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溶血磷脂酸通过LPAR 5激活角质形成细胞介导银屑病发病机制

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发表时间:2021-01-18 11:16作者:武汉新启迪Xinqidibio

银屑病是一种常见的免疫介导的慢性炎症性皮肤病,其特点是表皮棘皮炎、角化过度症、角化旁变性和炎性细胞广泛浸润。1在银屑病发生过程中,KCS在皮肤天然免疫和适应性免疫反应中起着至关重要的作用,1产生大量的炎症介质,如抗菌肽(如S100A8,9),促炎细胞因子(如IL-6,IL-17A,C,TNF-α)和趋化因子(如CXCL 1,2),触发先天或适应性免疫反应。1

脂质在维持正常的生理细胞功能中起着重要的作用,大约有成千上万种不同的脂质和大约六百种不同的人类脂类分子。溶血磷脂酸(LPA)是自然界中发现的最简单的磷脂,是细胞磷脂合成早期的重要前体。2针对LPA受体或LPA受体缺陷小鼠的抑制剂或激动剂,显示了LPA或LPA受体的生理或病理功能的多样性。我们先前的研究发现,与甘油磷脂代谢有关的酶,如LPA、LysoPC和PA,在银屑病患者的血浆中有明显的改变。2然而,LPA及其受体在银屑病发病机制中的作用尚不清楚。

在这项研究中,我们发现LPA水平在银屑病患者的血清中显著升高(附图)。1B)和ImQ诱导的小鼠银屑病皮损(补充图。1A)。为了研究LPA对银屑病的治疗作用,我们用LPA治疗人角质形成细胞(NHKCs),但LPA不影响细胞增殖(补充图)。2ALPA治疗后,银屑病相关炎症因子mRNA表达上调(附图)。2B)。最重要的是,LPA局部治疗加重了IMQ引起的银屑病样炎症,包括增加了耳朵的表皮厚度和PASI评分(见图)。1A和补充图。2C),以及Th17和Th1在IMQ介导的银屑病皮损中的积聚(图1。1B)。此外,LPA局部治疗提高了银屑病相关炎症因子在小鼠皮肤损害的转录水平(补充图)。二维空间),表明LPA能促进IMQ诱导的银屑病样炎症。但LPA对Th17和Th1的分化无显著影响。3LPA通过KCs调节银屑病的发病机制。

图1

LPA通过激活角质形成细胞的炎症功能而促进银屑病的发病。a用耳廓厚度(左板)和PASI(右面板)评分评价IMQ或ImQ+LPA治疗后小鼠皮肤损伤。显着性差异采用双向方差分析,*n=6,p < 0.05. bCD 45的流式细胞术分析+和Th17细胞在小鼠耳部损伤后经ImQ或ImQ+LPA治疗后,采用双向方差分析,*评价差异有显着性(P<0.05)。n=4,p < 0.05. c用耳廓厚度(左板)和PASI(右面板)评分评价IMQ或ImQ+ATX抑制剂治疗后小鼠皮肤损伤。显着性差异采用双向方差分析,*n=6,p < 0.05. dCD 45的流式细胞术分析+和Th17细胞在耳部病变的上述实验中,采用双向方差分析,*进行显着性差异评价。n=4,p < 0.05. e银屑病皮损LPAR 5表达的IHC图像分析(英文)n=70)及健康对照(n=30)(上面板)。LPAR 5表达的统计分析:IHC,标尺=100μm(下面板)。f用耳部厚度(上面板)和PASI(下面板)评分评估野生型和LPAR 5型皮肤病变。-/-小鼠经ImQ或ImQ+LPA治疗。显着性差异采用双向方差分析,*n=6,p < 0.05. g材料和方法中所描述的从包皮中分离出的正常人角质形成细胞用不同剂量的LPA(左面板)处理60 min,用不同剂量的LPA或LPA+LPAR 5抑制剂(右面板)处理,收集培养上清液,用ELISA法检测DAG的生成。多项实验数据以±S.D表示,采用双向方差分析评价差异。p < 0.05. h采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测银屑病患者血液中DAG的产生。n=42)和健康对照组(n=42)。p-采用单向方差法确定数值;*p < 0.01; **p < 0.001; ***p < 0.0001. i正常人角质形成细胞用LPA处理60 min,用LPAR 5抑制剂或载体预处理2h后,用Western印迹法检测蛋白表达。j用不同剂量的LPA处理NHKCs 60 min,进行Westernblotting。kTLR 2荧光素酶报告基因按材料和方法的描述得到。将PGL3-TLR2和STAT 1转染293 T细胞,按材料和方法进行双荧光素酶报告基因检测。多项实验的数据以±S.D表示,采用双向方差分析,*进行显着性差异评价。n=4,p < 0.05. l用LPA处理NHKC细胞60 min,用STAT 1特异性抗体富集NHKC细胞中的蛋白质/DNA复合物。用RT-PCR和TLR 2启动子区特异性引物验证染色质免疫沉淀中TLR 2基因启动子序列的相对丰度。多项实验的数据以±S.D表示,采用双向方差分析,*进行显着性差异评价。n=4,p < 0.05. m如材料和方法所述,NHKC细胞中STAT 1表达下调。在有无LPA的情况下,从STAT 1基因敲除细胞中分离RNA,用qRT-PCR方法检测TLR 2 mRNA在NHKC细胞中的表达。多项实验数据以±S.D表示,采用双向方差分析评价差异。p < 0.05. n用LPA或LPAR 5抑制剂处理NHKC细胞,进行Western blotting。oLPA信号刺激后,角质形成细胞膜上的LPAR 5通过ROCK和DAG激活PKD 1,促进NF-κB的激活,有利于银屑病相关炎症因子的表达。同时,活化的PKD 1进一步激活STAT 1,STAT 1识别TLR 2基因启动子,诱导其表达。TLR 2作为病原体识别受体,加重了银屑病发病过程中的炎症反应。

众所周知,溶血磷脂酰胆碱(LPC)的水解是产生LPA最重要的来源.3LPC是血液和组织中丰富的溶血磷脂,作为ATX的底物,通过催化作用将LPC水解成LPA。ATX是胞外核苷酸焦磷酸酶-磷酸二酯酶(ENPP)蛋白家族中的一员,具有裂解酶磷脂酶PLD的特性,被分泌到血浆中。4为了进一步验证LPA在银屑病中的作用,采用ATX抑制剂PF-8380,研究了ATX抑制剂对小鼠银屑病表型的影响。我们的研究结果表明,与车辆治疗组相比,PF-8380明显消除了ImQ引起的银屑病样炎症,包括降低耳部厚度、银屑病面积和严重程度指数(PASI)(图一)。1C和补充图。4)。CD 45+PF-8380对小鼠皮肤浸润中的Th17细胞有明显的抑制作用(图1)。1D),提示抑制LPA的产生也能减轻ImQ诱导的银屑病性炎症。

LPA通过其受体发挥生物学作用。LPA受体是G蛋白偶联受体,可与G12/13、GQ/11、GI/o和GS等至少一个或多个Gα蛋白偶联。通过对银屑病相关转录序列的挖掘,我们发现LPAR 3和LPAR 5在银屑病组中有很高的表达(附图)。5)。然后,我们证实LPAR 5在银屑病皮损表皮层的表达明显高于健康对照组(图1)。1E)。为了进一步研究LPAR 5对银屑病的治疗作用,我们制备了LPAR 5基因敲除小鼠(附图)。6A和bLPAR 5的缺失明显降低了IMQ+LPA介导的银屑病样表型,包括耳厚和PASI评分(附图)。7A还有无花果。1F)。此外,银屑病相关炎症因子在LPAR 5中的表达明显下调。-/-在ImQ+LPA存在下的小鼠(补充图)。7b)。然而,CD4+T细胞中LPAR 5的缺失并不影响ImQ+LPA介导的银屑病样表型(附图)。6C,d),提示LPAR 5与CD4无关,在lpa介导的银屑病发病机制中起重要作用。+T细胞LPAR 5是通过无偏筛选方法鉴定的,并与G12/13和GQ/11偶联,分别通过DAG或Rock和蛋白激酶D1(PKD 1)启动下游级联。5鉴于DAG是PKD 1诱导途径的关键介质,我们检测了LPA处理后NHKC细胞中DAG的产生。结果表明,在LPA作用下,DAG的生成呈剂量依赖性增加,而LPAR 5拮抗剂则能抑制LPA诱导的DAG生成升高(图一)。1g)。有趣的是,我们发现银屑病患者血浆中DAG的生成增加。)。此外,我们还发现,LPA处理显著增加了ROCK 1、ROCK 2和P-PKD 1在NHKC细胞中的表达(附图)。9A)如所料,LPAR 5拮抗剂显著阻断LPA触发下游通路,如ROCK 1、ROCK 2、DAG和P-PKD(图1)。1I).

蛋白激酶D是一类应激反应的丝氨酸/苏氨酸激酶,由二酰基甘油(DAG)和PKC的效应因子触发。蛋白激酶D可被多种刺激因子激活,包括生长因子、神经肽、激素等,调节多种生物和病理过程。5有证据表明,PKD 1磷酸化激活了IKKα/β磷酸化,导致IκB降解,p65和p50易位进入细胞核,最终激活NF-κB的转录活性,NF-κB在银屑病发病机制中起关键作用,尤其是KCs的激活。5在本研究中,我们还发现p65和p50在核内的KCs中表达,以及LPA(补充图)诱导的银屑病中p65和p50蛋白的表达增加。9B)。此外,LPA介导的银屑病相关炎症因子的表达被LPAR 5拮抗剂所抑制。9C).

TLR 2属于病原体识别受体之一,它识别PAMPs以启动天然免疫或加重对病原体的适应性免疫反应。PAMPs与TLR 2异源二聚体的结合导致1型IL-1受体(TIR)与TIRAP的相互作用,TIRAP使MyD 88、IRAK形成复合物。随后的磷酸化IRAK导致TRAF 6的激活,触发NF-κB易位进入细胞核,从而提高了包括促炎症细胞因子在内的多种靶标分子的表达。

我们鉴定并验证了TLR 2和STAT 1是LPA在KCS中通过RNA-Seq调控的关键分子。10)。STAT 1是STAT家族的一员,参与多种信号通路的激活。STAT 1在银屑病皮损中明显增高。我们的发现表明,LPA显着地上调了p-STAT 1和非STAT 1的表达。1J)。有趣的是,STAT 1识别其DNA基序并与TLR 2启动子结合,荧光素酶和芯片分析证明了这一点。1K,l和补充图。10a,b),而STAT 1抑制LPA诱导的银屑病相关TLR 2的表达(图1)。1M和补充图。10C)。此外,LPAR 5抑制剂显著抑制LPA介导的KCs中STAT 1、P-STAT 1和TLR 2的表达。1N),表明LPA通过至少部分依赖STAT1-TLR2轴的机制激活角质形成细胞。


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