因分型。正如Trynka等人所确定的大多数SNP。学习[6]不是在我们的数组中找不到,就是基因分型频率低,它们被估算出来(在“估算”一节中有更多的细节)。

基因型保存在BC│Genome v.4.0(BC│平台,芬兰)中,并进行质量检查[15]。基因型和推测的SNPs通过质量控制(QC)筛选,缺失基因型率<5%,缺失基因型率差异(<3%),小等位基因频率(MAF>1%)。16]。所有标记为(P>1×10−6)在HWE中的控件[6, 16]。等位基因与表型的关联在病例对照分析和病例内部进行了测试,并在“统计分析”部分作了进一步的详细说明。

归责

94例腹腔疾病危险变异型的基因型[5, 6]通过使用3775个高覆盖度(25-30×)全基因组序列(Sisu V3)的芬兰群体专用面板(Sisu V3)进行分期和估算,如下所述:dx.doi.org/10.17504/protocol s.io.nmndc5e。Sisu v3小组是在麻省理工学院和哈佛大学的布罗德研究所和华盛顿大学的麦克唐纳基因组研究所生成的,并在博德研究所联合加工。

用我们的芯片平台产生的基因分型数据被提升到基因组构建版本38(GRCh38/hg38),按照这里描述的协议:Https://doi.org/10.17504/protocols.io.nqtddwn。在样品质量控制(QC)中,剔除性别差异、高基因型缺失(>5%)、高杂合度(±4SD)和非芬兰血统的样本。在变型QC中,高失配(>2%)、偏离Hardy-Weinberg平衡(HWE)的变异体(HWE)(P < 1e-6) and minor allele count <3 were removed. Pre-phasing (default parameters, except the number of conditioning haplotypes was set to 20,000) and phasing of genotyped data were performed with Eagle 2.3.5 (Https://data.broadinstitute.org/alkesgroup/Eagle/)

用Beagle 4.1进行了估算(08Jun17.d8b版,Https://faculty.washington.edu/browning/beagle/b4_1.html)如以下协议所述:dx.doi.org/10.17504/protocol s.io.nmndc5e。可变呼叫集是通过遵循GATK最佳做法而产生的。基因型、样本和变异型QC采用迭代方式,使用Hail框架v0.1[Https://github.com/hail-is/hail].

在估算后QC中,计算质量指标较好的SNP(INFO评分≥0.8)和MAF>0.0 1。使用bcftools处理具有基因型概率剂量的VCF文件(Https://samtools.github.io/bcftools/)

与表型相关SNP相关的富集途径的功能鉴定

鉴于腹腔疾病相关的SNPs可能不是因果变异体,而是位于与其密切相关的位置,例如高连锁不平衡(LD),FUMA(功能映射和GWAS注释)平台[17]用于39个基因型SNP的功能注释。可公开获取的GWAS汇总统计结果,其中包括我们的队列[5]并在本研究中提供了与表型相关的SNPs的预定义列表。劳工处所有代理人(r2≥0.8)与表型相关的SNPs,用单纯性Reg v.4.1[18]。RegulomeDB 2.0[19]用于给所有变异体分配一个从1a到7分之间的分数,从1a到3a的分数很可能会影响基因的表达。得分越低,相似程度越高,因此1a表示影响基因表达的最大可能性和3a最小可能性[19]。评分为≥3a但被预测为有害的变异体[联合注释依赖性耗竭评分最近或>12.37]也被包括在内[20]。对于那些表型相关的SNPs评分>3a,我们选择了它们的代理,其RegulomeDB评分最低[19]。利用公开数据库研究组织特异性基因表达,我们检查了与基因附近(顺式-eQTL)或远端(反式-eQTL)的功能变体之间的显著的eQTL关联(FDR<0.05)。用血液eQTL对其进行全血和外周血检测。21]、BIOS QTL[22]和eQTLGen[23]浏览器。此外,由于腹腔疾病的表型差异很大,症状可能影响多种细胞组织的功能,我们还使用了基因型组织表达数据(脑、神经、结肠、食道、EBV转化淋巴细胞、肌肉骨骼、胰腺、皮肤、小肠、胃、培养成纤维细胞、甲状腺、全血)[24]。利用KEGG(京都基因和基因组百科全书)和去(基因本体)数据库[25].

遗传风险评分

为了评估39个非HLA-SNP基因型对表型的累积影响,我们建立了一个加权grs模型(Wgrs 39),计算方法是将每个等位基因乘以先前报告的OR值的自然对数(β-系数)[5,然后将它们的和除以等位基因总数[9]。我们分析了WGRS 39模型在土质中的分布,并根据公布的对照组加权平均风险等位基因的分布,对性别进行了调整。26]。根据这些梯田,所有参与者都被划分为低、中、高风险组.

多基因风险评分

我们利用最近和最大的腹腔疾病GWAS的汇总统计数据导出了一份PRS,共有24,269名参与者[6]作为发现数据集,并测试其与表型的关联。在我们的队列中只提取病例后,我们进行了电梯操作。Https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver)将我们的基因型数据更新到最近的人类基因组构建(Hg 19)中,剩下624例和526,118个SNP。我们应用了上面描述的质量过滤器,并据此构造了PRS[27使用PRSice软件包中的“快速得分”选项[28]。PRSS计算为该个体所携带的所有风险变量之和,并按β-发现GWAS中报告的系数[6]。为了考虑独立的关联信号,群集保留了最小的snp。P值在每个250 KB窗口中,并删除所有LD中的值(r2>0.2)使用本SNP[7]。有长期LD(29.7至33.3兆)的MHC区域的SNP被排除在外[10]。PRS是根据一组先验的重要阈值计算的(P < 0.001, P < 0.01, P < 0.05, P < 0.1, P < 0.2, P < 0.3, P < 0.4, P < 0.5) to identify the best fit PRS that was most predictive of an association.

统计分析

基因分型39个SNPs的等位基因关联用单自由度的X-平方法进行检验,用OR值和95%置信区间进行测定。Logistic回归调整SNP-性别互动。我们表演了10场4置换测试,产生一个经验性的PEMP 2用于小样本组的评估和多项测试的调整[16]。有统计学意义PEMP 2≤0.05。Breslow-Day(BD)检验了协会OR的同质性[P屋宇署每个男性和性别阶层的数值<0.02(0.05/2)[29].

采用SNPTEST v2.5.2中实施的频率似然评分法,在加性遗传效应模型下进行表型关联检验。30]。所有相关因素均采用SNPTEST方法Newml进行性别调整。对于ChrX区域,我们还使用了带有分层-on性别选项的特定于ChrX的SNPTEST方法。达到我们排列阈值的联想(P≤值0.001)被认为具有统计学意义。

使用遗传功率计算器[31],我们计算了样本集对每个相关表型的统计能力,以检测排列时的等位基因关联(P≤0.001)和标称(P≤0.01和P(≤0.05)阈值(补充表中的详细结果)沙一)。SNPs被假定为独立的因果变量,而在联系不平衡中没有其他因果变量(D‘=1)。

所选变体位于附近的eQTL关联(顺式-eQTL)或远端(反式-eQTL对基因的发现率(FDR)<0.05,差异有显着性(P<0.05)。利用基于web的基因集分析在线工具包,进行了由benamini&hochberg程序调整的整体表征分析。25]鉴定富含KEGG途径的eQTL基因集和Go生物学过程(FDR<0.05)。

采用Logistic回归方法,比较各组(中、3、2、3、3、3、4、3、3、3、3、3、3、3、3、3、3、3、3、3、2、3、3、3、2、3、3、3、3、2、3、3、2、3、3、2、3、3、以95%的顺式识别系统(Cis)对关联进行量化,结果表明:P值<0.05。在我们的案例模型中,我们使用线性Logistic回归,根据年龄和性别对PRS和表型之间的关联进行了检验。通过应用10种方法解决了多重比较问题。4排列以确定最适合的PRS(PEMP 2≤0.0 5)。结果显示为方差的变化(R2),两者都未经调整P价值观和PEMP 2价值。

所有数据分析、计算分析和图表中所需输入格式的转换都使用plink 1.90(Https://www.cog-genomics.org/plink/1.9),Plink 2.0(Https://www.cog-genomics.org/plink/2.0/)、PRSice v2和RStudio(版本1.1.463-©2009-2019年RStudio公司,波士顿,美国)。

结果

腹腔疾病表型的遗传关联

在先前发现的94个腹腔疾病相关变异中,有39个在足够的程度上被分型,因此被选中进行研究。当将腹腔疾病患者与对照组进行比较时,10个SNP与特定表型相关(表)2,及补充表S2)。中的rs 5979785TLR 7TLR 8该地区与腹腔疾病诊断有关,≤7岁,性别分层显示,这种关联只发生在女孩身上(布雷斯洛日试验,P < 0.001). This SNP was associated with the age of coeliac disease diagnosis in girls (OR = 0.11; 95% CI = 0.03–0.46) also in the case only analysis comparing coeliac disease patients with the given phenotype to those without (detailed results in Supplementary Table S3)。在病例对照分析中,对于7岁以上的腹腔疾病诊断,rs 653178(atSh2b3/ATXN 2),rs 13010713(atITGA 4/UBE2E3),rs 13151961(见IL2/IL21),rs 11712165(见CD 80)和rs 10936599(地址:梅恩)显示出一种联系。除了rs 10936599,同样的变异也与HLA的中度风险有关。此外,rs 653178、rs 13010713和rs 13151961与胃肠道症状的出现以及诊断时存在更严重的粘膜损伤(TVA/SVA)有关。此外,rs 653178还与肠外表现以及腹腔疾病相关的一般情况,更具体与AITD和T1D有关。

表2芬兰病例对照材料中不同表型的结肠疾病危险变体基因型的相关性

为了探讨所有94种腹腔疾病相关SNP的相关性,我们进行了推测。在本研究的2442名受试者中,299人(285例和14名对照组)因杂合和缺失而被排除在外。在选择的94个腹腔疾病SNPs中,5个变异体(rs 859637,rs 2327832,rs 12928822,rs 58911644,rs 4819388)和一个(Rs 12998748)在芬兰参考面板中缺失,因此退出了分析。其余88种腹腔疾病变异体均成功地进行了表型预测和测试(详见“补充表”)。S4).

根据利用推测的SNP的结果,5个基因型SNP(rs 5979785,rs 653178,rs 13010713,rs 13151961,rs 17810546)仍然与原分析中相同的表型相关。7个估算的SNPs(rs3184504 atSh2b3/ATXN 2,rs 76830965 atIL12A,rs 7616215 atCCR 1,rs 17264332 atOLIG 3/TNFAIP 3,rs 243323 atSOCS 1,rs 13132308 atIL2/IL21和rs 990171 atIL18R1/(IL18RAP),显示为关联(P≤0.001,按性别调整)具有不同的表型(表)3,及补充表S4)。其中rs 76830965与腹腔疾病诊断≤7岁、胃肠道症状及吸收不良、中间型HLA风险及腹腔疾病自身抗体有关。此外,rs3184504与腹腔疾病诊断年龄>7岁、肠外表现、腹腔疾病相关疾病及T1D相关,且与HLA的中度风险有关。其余5个推测的SNPs仅与1种表型相关。由于47.8%的病例被排除在与推测SNPs的关联分析中,我们对39个基因型SNPs进行了其余的分析。

表3芬兰病例对照材料中88种腹腔疾病风险变异与不同表型的关联。只有计算数据的变体以粗体突出显示。

功能注释与路径富集分析

在10个表型相关的基因型SNP中,4个变异体(rs 11712165、rs 10936599、rs 2327832和rs 13098911)对转录具有较强的调控作用,其≤3a评分为Rs 11712165、rs 10936599、rs 2327832和rs 13098911。在这些建议中,13098911含有得分最低的代理人(1a和1f)。在提取的148个与其他表型相关的SNPs(rs 653178,rs 13010713,rs 17810546和rs 2298428)中,42个在基因调控(RegulomeDB评分≤3a)中发挥了功能作用(补充表)。S5)。此后,我们对可能调控基因表达或有害的SNPs或代理基因寻找eQTL效应。我们确定了几个高度组织特异性的eQTL效应(FDR<0.05)(补充表)。S6)。通过相关的SNPs或它们的代理连接到每一表型的eQTL基因随后接受KEGG通路和GO术语分析。

分析顺式-个别表型的eQTL基因,仅在儿童期腹腔疾病症状、神经疾病、聚乙烯醇和阴性腹腔疾病抗体(补充表)中才显着富集。S7)。4个顺式-eQTL基因(CCR 5, CCR 3, CCR 2, CXCR 6)在趋化因子信号和细胞因子-细胞因子受体相互作用的KEGG通路中富集(fdr≤0.002)。这些基因可能参与调控趋化因子和细胞防御反应,细胞趋化性第二信使介导的信号和基于GO相关术语的二价无机阳离子同态平衡(fdr≤0.0001)。7岁以上的腹腔疾病诊断、胃肠道症状、腹腔疾病相关情况、Ei表现和中度HLA风险是与一组疾病相关的表型。反式eQTL基因。在KEGG通路中,它们在B细胞受体信号、百日咳、NOD样受体信号和癌组织中的≤中最显著地富集(fdr 0.0 1)。它们被富集(fdr≤2.2E-09),因为生物过程主要涉及适应性免疫反应、T细胞活化、干扰素-γ反应、白细胞-细胞粘附、细胞因子分泌、白细胞活化调节和对细菌来源分子的反应(补充表)。S7).

遗传风险评分和多基因危险评分与腹腔表型的关系

为了研究39个单核苷酸多态性对不同表型的联合效应,我们采用了wGRS 39泰坦(补充表)。S8)。在最高的wGRS 39梯田中,儿童时期出现腹腔疾病相关症状(OR=1.76,95%CI=1.12-2.77)、小肠粘膜损伤更严重(OR=1.76,95%CI=1.08-2.90)、吸收不良(OR=1.62,95%CI=1.04-2.54)和贫血(OR=1.68,95%CI=1.03-2.78)的风险显著高于WGRS 39的患者(表)。4,及补充表S8).

表4芬兰腹腔疾病诊断中加权遗传风险评分(WGRS)(在梯田中)与coeliac表型的关系

在PRS分析方面,我们发现PRS对DH有显著的影响P值阈值(PT0.2,R2=0.06,P=0.007,PEMP 2=0.02)(图1。1A)。最适合PT其中0.001例预测骨折的存在,但未坚持置换矫治(R2=0.025,P=0.043,PEMP 2=0.12)(图1。1B,及补充表中9).

图1

多基因危险评分(PRS)预测疱疹性皮炎(a)和骨折(b)在腹腔病人的诊断中。每条以上的值未经调整。P回归分析中的表型值

讨论

在本研究中,通过在我们的队列中使用基因型变异,我们确定了一个基因型-表型关联的10个SNP以前与腹腔疾病易感性。此外,我们的结果表明,将39个腹腔疾病相关的基因型SNP组合到wGRS 39中比PRS更能评估腹腔疾病不同表型的遗传风险。

根据我们的结果,rs 5979785位于TLR 7TLR 8基因与女孩在7岁前被诊断的风险降低有关,尤其是这种关联也仅在比较的情况下被发现。我们的RegulomeDB分析没有检索到rs 5979785,因为它具有转录调节功能,尽管以前有报道说它降低了TLR 8在血液中的表达[5]。TLR 7和TLR 8都是Toll样受体家族的成员,它们检测到不同形式的病毒核酸,并启动抗病毒反应。32]。作为不同的病毒,包括肠病毒,已被认为是腹腔疾病的危险因素[33, 34],需要对这些与病毒感染和早期腹腔疾病发病有关的基因座进行更多的研究。

我们的结果还显示rs 653178在Sh2b3/ATXN 2增加其他几种表型的风险,包括伴随的T1D。因此,我们的发现与先前的研究一致,其中12q24/SH2B3位点既与腹腔疾病有关,也与T1D[8, 35, 36]。在这些研究中,rs 3184504,LD中的一个功能代理,rs 653178[37],被认为是该协会背后的真正的苏格兰民族党。虽然rs3184504不包括在我们最初的一组基因型SNPs中,但我们发现它与与推测基因型相关的T1D有关。

在我们的分析中,除了对转录有可能的调节作用和SH2B3的表达以及许多其他基因的eQTL效应外,rs3184504 SNP还与活跃性腹腔疾病患者肠粘膜中SH2B3的高表达有关[38胰岛自身免疫[39也与细菌感染有牵连。40],使我们队列中的12q24/SH2B3位点关联感兴趣,以供进一步研究。

为了阐明易感性SNPs对表型的影响机制,我们发现我们的表型相关SNPs中只有3个对基因表达有显著的eQTL效应。这意味着我们的分析中包含的SNP大多是代理,或者位于因果变量的附近或更远的地方。在kegg通路和GO生物过程分析中,表型相关的rs 13098911 snp被确定为唯一具有顺式-eQTL对一组富含趋化因子途径的基因的影响。这一发现很可能反映了这种变异在趋化因子基因簇中的位置。

富集结果反式-eQTL基因为我们的大多数表型确定了基本相同的途径。所有这些表型均与rs 653178相关,其代表rs3184504对多个远端基因的表达有显著影响。因此,rs3184504的这种多向效应很可能解释了我们对rs3184504的路径富集分析的发现。反式-eQTL基因。因此,需要进一步的研究来推断出真正的表型-因果变异以及可能介导其对表型变异的影响的机制。

根据我们的加权39 SNP风险评分模型,WGSR 39中的高风险畸胎与儿童出现腹腔疾病症状的风险更高,小肠粘膜损伤更严重,吸收不良和贫血的发生率更高。这些表型可被视为更严重疾病病程的征兆。2, 41因此,增加腹腔疾病易感性SNP的可能性可能更大。相反,将来自数千个基因组变异体的信息组合成一个PRS有助于解释除了DH之外的表型差异。造成这种情况的一个主要原因可能与以下事实有关:在大型病例控制的GWAS中,与疾病状态没有直接关系的遗传位点可能会缓和腹腔多基因负担与表型之间的关系。7, 10]。因此,表型变异的主要遗传贡献似乎来自与疾病易感性相关的位点。

目前这项研究的一个主要优点是临床上表现良好的大群腹腔病人。此外,一个力量是患者的谨慎表型,使我们可以调查不同基因型与不同表型的关联。此外,估算分析还允许我们进一步探讨49个以前在我们的队列中没有分型的腹腔疾病SNPs的表型关联。在芬兰人口中使用最全面的可用估算小组,增加了我们识别与表型相关的新的腹腔疾病SNPs的机会。我们在估算分析中高度保守的程序降低了假阳性关联的风险。必须指出的是,47.8%的腹腔疾病患者退出了分析。此外,对于不同的表型,我们有相当少的病人数量,这影响统计能力在某些情况下。此外,我们的grs研究仅包括来自独立腹腔疾病危险位点的39个基因型SNP,而不是所有以前与腹腔疾病相关的94个基因,而且可能是其他coeliac易感性spp对表型有调节作用。


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