早期感染诱导的自然抗体应答

到目前为止，对于B细胞及其产品--抗体和细胞因子--在介导保护反应方面的作用，至今仍有很大的差距。[医]塔拉氏白僵菌，一株革兰氏阴性球虫，属于兼性胞内菌群。我们以前已经证明弗朗西塞拉直接与腹膜B-1a细胞相互作用。在这里，我们证明，早在感染后12小时，无菌小鼠就感染了。[医]塔拉氏白僵菌产生感染诱导的抗体克隆[医]塔拉氏白僵菌真核细胞中具有同源或类似物的蛋白质。个别无性系的产生时间有限，且受毒力的影响。弗朗西塞拉使用的菌株。系统进化稳定的防御机制可以利用这些早期感染诱导的抗体来识别入侵病原体的成分，并消除感染损伤的自身细胞的分子残基。

[医]塔拉氏白僵菌是一种革兰氏阴性球虫杆菌，属于胞内兼性致病菌群，在吞噬细胞中增殖，包括中性粒细胞。几个亚种Tularensis在动物和人类身上都会引起严重的湿疹感染。我们继续寻求一种安全而有效的疫苗，以防止高毒力的呼吸道感染。TularensisSubsp.图拉1。我们还没有合适的疫苗的原因之一是我们对人体防御机制对这种危险病原体的认识存在相当大的差距。

促进保护性免疫反应表达的免疫机制Tularensis仍然是一个争论的问题。关于单个细胞类型和亚型在产生保护性免疫反应中的作用的理论和观点与用来揭示其功能的感染模型一样多种多样。最初，T细胞介导的巨噬细胞活化的免疫过程被认为是宿主抵御斑疹的决定性因素。2,3,4,5。虽然我们已经深入研究了巨噬细胞作为主要宿主弗朗西塞拉复制6,7,8,9,10，对它们在保护中的作用的评估至今仍取决于所采取的实验方法和其毒性。弗朗西塞拉使用菌株11,12。多形核白细胞对全身感染的限制和(或)传播的作用也同样模棱两可。13,14,15。目前流行的观点是，中性粒细胞通过参与随后的组织破坏而产生有害影响。Tularensis感染，从而导致致病过程16。树突状细胞与树突状细胞的初次相互作用Tularensis，与其他吞噬细胞一样，它从吞噬体中逃脱并在树突状细胞胞浆内增殖，最后产生细胞因子，这些细胞没有受到充分的刺激，因此影响保护性免疫反应的能力有限。17,18。然而，与巨噬细胞的情况一样，树突状细胞的信号通路受强毒株和弱毒株的不同调节。弗朗西塞拉19.

自20世纪70年代以来，细胞免疫被认为是保护性反应的一种免疫特异性成分。20,21,22,23。从逻辑上讲，T淋巴细胞已经成为人们关注的目标。24,25,26。α/βCD4+和CD8+淋巴细胞在原发性亚致死性感染中同样有效。Tularensis减毒活疫苗株(LVS)对继发性致死性挑战的保护作用27。此外，γ/δT细胞28,29,30和其他罕见的T细胞群体，例如CD4−CD8−CD3+阿尔法/贝塔+伽马/三角洲−NK1.1−T细胞31可参与细胞内细菌增殖的控制。

到目前为止，我们对B细胞在介导保护反应方面的作用的认识仍有很大差距。Tularensis感染。在适应性免疫系统的体液分支中，B淋巴细胞的基本功能是产生一系列特异性抗体。然而，根据普遍的观点，特异性抗体并不是保护性免疫的决定性组成部分。小鼠淋巴细胞对疫苗株反应的早期研究TularensisT细胞和B细胞群体的反应32。渐渐地，研究表明，在感染后第三天就能检测到的强早期保护，高度依赖于B细胞。33。细菌生长受限于干扰素-γ，可能与抗体无关。随后，B细胞在控制第二免疫应答中的调节作用TularensisLVS感染与抗体产生无关。B细胞在控制经典原发反应中的作用Tularensis边缘34。什么时候F.novicida用而不是Tularensis然而，原发性和继发性小鼠感染严重依赖于B细胞。35。在体外和体内实验证明，小鼠和人B细胞株，以及小鼠腹膜B细胞亚群，是Tularensis入侵36。观察到B1a细胞的内化过程仅依赖于功能表面的B细胞受体。相比之下，在B-1b和B-2细胞中，这些受体需要来自共受体cr1/2的共同信号才能启动。Tularensis吞没37。被感染的B细胞被激活并产生多种细胞因子，包括干扰素-γ、白细胞介素-12和肿瘤坏死因子-α。38.

早期解决体液免疫在保护人体免疫中的争议作用的尝试Tularensis感染利用从活疫苗接受者收集到的免疫血清被动转移给天真的小鼠。混合免疫血清被证明可以充分保护小鼠免受lvs毒株的致命挑战。39。特异性抗体对保护人体免疫功能的贡献Tularensis然后在几个感染模型中反复演示感染。40,41,42,43,44,45。上述研究中使用的免疫血清是在感染的急性或恢复期从感染者身上分离出来的。在我们研究相互作用的过程中TularensisB细胞36,37,45,46，我们无意中发现抗体克隆与Tularensisα链、延伸因子Tu、普遍应激蛋白、ABC转运蛋白、推测的外膜蛋白、过氧化物酶/过氧化氢酶和伴蛋白DnaK在感染后12h从无特异性致病菌Balb/c小鼠血清中分离。这些特异性未在纯正SPF小鼠的对照血清中检测到。为了确定这些克隆是否是SPF小鼠血清中的交叉反应抗体，或者是否存在由感染引起的天然抗体，我们使用无菌(GF)小鼠进行了进一步的研究。与SPF小鼠不同，无菌小鼠不受体内或外部细菌的攻击，因此感染诱导的抗体克隆交叉反应的可能性是有限的。47,48.

在这里，我们证明GF小鼠感染了Tularensis产生与87反应的天然抗体克隆Tularensis蛋白质，其中63种抗体特异性针对真核细胞中具有同源或类似物的蛋白质。个别无性系的产生时间有限，且受毒力的影响。弗朗西塞拉使用的菌株。这种早期感染诱导抗体的产生可能是一种系统遗传学稳定的防御机制，既能识别入侵病原体的成分，又能消除感染损伤的自身细胞的分子残基。

Tularensis引起早期健壮的血清总抗体应答

免疫吸附法检测SPF小鼠早期抗体产生的初步研究Tularensis感染有两种解释。这要么反映了交叉反应之前存在的抗体克隆的反应，要么反映了先天B细胞亚群的快速自然反应。因此，我们使用GF小鼠进行进一步的实验，并将其抗体反应与SPF小鼠的反应进行比较。GF动物与细菌没有预先存在的接触，而SPF小鼠有一种自然的、预先存在的微生物群，包括许多非-弗朗西塞拉物种。研究SPF和GF Balb/c小鼠对感染早期抗体反应的动力学。TularensisSubsp.全光FSC 200为了确保产生抗体的细胞与细菌直接相互作用，我们采用腹腔感染，在没有抗原提呈细胞预先处理免疫原的情况下，个别B细胞亚型的直接相互作用是可能的。此外，腹膜腔为B细胞的研究提供了一个合适的模型，因为除了B1B细胞和传统的B2细胞外，还存在一个独特的腹膜腔内B细胞亚群B1A细胞。定殖12、24、48h后，检测各组小鼠血清总抗体水平。1)。从无细菌定植的纯种小鼠血清中获得的Balb/c、SPF和GF小鼠血清的抗体亚型组成非常低，因此本图未显示。GF小鼠基础个体抗体亚型水平明显低于SPF小鼠。正常未感染GF小鼠循环IgG 1和IgG 2b水平低于未感染SPF小鼠(附图)。沙一)。然而，在分析的SPF血清中，较高水平的轻卡蛋白和λ链可能与正常和感染小鼠SPF血清中较高的抗体含量有关(补充图)。S2).

GF及SPF小鼠感染Tularensis证实感染可引起小鼠感染后12h的早期抗体应答(图二)。1)。感染Tularensis除IGD和IgE外，GF血清和SPF小鼠血清中的所有抗体亚型均显著升高。SPF小鼠血清IgG 1和IgG2b亚型以IgG 1和IgG2b亚型为主，GF小鼠以IgM、IgA和IgG 3亚型为主。感染48h后个体抗体同工型的动态变化表明，感染引起的体液应激反应主要是由早期诱导的天然抗体产生的。

早期抗IgM反应仅在GF小鼠感染后发生TularensisSubsp.全光FSC 200在所有被监控的时间点。IgM抗体是天然抗体的主要组成部分，也是感染早期抗体应答过程中产生的第一类抗体。我们的结果表明，这仅与GF小鼠的反应相对应，因为SPF小鼠早期感染诱导抗体的优势亚型为IgG2b亚型。从全球范围来看，GF和SPF小鼠的血清IgM和IgG抗体以前几乎没有检测到。弗朗西塞拉感染。然而，GF小鼠对感染的早期体液反应比感染后12h的SPF小鼠更强烈。2).

感染后12h及其他时间间隔，GF小鼠感染诱导的IgM抗体亚型水平较感染SPF小鼠血清中IgM亚型水平增高，可能是由于不同的IgM抗体克隆(特异性)有不同的反应谱所致。弗朗西塞拉蛋白质(附图)S3).

早期产生抗体的分子靶点

[医]塔拉氏白僵菌潜艇。全光采用pH3-10的广谱IPG条对FSC 200全细胞裂解液进行双向电泳分离。为验证分离技术的重复性，制备了两种独立的全细胞裂解液。制备了参比银染凝胶。在聚偏二氟乙烯膜上进行电泳。用SPF和GF小鼠血清进行免疫印迹。在选定的时间点制备SPF和GF血清的生物三倍体，并对每种血清进行两次免疫印迹实验。以Balb/c小鼠不暴露于任何环境中的血液制备正常小鼠SPF和GF血清。Tularensis应变。然后制备Coomassie染色的2-DE凝胶，去除被消化的斑点，并测定其对细菌提取物的反应活性。质谱法成功地评估了总共87种不同的方法Tularensis在感染后12，24，48小时与小鼠血清发生反应的蛋白质。3)。相似性分析表明，这些蛋白是根据所用的模型(GF与SPF)和感染后获得血清的时间间隔进行反应的。主要免疫反应蛋白斑点TularensisFSC 200在至少三个免疫印迹上被显示在参考的2-D蛋白图上。4)和蛋白质摘要载于补充表沙一。共50种免疫反应弗朗西塞拉蛋白是GF小鼠血清独特的靶点，在天然免疫应答间隔期内，蛋白与SPF血清不存在相互作用。Tularensis感染(见图1)。3和补充标签。沙一).

本研究中发现的许多免疫反应蛋白已经使用不同的感染模型进行了描述，包括适应性免疫应答阶段的人类Tularetis(见补充表参考文献)。沙一)。进行了一些研究，以确定和描述Tularensis用于感染多种宿主，诱发疾病，逃避免疫防御机制。其中一些被列为免疫反应蛋白。在感染后早期(即12、24和48h)，从GF和SPF小鼠血清中分离出的血清也与已鉴定的几种毒力因子发生反应。在这方面，弗朗西塞拉细菌腹腔接种后12h获得的GF小鼠血清主要观察到毒力因子。

在本研究中，19Tularensis早期感染诱导的抗体克隆所识别的蛋白质已经被公认为具有特定功能和重要性的潜在毒力因子。但是，如果Tularensis在节肢动物、淡水阿米巴和哺乳动物中存活，因为它们有细胞内和细胞外的阶段，因此可以合理地期望(毒力)因子的表达发生变化。弗朗西塞拉在这些不同的环境中生存。基于这些原因，命名为弗朗西塞拉毒力因子是值得商榷的。49,50,51,52,53.

即：果糖-1，6-双磷酸酶(FTS_1656)、伴侣ClpB(FTS_0084)、细胞内生长位点A蛋白(FTS_0097/1125)、细胞内生长位点C蛋白(FTS_0099/1127)、超氧化物歧化酶(FTS_1747)、过氧化物酶/过氧化氢酶(FTS_1471)、噬菌体Qβ宿主因子I(FTS_0889)、热休克蛋白GRPE(FTS_1166)、伴侣蛋白DnaK(FTS_1167)、超氧化物歧化酶(FTS_1671)、OmpA家族蛋白(S_1295)、碳酸氢盐(FTS_0527)。琥珀酰-辅酶A合成酶亚基β(FTS_1517)、琥珀酰-辅酶A合成酶亚基α(FTS_1518)、DNA导向RNA聚合酶亚基α(FTS_0258)、转录延伸因子grea(FTS_1440)、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(FTS_1476)、30核糖体蛋白S1(FTS_1862)、细菌铁蛋白(FTS_0617)和触发因子(FTS_0882)。此外，OmpA家族蛋白(FTS_1295)和甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(FTS_1476)被注释为外膜相关蛋白，可能在宿主与病原体的相互作用中发挥重要的免疫作用。

早期弗朗西塞拉-诱导抗体还与SodB(FTS_1747)、KatG(FTS_1471)、DnaK(FTS_1167)和GRAES(FTS_1671)反应，这些蛋白质已经被报道释放或分泌。Tularensis但其分泌机制尚不清楚。此外，我们还根据SignalP5.0软件鉴定了6种带有信号肽的免疫反应蛋白，即KatG(FTS_1471)、OmpA(FTS_1295)、GTP依赖的核酸结合蛋白EngD(FTS_0935)、功能未知的OMP蛋白(FTS_0008)、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(FTS_1476)和假想蛋白(FTS_0815)。所有这些蛋白质都被列在补充表中，并附有它们的特性。沙一.

所有已鉴定的蛋白质与弗朗西塞拉将感染的GF和SPF小鼠分为组群(COG)功能类别(图1)。5)。两个显性齿轮与蛋白质翻译后修饰和伴随蛋白转位阶段的生物发生有关。鉴定出的87个抗体克隆中有63个与真核细胞中含有同源物或类似物的细菌蛋白发生反应。其余24个原核目标为Tularensis，其中7种是假想蛋白。根据UniProtKB数据库确定了这些蛋白质的同源性。在真核细胞类似物或同源物中，线粒体和胞浆蛋白是早期的主要靶点。弗朗西塞拉-诱导抗体(图1.6)。补充表描述了在选定时间点获得的SPF和GF小鼠血清的反应性。沙一。在50种独特的GF抗体特异性中，GF小鼠血清中含有12种无真核细胞同源物的血清(表)。S2)。这些抗体的特异性具有蛋白质靶点，根据同源类群分类，它们一方面参与氨基酸的代谢和运输，另一方面参与蛋白质的胞内转运和分泌，参与膜生物发生，另一方面参与细胞周期的控制和复制及修复(见图1)。6).

弗朗西塞拉-诱导早期非特异性抗体应答

感染Balb/c小鼠血清Tularensis潜艇。全光FSC 200在感染后12小时内与不同类型的人发生反应TularensisSubsp.全光FSC 200和Tularensis用于免疫印迹的全细胞裂解物形式的LVS蛋白。反应强度与用于感染的菌株的毒力相对应。小鼠早期体液反应Tularensis潜艇。全光与LVS相比，FSC 200在血清抗体数量和识别靶标谱方面都更为强烈。感染GF和SPF小鼠血清免疫印迹Tularensis抗衡Tularensis作为靶标的全细胞裂解蛋白克雷伯菌肺炎(临床分离物)和铜绿假单胞菌CCM 3955这两种细菌都是有条件致病性的，并能附带地在呼吸道中定居。早期反应弗朗西塞拉-诱导的抗体对这些目标的反应比对这些目标的反应弱。Tularensis全细胞裂解，但仍然非常重要(补充图)。S4)。两种替代微生物蛋白质靶标与血清的反应Tularensis感染的GF小鼠比SPF小鼠的血清反应更强烈。GF对照血清未能与肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌蛋白质。从SPF小鼠获得的对照血清与这两种细菌的蛋白质反应不大。的血清靶蛋白弗朗西塞拉-被感染的老鼠没有被识别，因为我们没有搜索它们。

如果GF和SPF的血清弗朗西塞拉-感染小鼠与无关细菌的蛋白质发生反应，我们还用Balb/c腹膜细胞的全细胞裂解液检测了这些血清的反应。在这种情况下，我们也证明了从GF和SPF小鼠获得的早期感染诱导抗体克隆与腹膜细胞全细胞裂解蛋白靶点的相互作用。GF和SPF小鼠的反应在强度上似乎是相似的，但它们在蛋白靶点上的反应却不同(补充图)。S5).

对自然感染的免疫反应Tularensis以及对实验动物免疫或人类减毒株免疫的反应，都能诱导出较强的细胞免疫。最初，延迟型皮肤试验或体外淋巴细胞刺激试验显示，在自然感染或疫苗接种后的第一周末，细胞介导的免疫反应的表达。20,54。同样，利用全血培养dna合成反应和IL-2和IFN-γ分泌在第二周被证实为人类志愿者接种活疫苗株后Th1型T细胞介导的免疫表达所需的时间间隔。55。同时，我们发现人类病人在感染后第二周内会有大量的抗体反应。54。对实验抗性寄主遗传背景的研究弗朗西塞拉感染56,57,58中性粒细胞、NK细胞或B细胞参与原发性Tularetis感染的耐药性13,33,59,60引起了人们对早期先天免疫的关注。这种与生俱来的(自然的、遗传的或固有的)免疫(或抵抗力)被定义为“在没有任何获得性(反应性)免疫的情况下，有机体抵抗生态或生理因素的作用的能力”。61。换句话说，天然免疫反应的发生是因为细胞能够对入侵的微生物作出快速反应，而不需要抗原特异性的适应。背景下的先天免疫反应弗朗西塞拉模型运行到感染后第五天。6。在此期间，小鼠在感染疫苗株后的第二天至第三天，可以显示出非特异性的早期保护性免疫。Tularensis33,62人体志愿者在接种后24小时激活γδT细胞和NK细胞，对LVS免疫应答。63。转录组分析显示在疫苗接种后的早期，即≤48h诱导了促炎和天然免疫相关基因。64.

虽然我们一直在调查Tularensis几十年来，我们对自然体液机制作用的认识仍然相对不成熟。我们已相当偶然地鉴定了几个抗体克隆，这些克隆是在感染后12小时从免疫LVS的SPF小鼠血清中分离到的。Tularensis对照组小鼠血清中蛋白缺失。这种早期抗体反应可能是由于以前与微生物相互作用而引起的记忆B细胞的反应，也可能是诱导T细胞独立的早期自然抗体产生。TularensisFSC 200株感染。我们决定用GF小鼠来解决这个难题，这些小鼠在个体发育过程中不应该与细菌发生任何相互作用，甚至不应该与构成SPF小鼠肠道微生物群的细菌发生任何作用。

根据先前的研究，GF小鼠对小红细胞抗原的反应产生抗体，例如从绵羊红细胞中产生抗体。65,66或仓鼠红细胞67，与传统小鼠的实验结果相当。同样，常规和GF小鼠对亲水性多糖二硝基苯赖氨酸Ficoll或二硝基苯化牛血清白蛋白的反应也只有有限的差异。66。在所有这些早期的研究中，体液免疫反应或能力在与诱导获得性免疫反应相对应的时间内被监控。与诱导天然免疫反应相对应的早期抗体的产生并不是焦点，尽管天然抗体已经被证明在防御系统的行动和内环境平衡中起着重要的调节作用--除了对感染的即时保护之外。68.

我们的研究揭示了GF和SPF小鼠对细胞内细菌的早期体液天然免疫反应。Tularensis至少从腹腔接种细菌后12小时开始。大多数抗体克隆与真核细胞中含有同源物或类似物的细菌蛋白发生反应。主要靶点为胞浆蛋白和线粒体蛋白。部分克隆还与真核细胞裂解物SDS PAGE分离的真核蛋白直接反应。考虑到自然抗体(自身抗体)已经被证明能够识别外来抗原和自身抗原之间的进化固定表位。69，我们的研究结果符合普遍接受的目标轮廓的天然抗体。GF小鼠血清中的亚型组成及其相对比例也符合天然抗体的一般特征。抗体产生的动力学表现为体液先天反应的暂时性，至少是指一些抗体克隆(而不是B细胞克隆)在接下来的12小时内消失，表明不同类型的B细胞和浆细胞可能参与了早期的自然体液免疫应答。然而，部分克隆仍然存在，即使在获得性免疫应答阶段，也可以识别出这些特异性。先天免疫期和获得性免疫期检测到的抗体特异性可能是B细胞反应调节、B细胞库的选择和/或B细胞发育的调节所致，所有这些都是由早期产生的天然抗体调节的过程。70。一种记忆B细胞通过感染从先天B细胞池中产生的健忘反应可以确保特定的和长期的后天体液反应。

通过对GF和SPF小鼠抗体反应强度的比较，可以得出结论：以前与细菌的相互作用对SPF小鼠的免疫系统有指导作用，而GF小鼠纯天然免疫系统的均匀体液反应更为有限，特别是在IgM同工型水平上。此外，文献资料表明外源性抗原刺激改变了分泌IgM同型抗体的细胞与分泌IgG和IgA抗体亚型的细胞的相对比例。这意味着外源性抗原刺激对背景IgM-IgG-和IgA分泌细胞有很大的影响，也很可能改变了产生抗体的抗原特异性。71.

已经证明，抗体--包括天然抗体--可以通过多种机制影响免疫过程，其中包括微生物的光化、补体激活、循环抗原-抗体复合物的形成及其在淋巴器官中的捕获、抗体依赖细胞介导的杀菌活性、通过FC受体传递信号以及调节炎症反应。此外，天然抗体可防止病原体向靶器官传播，并通过增强抗原捕获在次级淋巴器官中影响免疫原性。72,73。上述天然抗体的所有活性均能调节获得性免疫应答的诱导或调节。73.

在早期诱导的天然抗体克隆中，有与ClpB、SodB、KatG、Hfq、Igla、IglB和IglC蛋白反应的克隆。弗朗西塞拉影响细胞存活和应激反应的毒力因子74。除了分泌的KatG和SodB蛋白外，还发现了与其他分泌蛋白DnaK和GRAE反应的抗体克隆。值得注意的是，与这些毒力因子反应的抗体克隆，除SodB外，仅在感染后12h才被发现，这些克隆既包括独特的细菌蛋白，也包括具有真核细胞同源物或类似物的蛋白质。所有这些抗体的特异性可能潜在地调节相互作用的早期阶段。弗朗西塞拉还有宿主细胞。在这方面，我们要提到KL Elkins等人。已在多项研究中揭示了早期T细胞独立和B细胞依赖的特异性或最终非特异性保护反应，这种反应可在小鼠初次亚致死感染后的第二天至第三天期间得到证实。33,62,75,76。由于根据1990年代后期流行的概念，抗体是在接种疫苗或感染后的第五天或第七天产生的，对弗朗西塞拉和/或李斯特菌并不是因为抗体的参与。然而，根据这里的结果，感染诱导的自然抗体克隆的早期产生与Tularensis蛋白质可能是控制体内细菌存在的早期细胞反应的关键伙伴。寻找抗体参与诱导这种早期抗感染耐药性的直接证据应该是进一步实验的问题。

我们的结论是GF和SF小鼠对TularensisFSC 200株腹腔感染早期可检测到IgM、IgG 3和IgA抗体产生，可在感染后12h内检测到。一些抗体特异性的产生具有暂时性。由一组细菌蛋白组成的87种抗体特异性谱，其中63种在真核细胞蛋白中有同源物或类似物，以及它们的产生动力学，从而得出结论，这是一种天然抗体的产生，可能是由B-1a细胞引起的。Tularensis腹腔感染。小鼠腹膜细胞亚型感染的初步检测证实B-1a细胞是小鼠腹腔感染的主要靶点。弗朗西塞拉入侵(数据未显示)。已经证明，体腔B-1细胞被感染激活，可以被认为是应答细胞--不同于淋巴组织B-1细胞70,77,78。然而，我们的结果与流感感染模型中的结果不一致，即在鼻内感染后早期没有检测到血清中的特异性IgM抗体。77,78。造成这一差异的原因可以从不同的细胞类型，包括B细胞亚型中可以看出，与腹膜中的第一反应者相比，B细胞亚型在鼻粘膜和肺中遇到感染的第一反应者。病原体类型(即病毒与细菌)的差异也可发挥重要作用。

这么早产生抗体引起了几个问题。首先，这种抗体产生的来源在哪里？它是直接在腹膜还是在B细胞转移到淋巴器官后发生的？此外，哪些B细胞亚群真正产生了这些抗体，哪些受体和信号通路参与了这一现象？由此产生的抗体的主要目标是什么？它们主要是自身抗体还是由于真核生物和原核生物之间的系统发育关系以及系统发育记忆，它们已经成为入侵微生物的靶点？最后，这些早期产生的抗体是如何参与弗朗西塞拉-宿主细胞之间的相互作用以及它们在多大程度上可以影响保护性免疫反应的诱导？B-1a细胞和B-1a细胞早期产生的抗体的阳性效应已经被报道。79,80,81.

系统进化稳定的防御机制可以利用这些早期感染诱导的抗体来识别入侵病原体的成分，并消除病原体损伤的自身细胞。因此，这些早期的防御步骤可以被描述为病原体的吞噬作用(或中和)的助推器，这是诱导已经针对该病原体的获得性免疫机制的关键事件之一。82(表)1)。尽管如此，我们对于先天免疫系统和后天免疫系统早期体液分支和细胞分支在表达保护性反应方面的合作仍有很大差距。Tularensis可以引导我们设计一种有效和安全的疫苗的感染。

细菌

[医]塔拉氏白僵菌Subsp.全光菌株FSC 200(TularensisFSC 200)由艾克·福斯贝格(瑞典国防研究局，瑞典乌梅)提供。克雷伯菌肺炎是临床分离物，而且铜绿假单胞菌CCM 3955来自捷克微生物收集(捷克共和国布尔诺Masaryk大学)。股票Tularensis在37°C条件下，在添加牛血红蛋白和异维他乐(Becton Dickinson，美国新泽西州)的McLeod琼脂上预培养24h。83按照制造商的指示配制，用盐酸调节pH值至6.8(除非另有说明)，培养基是无菌过滤的，而不是蒸压的。培养后，细菌菌落从平板上被提出来，再悬浮在盐水中，达到1.00(对应于细菌5×10)。9(cfu/ml)。用串联稀释法测定悬浮液中细菌的实际数量，计算菌落形成单位(CFU)的数量。克雷伯菌肺炎和铜绿假单胞菌用血琼脂平板培养CCM 3955。

动物

雌性BALB/c-SPF小鼠(SPF)是从Velaz(捷克共和国乌奈茨)购买的。雌性无菌BALB/c小鼠(以下简称GF小鼠)由捷克科学院微生物学研究所(捷克共和国诺维赫拉德克，诺图生物学系)提供。GF小鼠在无菌条件下被安置在Trexler型塑料隔离器中，可免费获得蒸压自来水和50 kGy辐照的无菌颗粒饲料Altromin 1414(Altromin，Lage，德国)。在实验前，将GF小鼠转移到无菌的单独通气笼中(IVC，Tecnispace，意大利)。SPF小鼠在无病原体条件下饲养，GF小鼠在无菌条件下被安置在微型隔离笼中。将小鼠置于空调无菌箱中，温度稳定在22±2°C，光照方式为12h，黑暗时间为12h。45。所有小鼠实验均在该机构动物股的监督下进行，并经国防大学军事卫生科学学院动物护理和使用委员会批准，项目编号35/17，捷克共和国克拉洛夫.所有实验都是按照“到达准则和规定”(Http://www.nc3rs.org.uk/page.asp?id=1357).

细菌全细胞裂解液的制备

细菌细胞悬液Tularensis, 克雷伯菌肺炎, 铜绿假单胞菌)在16,000 psi时两次被法国新闻界破坏，细胞碎片以12,600×离心机清除。g上清液中加入2 5 0U/μL，Sigma，St.Louis，MO，4°C作用30 min，最终浓度为0.5U/ml。

真核生物全细胞裂解液的制备

腹腔灌洗时，小鼠在完全麻醉下麻醉，用乙醇垫彻底清洁腹部皮肤。对于每只老鼠，使用一个无菌的镊子来捏和提升腹部皮肤的中部约2厘米，以创造一个口袋的腹膜空洞的内部器官。用10毫升磷酸盐缓冲溶液(PBS)填充针头，将针垂直插入腹腔内的口袋中，同时注意避免损伤内脏。腹腔注射PBS液。根据腹腔脂肪含量和灌洗技术，洗液回收率在80%~90%之间。回收的悬浮液在400×g浓缩任何细胞成分5分钟。然后用RIPA缓冲液(美国热费雪科学公司)对腹腔灌洗细胞进行裂解，以获得提取的蛋白质。提取按生产过程进行。然后用三氯乙酸/脱氧胆酸钠(TCA-DOC)与丙酮洗涤沉淀蛋白悬浮液。蛋白悬液与0.15%脱氧胆酸钠(DOC)体积的1/10混合，在冰上孵育15 min。然后将样品与72%三氯乙酸(TCA)原体积的1/10混合，再在冰上孵育15 min。随后，在12,000×g，4°C作用15 min。丢弃上清液，加入1 ml丙酮冷冻至−20℃。TCA-DOC沉淀各步骤重复两次.球团经空气干燥5 min后，再用2-D样品缓冲液在最小体积内悬浮，然后进行2-D凝胶分析。

小鼠感染与小鼠血清采集

SPF和GF小鼠腹腔注射TularensisFSC 200剂量102生理盐水总量0.2ml。分别于攻击后12h、24h和48h处死感染小鼠，采血，按常规方法制备血清。在McLeod琼脂平板上电镀72 h，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清特异性抗体效价。μ1血清保存于−80°C的5 0 0份血清中，取BALB/c小鼠血液制备正常小鼠血清，不受任何染毒。Tularensis应变。

血清分析程序

抗体同工型的测定

用四抗体小鼠免疫球蛋白亚型阵列(RayBiotech Life，桃树角，GA，USA)测定血清中的免疫球蛋白亚类。小鼠阵列是一种基于玻璃芯片的多重检测方法，检测8种小鼠免疫球蛋白亚类(IgG 1、IgG2a、IgG2b、IgG 3、IgA、IGD、IgE和IgM)和2种轻链类型(kappa和lambda)。简单地说，样品与Cy3等效染料标记的检测抗体混合，并应用于阵列幻灯片。冲洗一步后，用激光扫描仪将幻灯片干燥并扫描。用密度数据提取法(四抗体Q分析仪，RayBiotech Life，桃树角，GA，美国)对结果进行评价。Https://www.raybiotech.com/analysis-tools/).

ELISA法测定效价

选择ELISA实验室技术评估体液免疫反应的大小，以评估持续感染的时间过程和免疫状态。简单地说，ELISA平板被涂上了TularensisFSC 200自溶银-2浓度为1.1×109细菌/水井和4°C培养隔天，用PBS/吐温2 0(0.0 5%v/v)溶液冲洗盘子，用2 0 0μ1的10%小牛血清在37°C下封闭30 min，洗后用PBS串联稀释，37°C孵育90 min。随后，在37°C下洗涤平板，再加入酶标抗体90 min。采用多克隆HRP结合山羊抗小鼠Ig(Bio-Rad Abd Serotec Limited，Oxford，UK)进行检测。然后用TMB溶液进行显色。在450 nm处使用平板阅读器多探测器MagicXBC范式检测平台(贝克曼库尔特，帕萨迪纳，美国)测量了最终的光密度值。还对未涂布的平板进行了检测，以确保免疫血清中的抗体不会与塑料结合。抗体滴度用空白值减去后得到的光密度值表示，该值是从含有洗涤缓冲液的重复井中得到的。

小鼠血清免疫蛋白质组学分析

微型双向电泳

用6 M尿素、2 M硫脲、4%CHAPS、40 mm Tris碱、0.12%脱条纹和0.5%溴酚蓝(pH 3-10)和0.5%载体酰胺(pH6-11)组成的等电聚焦(IEF)复水缓冲液对细菌全细胞溶解。用双软骨酸法测定蛋白质浓度。IEF使用多相电泳系统(GE Healthcare，芝加哥，美国伊利诺伊州)在7cm梯度pi 3-10固定化干地带凝胶上进行。84。简单地说，用凝胶内再水合法将蛋白质负载到聚丙烯酰胺凝胶条上，用非线性固定化的3-10 pH梯度(IPG)从GE保健公司(芝加哥，IL，美国)获得，并根据不同的PI值通过IEF进行分离。IEF后，IPG试纸在含2%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)、50 mm Tris/HCl(pH8.8)、6M尿素、30%(v/v)甘油和1%(w/v)二硫苏糖醇(DTT)的平衡缓冲液中处理。随后，在含有4%(w/v)碘乙酰胺(而不是DTT)的同一溶液中，对条带进行第二次平衡。在第二维度，IPG条嵌入到12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶上。根据标准运行条件对蛋白质Ⅱ多细胞(Bio-Rad，Hercules，CA)进行电泳。84。然后用蓝色染色在参考蛋白图谱上显示蛋白质，而胶体蓝染色则用于质谱。通过目视检查对参考地图进行分析，并用Melanie3软件(Bio-Rad实验室，大力士，美国)对数据进行评估。84.

半干西式杂交

在聚偏二氟乙烯膜上对选定的2-DE凝胶进行电印迹.在4°C的阻断缓冲液中，用1：100稀释1：100的免疫血清，隔夜检测所有免疫反应点。第二天，用0.05%吐温20在三缓冲盐水中清洗膜.多克隆过氧化物酶结合山羊抗鼠IgG抗体(达科，哥本哈根，丹麦)或单克隆HRP结合山羊抗小鼠IgM抗体(Invitrogen，Carlsbad，Ca，美国)稀释1：100，用于二次抗体检测。然后用BM化学发光印迹试剂盒(Boehring，Mannheim，德国)和CL-Xposure薄膜(Pierce，Rockford，IL，USA)对膜进行清洗和制备。

质谱分析

凝胶溶出

从具有代表性的胶体蓝染色凝胶中分离出选定的蛋白质斑点，并进行凝胶内消化。用50%乙腈(ACN)在30℃下用100 mm Tris/HCl(pH8.5)包裹凝胶片20 min。然后，将5%ACN中的50 mm碳酸铵(pH7.8)加入到每个凝胶片中。然后将凝胶片真空干燥，在50 mm碳酸氢铵(pH7.8)中加入0.1μg的胰蛋白酶，然后在37℃下摇匀。用2%三氟乙酸和98%ACN提取蛋白质。用真空干燥机将提取液还原至15μ1左右，在−80°C下冷冻，得到的肽在50%乙腈和0.1%三氟乙酸中加入5 mg/mlα-氰基-4-羟基肉桂酸。在MALDI板上检出含有基质溶液的多肽样品。