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诊断准确度核梭杆菌大肠癌IGA和IgG ELISA检测

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发表时间:2021-01-18 11:02作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

结直肠癌是一个严重的健康问题。这种疾病的诊断主要依靠一种侵入性程序。一种非侵入性的诊断试验,如免疫分析法,可促进结直肠癌的诊断.这项研究的目的是评估抗体的用途。核梭杆菌在结直肠癌(CRC)的诊断中。本研究共纳入三组78例。F.核仁用定量聚合酶链反应(PCR)法检测组织中的DNA含量。F.核仁酶联免疫吸附法检测IGA和IgG。F.核仁大肠癌和癌前良性结肠疾病(P-BCD)的检出率分别为86.7%和73.1%。的OD值F.核仁与正常对照组相比,CRC组IGA和IgGELISA检测均有显着性差异。IgA酶联免疫吸附试验的敏感性在31.8%~95.5%之间。高发患者抗体阳性率的研究F.核仁组织中明显大于阴性组。这个F.核仁CRC组IGA和IgG抗体均高于健康对照组,但ELISA检测的鉴别能力不足以作为诊断工具。

导言

结直肠癌是世界上最常见的癌症之一,是对人类健康的重要威胁。1。癌症是一种多因素的疾病,其发病机制复杂。人的肠道拥有高度多样化和复杂的微生物群落,包括病毒、真菌和细菌。2。微生物群结构的紊乱,例如微生物多样性的丧失和有益微生物的消失,可能导致癌症的发生。3。肠道微生物区系的一些居民,如梭杆菌SPP.大肠杆菌脆弱类杆菌涉嫌在儿童权利委员会中发挥作用1。虽然有一小部分F.核仁在肠道微生物区系中发现的,支持它可能导致感染,从而导致结肠癌组织。4.

肠道微生物群落可能通过其代谢产物丁酸和维甲酸影响宿主的免疫系统发育。F.核仁通过入侵和调节宿主免疫应答等多种毒力机制促进crc的发生。5。免疫系统可以产生抗体以防止宿主入侵结肠内的微生物。这些抗体有时对疾病的诊断非常有用,特别是当病原体有机体不能培养的时候。抗体检测是诊断传染病的重要实验室工具,因为它们可靠且易于使用。

这项研究的目的是评估抗体的用途。F.核仁在CRC的诊断中。参考试验为结肠镜检查和活检材料的病理评估。

结果

病人和样本

共78例患者分为3组(CRC组22例,P-BCD组35例,HC组21例).病人的特征见表1。研究人群平均年龄为59.7±15.9岁,女性39例(50%)。中位肿瘤直径4.5cm(2.0~9.5cm),肿瘤直径大于4.5cm者7例(31.8%)。结直肠癌位于乙状结肠8例(36.4%),肝曲1例(4.5%),升结肠2例(9.1%),盲肠1例(4.5%),降结肠2例(9.1%),直肠8例(36.4%)。根据另一定义,18例(81.8%)结直肠癌位于远端结肠(女性:8例,44.4%;平均年龄:62.2±14.2);4例(18.2%)大肠癌位于结肠近端(女性:3例,75.0%;平均年龄:82.0±4.9岁)。

表1研究组和患者特点。

.的数额F.核仁组织DNA

如表所示2对41例配对(15例CRC和26例P-BCD)标本进行qPCR分析.这个F.珠心在CRC和P-BCD中检测DNA。检出率F.核仁CRC组高于P-BCD组。在10例(66.7%)CRC患者中,异常组织和癌旁正常组织均为阳性。F.核仁。在3起儿童权利委员会案件中(20%),F.珠心仅在异常组织中检出。2例(13.3%)异常及邻近正常组织均阴性。P-BCD 3例(11.5%),F.核仁仅在邻近正常组织中检出。在CRC患者中(如图所示)。1(A)的数额F.核仁异常组织中DNA含量显著高于邻近正常组织(p=0.0166)。但P-BCD患者无显着性差异(P=0.2349)。1(B)异常组织与邻近正常组织之间。

表2F.核仁定量聚合酶链反应在组织中的检出率。
图1

原木丰度F.核仁组织DNA(15例大肠癌和26例P-BCD患者)。(A)CRC患者(B)P-BCD患者。

抗体水平分析F.核仁ELISA法

如图所示。2对78份血清标本(22份CRC、35份P-BCD和21份HC)进行了分析。F.核仁IGA和IgG ELISA检测。对每种样品进行ELISA一式三份。记录平均光密度(OD)值。酶联免疫吸附试验的CV值低于20%。

图2

的OD值比较F.核仁CRC组(n=22)、P-BRC组(n=35)和HC组(n=21)血清中的IGA和IgG ELISA。符号表示个体OD值,水平线表示平均值±SD。(A) F.核仁伊加。(B) F.核仁IgG

的OD值F.核仁CRC组IGA和IgG明显高于HC组。无显著差异F.核仁P-BCD组与HC组IGA和IgG OD值比较。远端CRC组OD值低于近端CRC组。在IgG方面,差异无统计学意义(近端0.175±0.133 vs远端0.109±0.127,p=0.3420)。在IgA病例中,差异较大,但仍无显着性差异(近端0.809±0.497 vs远端0.598±0.350,p=0.2622)。

诊断准确度F.核仁大肠癌IGA和IgG ELISA检测

诊断精度的整体测量F.核仁用图中ROC曲线的AUC计算IGA和IgG ELISA试验。3。IgA和IgGELISA检测的AUC分别为0.6185和0.6481。在roc曲线和youden指数分析中发现,在灵敏度和特异性之间提供最佳折衷值的最佳截断值分别为0.246和0.047(表的第1、第1和第3行)。3)。然而,该截断值与低特异性和低正似然比相对应.对于IgA和IgG分别为0.868和0.133时,计算出相对较高的似然比(表的第2行、第2排和第4行)。3).

图3

Roc曲线F.核仁大肠癌患者和健康对照者血清IGA和IgG ELISA检测。参考试验是结肠镜检查和活检材料的病理评估。IGAAUC=0.6185,IgGAUC=0.6481。

表3的诊断准确性F.核仁大肠癌IGA和IgG ELISA检测

血清IgA、IgG抗体水平与血清IgA、IgG抗体水平的关系F.核仁组织内DNA

探讨血清IgA、IgG抗体水平与血清IgA、IgG抗体水平的关系F.核仁组织内DNA(13例CRC和26例P-BCD)可检测到F.核仁根据中位切点数量,dna被划分为低(<50百分位数)和高(≥50百分位数)。F.核仁DNA,而没有检测到的病例F.核仁被归类为阴性。高百分位组的IgA ELISA阳性率(0.246)明显高于阴性组(P=0.0474)。4)。IgA、IgG在低百分位组与阴性组间无显着性差异(P>0.05)。虽然数量很大F.珠心3例P-BCD组织中检出DNA,1例为阴性(切断:0.246),2例为阴性(切断,0.047)。

表4F.核仁结肠组织和血清抗体试验阳性率。

讨论

儿童权利委员会是一个严重的公共卫生问题。1诊断主要依靠侵入性检查,如结肠镜检查。可靠的无创检测生物标记物可能有助于诊断。在这项研究中,抗体的使用F.核仁对CRC的诊断进行评价。根据ROC曲线和Youden指数分析,诊断准确性较差。AUC是诊断准确性的全球性指标,尤登指数在相同负荷下具有敏感性和特异性。从临床的角度来看,LR可能具有强大的特性,并且与测试后的概率有关。根据所选择的截断值,用IgA ELISA法对CRC患者的疾病发生概率的近似变化可达38.5%(截断:0.868;LR+:6.6)。

梭杆菌在CRC发病机制中起作用6,7。然而,F.核仁诊断CRC的抗体很少被研究。8,9。在一项多中心研究中,没有发现crc与F. 核仁485例大肠癌患者及485例对照者诊断前血清抗体8。阳性F.nucleatum健康对照组的抗体检测结果可能与其他感染部位(如口腔)引起的抗体反应有关。10. F.核仁作为肠道微生物区系的一部分,免疫系统可以产生抗体来防止宿主入侵。F.核仁用结肠。与CRC相关的IgA含量大于IgG。IgA较IgG敏感,特异性较强。IGA在粘膜免疫功能中起重要作用。在之前的一项研究中,F.核仁Icc的iga和ggg ELISA检测分别为0.704和0.645,为准确诊断,推荐联合应用糖类抗原19-9和癌胚抗原试验。9.

在过去的几年里,人们已经发现crc组织普遍被感染。与核仁F.但研究之间的差异很大,介于13%至87.1%之间。在我们的研究中,F.核仁冷冻CRC组织检出率为86.7%。同样,Li等人。发现F.核仁在87.1%的冷冻CRC组织中11。美国的一份报告显示F.核仁在福尔马林固定石蜡包埋(Ffpe)组织中占13%。12。在日本,对20例大肠癌病例进行了分析,并对其检出率进行了分析。F.核仁在FFPE CRC组织中占45%10。目前和以前的研究结果不同的原因之一可能与用于检测的组织制剂有关。F.核仁。固定过程通过诱导共价丹交联和断裂来改变样品中的核酸。这些改变可能会降低PCR和DNA测序方法的分析效果。变化率F.核仁在CRC中,来自世界不同地区的组织也可能是由于研究人群的特点、人口、环境或遗传因素造成的。量化F.核仁在CRC患者的粪便中是最近的研究所关注的问题。13,14. F.核仁与转移有关11与大肠癌的预后12. F.核仁是一种新的标记物,无论是单独量化还是与其他细菌结合。所有这些研究的目的都是为了找到一种非侵入性诊断大肠肿瘤或成功的治疗方案。然而,癌症的病因是多因素的,将人类细胞转化为癌细胞并不是一帆风顺的。

本研究存在一些局限性。随着冰冻组织标本的使用和保存,可能会影响定量PCR检测微生物的方法。此外致核仁,肠道微生物区系的另一个成员可能被包括在这项研究中。总的来说,研究数据反映了地理属性的特点。为了详细解释研究结果,必须对更多的人群进行进一步的研究。尽管在研究的计划阶段进行样本大小计算可以确定结果可能具有指导意义,但使用过多的样本可能被认为是不道德的。为了估计适当的样本大小,进行正式的权力分析是非常必要的。在本研究中,酶联免疫吸附试验(ELISA)被认为是检测F.核仁在病人的血清中。ELISA具有成本低、易于实现和自动化的特点。ELISA试验的局限性可能与首选抗原有关。最后,我们没有关于结肠息肉的病理资料,以进一步研究其是否与P-BCD患者的IgA和IgG水平有关。

尽管F.核仁IGA酶联免疫吸附试验(IGA ELISA)检测效果差,一些指标主要取决于疾病的流行程度,而且对人群中的疾病谱都很敏感。对于一种特殊的阻断,CRC检测IgA ELISA阳性的概率显著增加.

方法

病人和样本

患者在2018年5月至2019年8月期间从一所大学医院的胃肠病学和普通外科随机抽取。所有受试者均为成年人,并获得所有受试者的知情同意。所有实验方案均由土耳其科贾埃利医学院临床研究伦理委员会批准(29.03.2018-2018/134)。所有方法都是根据“赫尔辛基宣言”执行的。接受门诊结肠镜检查结直肠癌筛查的患者包括结直肠癌(CRC)或癌前良性结肠疾病(P-BCD),如良性息肉、克罗恩病和溃疡性结肠炎。接受癌症治疗或接受癌症治疗手术的患者被排除在外。结肠镜检查未发现CRC或P-BCD征象的患者作为健康对照组(HC)。

在结肠镜检查前获得血清,在结肠镜检查时取组织标本(活检)。血清和组织标本均立即保存在−80°C,直至分析为止。

核酸提取与实时PCR(RT-PCR)

根据Moen等人所述的程序。15,用DNA迷你试剂盒提取活组织切片(Chiagen,Hilden,德国)。为了测定提取的DNA的浓度和纯度,采用了NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Fisher Science,Waltham,MA,USA)。根据生产厂家的指示,采用微生物dna qPCR试剂盒(基因全球ID:BBID00161A,目录编号:330033,齐根)。PCR反应用针对16S rRNA基因的引物进行。F.核仁(基因库ACC.FJ 471654.1)。在Corbett旋翼基因q仪上,在95℃下扩增反应混合物10 min。C和2分钟(60分钟)C.利用转子基因进行扩增、检测和数据分析.

细菌培养

核梭杆菌ATCC 25586菌株是从美国微生物公司购买的。F.核仁在哥伦比亚琼脂中培养48h,用5%的船血板培养(法国BioMerieux),在37°C进行厌氧培养。

ELISA法

我们准备了自制的手工ELISA测试,并按照其他地方描述的程序进行了测试。9。用间接全细胞ELISA法检测血清特异性抗体F.核仁测定IGA和IgG水平。简单地说,100微升加热灭活。F.核仁终浓度为1×1080.05M钠中CFU/ml2协和3-NaHCO3酶联免疫吸附试验(ELISA)中加入缓冲液,在4°C下隔夜孵育,室温下用200 ml 1%1%脱脂奶粉在PBST中孵育2h。对于IgA ELISA试验,血清样品稀释1:1000,37°C孵育1h,3次洗涤后加入100 L抗人IgA结合物(德国Euroimmun),在37℃下孵育30 min,样品稀释1:4000,37°C稀释1h,洗3次后加入100 l抗人IgG(德国Euroimmun),最后在37℃孵育30 min。加入底物(四甲基联苯胺),孵育15 min后,用2M H终止反应。2所以4。所有反应在OD值为450 nm(参考波长620~650 nm)时,用ELISA分光光度计(西班牙Triturus)进行读取。


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