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通过转化生长因子-β信号通路诱导调节性T细胞抑制Tc1细胞,改善STZ诱导的1型糖尿病

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发表时间:2021-01-15 13:50作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

1型糖尿病(T1D)是一种慢性自身免疫性疾病,免疫系统破坏胰岛素分泌的胰腺β细胞。除了公认的致病效应T细胞外,调节性T细胞(Tregs)在T1D中也有缺陷。因此,越来越多的治疗方法正在开发,以治疗Tregs。然而,TGF-β诱导的Tregs(ITregs)在T1D中的作用和机制尚不清楚。采用链脲佐菌素(STZ)诱导的临床前T1D小鼠模型,发现iTregs能改善T1D的发育,保护β细胞功能。其预防作用与抑制1型细胞毒性T(Tc1)细胞功能和重新平衡受体的Treg/Tc1细胞比率有关。此外,我们还发现其机制可能与转化生长因子-β介导的mTOR和TCF 1的组合作用有关。除预防作用外,还观察了iTregs对建立的STZ-T1D和非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型的治疗作用,表明iTregs改善了β细胞功能。因此,我们的发现为T1D中iTregs的治疗作用的基本机制提供了关键的新见解。

导言

T1D发生在胰腺β细胞不能产生足够的胰岛素维持正常血糖水平时,儿童是T1D的主要发展群体。据报告,在欧洲,T1D在儿童中的流行率大约每20年增加一倍,1T1D目前造成的预期寿命损失估计为11-13岁。2不幸的是,没有任何治疗方法能预防或治愈T1D,3而T1D患者需要终身外源性胰岛素治疗,这只能延缓疾病的进展。因此,开发专门针对T1D发病机制并最终防治T1D的新疗法是迫切需要的。

众所周知,β细胞的破坏主要是由自身免疫介导的。应激、损伤或死亡的β细胞所产生的信号会将免疫细胞吸收到胰岛,并激活胰岛中的这些细胞。然后,侵入或驻留的巨噬细胞和T细胞在胰岛内释放趋化因子和细胞因子,向β细胞传递促凋亡信号,最终破坏β细胞。4CD8+T细胞在这一过程中起着至关重要的作用。据报道,在人类身上,CD8+细胞毒性T细胞是葡萄膜炎期间最丰富的群体。5和胰岛特异性的自身反应CD8+T细胞浸润最近发病或长期存在的T1D个体的胰岛。6Tc1细胞(CD8-阳性细胞,分泌干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α)主要参与CD8的细胞毒作用。+T细胞在T1D,Tc1细胞在T1D患者中比在正常血糖人群中更常见。7此外,Tc1细胞过继转移在未辐照的成年大鼠胰岛素启动子-HA(RIP-HA)小鼠体内可诱导糖尿病,而分泌IL-4、IL-5和IL-10的Tc2细胞(CD8-阳性细胞)与Tc1细胞相比,不能有效地诱导糖尿病。此外,IFN-γ缺陷小鼠Tc1细胞过继转移不能在RIP-HA小鼠体内诱发糖尿病,提示IFN-γ参与了T1D细胞毒性Tc1细胞的致病作用。8

调节性T细胞(Tregs)是一类影响CD8功能的抑制性T细胞。+T细胞是诱导和维持免疫耐受所必需的细胞。Tregs在T1D的频率和/或功能上存在缺陷。9,10,11此外,增加Treg数(通过过继转移或体内诱导)已被发现对动物和人类T1D具有保护作用,12,13,14从而激发人们对Tregs作为T1D免疫治疗靶点的兴趣。Tregs具有异质性,可分为三个群体:胸腺源性自然发生Tregs(NTregs)、体内诱导Tregs(PTreg)和Tregs体外诱导IL-2+转化生长因子-β(TGF-β)加维甲酸或雷帕霉素(ITregs)。15在Tregs的三种类型中,nTregs是T1D治疗中研究最多的群体。虽然研究工作很有希望,但仍有一些缺陷可能会显著减少nTregs在T1D治疗中的应用,包括:(1)可用性有限,(2)易受炎症诱导的凋亡,(3)不能抑制炎症性Th17细胞,以及(4)炎症时自我转化为效应T细胞。16,17,18相反,我们和其他人已经证明,iTregs没有上面提到的nTregs的缺陷。19,20,21并保持与nTregs相似的抑制功能。此外,iTregs对自身免疫性疾病(如气道变应性炎症)的治疗效果优于nTregs,18类风湿关节炎,22,23和实验性变态反应性脑脊髓炎。24然而,只有少数研究已经测试了iTregs在T1D中的作用,25,26,27其潜在机制尚不清楚。在此,我们研究了iTregs在T1D中的预防和治疗作用,并利用STZ诱导的T1D模型进一步探讨了iTregs对Tc1细胞产生干扰素-γ的影响及其机制。

STZ可通过与胰腺β细胞上的GLUT 2受体结合,特异性地诱导β细胞损伤。与单次大剂量STZ诱导β细胞坏死而无淋巴细胞浸润相比,多次小剂量注射STZ可模拟T细胞介导的胰腺损伤。28,29,30,31因此,我们应用了这个建立良好和广泛使用的stz-t1d模型。32,33,34测试iTregs在糖尿病进展中的作用。我们发现iTregs通过抑制Tc1细胞和再平衡Treg/Tc1细胞来改善T1D的进展。此外,我们发现iTregs对Tc1细胞产生IFN-γ的抑制作用是由于TGF-β介导的mTOR和TCF 1的组合作用所致。最后,我们用建立的STZ-T1D模型和非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型进一步证实了iTreg治疗后所观察到的β细胞功能的改善。因此,我们的数据表明,iTregs作为T1D的细胞基础治疗有很大的潜力。

材料和方法

小鼠

野生型C57BL/6小鼠(6~8周龄)从广东医学实验动物中心(广州)购买。C57BL/6-FoxP 3绿色荧光蛋白老鼠是由TalilChatilla博士(南加州大学洛杉矶分校)慷慨提供的。C57BL/6 Thy1.1转基因小鼠从杰克逊实验室购买(股票编号:000406)。C57BL/6-FoxP 3绿色荧光蛋白小鼠被回交至B6 Thy1.1小鼠,产生Thy1.1+C57BL/6-FoxP 3绿色荧光蛋白老鼠。6周大的NOD/Shiltj小鼠是从Gempharmatech(江苏,中国)购买的,10周大的NOD/Shiltj小鼠是从华福康生物公司(中国北京)购买的。所有动物都被安置在温度(72±3°F)和空气(50±20%相对湿度)控制的房间中,12小时光/暗循环,并给予标准饮食和自来水。所有使用小鼠的实验都是按照中山大学动物保护和使用机构委员会批准的协议进行的。

糖尿病诱导

T1D在Thy1.2中诱导+C57BL/6小鼠(雄性,6-8周龄)采用多次小剂量STZ(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)注射。STZ经腹腔注射50 mg/kg,溶于新鲜冷0.01M柠檬酸缓冲液(pH4.5),溶出20 min,连续5天。小鼠在注射STZ前禁食4~6h,第一次注射后隔夜供应10%蔗糖水,以避免突然低血糖。

细胞转移与糖尿病测量

天真CD4+CD62L+T细胞从脾脏或淋巴结(腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结和腋淋巴结)中分离。总之,Thy1.1的脾脏或淋巴结+C57BL/6-FoxP 3绿色荧光蛋白收集小鼠,通过40m细胞过滤器(美国康宁352340)获得单细胞悬液.用红细胞裂解缓冲液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)裂解脾红细胞,用尼龙羊毛(美国聚科学,18369~50)富集T细胞。用生物素化抗CD8(100704,BioLegend),抗B 220(103204,BioLegend),抗CD11b(101204,BioLegend),抗CD11c(117304,BioLegend),抗CD49b(103522,BioLegend)抗体和抗生物素微球(130-090-485,Miltenyi,Biotec,德国)标记T细胞。用CD62L微球(130-049-701,Miltenyi Biotec,德国)标记后,用自动磁细胞分选机(MACS)标记细胞(Miltenyi,Biotec,德国)。纯洁的CD4+CD62L+用流式细胞仪检测T细胞,以及单纯CD4。+纯度>90%的T细胞(见附图)。斯1)进行iTregs诱导。重组人白细胞介素-2(50 U/mL,R&D系统)在重组人转化生长因子-β(2ng/mL,R&D系统)或Med细胞(CD4)存在下诱导iTregs。+Foxp 3-细胞),仅用重组人白细胞介素-2(IL-2)作用3d。为确定干预效果,3.0×106STZ给药后第1天经尾静脉注入iTregs或Med细胞。此外,STZ诱导的小鼠接受200 lPBS的模型也被认为是额外的对照.在接下来的30天里,每周两次监测非空腹血糖水平,使用一种拥抱式触血仪(OMNIS健康,美国)。血糖浓度超过300 mg/dL或16.7mmol/L的连续两次每日测量被认为是糖尿病发病的标志。自小鼠出现多尿症状后,每3-4天更换一次笼子。在一些实验中,通过I.P.给出了一种碱5抑制剂(Sigma-Aldrich)。在第0、7、14、21和28天,每只小鼠注射0.5mg,以探讨转化生长因子-β信号通路在T1D介导的保护作用中的作用。

为了确定iTregs在建立的T1D中的作用,我们使用了两种模型:STZ-T1D和NOD小鼠。STZ-T1D模型以雄性C57BL/6小鼠为模型,iTregs(3.0×10)为模型。6在上述条件下,C57BL/6小鼠于第7天经尾静脉导入糖尿病小鼠体内,每隔1周测定一次非空腹血糖浓度,后每周检测1~2次。对于一些小鼠,我们在第26天第二次使用相同剂量的iTregs,然后监测血糖水平。NOD小鼠3.0×106单纯CD4体外诱导的iTregs+从C57BL/6小鼠分离的T细胞经尾静脉注入6周龄和10周龄雌性小鼠。每周测1~2次非空腹血糖浓度。采用IPGTT和免疫组织化学方法检测β细胞的功能。

组织学和免疫组织化学

胰腺标本用10%福尔马林过夜固定,石蜡包埋。所有的包埋、切片和H&E染色均由Servicebio公司(中国武汉)进行。用抗胰岛素(1:1600,Abcamm 63820)和抗胰高血糖素(1:8000,Abcamb 92517)抗体连续两次染色,用抗兔的民建联-HRP(OMAP)次级抗体染色,用苏木精和蓝染试剂对细胞核进行染色。用ImageJ软件进行面积测量。用ImageJ软件对胰岛大小和β细胞面积(胰岛素阳性染色)进行形态计量学分析。在预防实验中(注射STZ的同时给予iTregs)和治疗实验(糖尿病发作后给予iTregs)各用一段胰腺,并测量切片上的所有胰岛进行分析。为了避免主题偏见,至少有两位不同的人对章节进行了评估。简单地说,在200×放大的胰腺切片中看到的胰岛是用奥林巴斯显微镜拍摄的(日本东京)。在胰岛面积测量中,用“自由选择”工具绘制标尺图像中的胰岛轮廓,然后用“测量”工具进行面积测量。胰岛的大小报告在结果部分,并表示为2。为了量化β细胞面积与胰岛面积的关系,首先将图像转换为RGB堆栈,然后绘制胰岛轮廓,然后进行自动阈值处理。在使用“测量”工具后,可以读取β细胞面积与胰岛面积的关系。

滑膜炎评估

胰腺组织标本用苏木精和伊红(H&E)染色。从3~5只小鼠的3张非连续切片中确定滑膜炎的程度。每一段中的每一个小岛都如前面所描述的那样被评分。35:0=无淋巴细胞浸润,1=周围神经炎(<30%),2=<50%胰岛浸润,3=>50%胰岛浸润。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

每只小鼠于注射STZ后第15天采血,室温凝块1h,4℃过夜孵育。将血清冷冻在−80°C处进行分析。采用小鼠C肽和胰岛素ELISA试剂盒(南京药源生物技术有限公司),按生产厂家的指示,采用ELISA法测定血清胰岛素和C肽水平。

腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)

葡萄糖耐量评价采用常规IPGTT进行15天后给药。小鼠经腹腔注射20%葡萄糖。注射剂量为2.0g/kg体重。分别于0、15、30、60、120 min经尾静脉出血取血。用血糖仪测量血糖水平(OMNISHealth,美国)。

小鼠天真CD8+T细胞体外分化

天真CD8+CD62L+T细胞从胸腺的脾脏或淋巴结中纯化。+C57BL/6小鼠磁珠分离(Miltenyi,Biotec,德国)与单纯CD4一样+CD62L+分离T细胞。体外诱导的iTregs与天真CD8共培养+CD62L+T细胞(1:1)在体外分化过程中。天真CD8+用抗CD3(1g/ml)和抗CD 28(1g/ml)抗体刺激T细胞(均来自BioLegend),照射(30 CGy)同基因非T细胞(1:1)和重组小鼠IL-12(20 ng/ml,R&D系统)。培养3d后,用聚甲基丙烯酸甲酯(PMA)和离体霉素(Sigma-Aldrich)刺激分化细胞5h,最后4 h加入BFA(BFA,BioLegend),流式细胞仪检测IFN-γ的表达。为探讨其可能机制,在共培养体系中加入了碱性5抑制剂(10μm),测定了细胞分化率、mTOR活化和TCF 1表达。

流式细胞术分析

抗CD4(GK1.5,PerCP/Cy5.5),CD8(53-6.7,PerCP/Cy5.5),Thy1.1(OX-7,PE),Foxp 3(MF-14,AlexaFluor 647),IFN-γ(XMG1.2,APC),IL-17(TC11-18H10.1,PE),神经皮质素-1(3E12,PE)。从Invitrogen公司购买了一种抗Foxp 3抗体(FJK-16S,PE-Cyanine7)。抗磷脂S6核糖体蛋白(Ser 240/244)(D68F8,Alexa Fluor 647)和TCF 1(C63D9,Alexa Fluor 647)的抗体来源于细胞信号技术。采用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BMSFI 500-300,Invitrogen)检测细胞凋亡。结果在BD、FACSCalibur或BD LSRFortessa流式细胞仪上进行分析。为了进行体内外γ检测,分别于注射stz后第15天和第30天从糖尿病小鼠脾、肠系膜和腹股沟淋巴结及胰腺淋巴结中分离淋巴细胞,然后用pma(50 ng/ml)和离体霉素(500 ng/ml)刺激体外培养5 h,最后4 h加入bfa。+流式细胞术分析T细胞。

定量聚合酶链反应

根据制造商的指示,采用RNeaseMiniKit(Chiagen,Valencia,CA,USA)从肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结中提取总RNA,用1μgRNA(OD 260 nm/OD 280 nm=1.8~2.2),用PRIM-Script RT试剂试剂盒(Takara Bio Inc.,Shiga,Japan)合成第一链cDNA。定量聚合酶链式反应(QPCR)是在7500快速(ABI)RT-PCR仪器上使用SYBR PreMix Ex Taq(Takara Bio Inc.,Shiga,日本)进行的。QPCR:95°C预变性30 s,95°C 5 s,60°C 34 s,放大40次,95°C 15 s,60°C 1 min,95°C 15s(熔融曲线)。计算采用2^(-δCT)法,并以甘油-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为管家基因进行正常化。

西方墨迹

从肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结中分离蛋白质。36采用标准SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和增强化学发光检测试剂(GE Healthcare BiosciesAB,Uppsala,瑞典)进行Westernblotting。采用抗S6核糖体蛋白(S6)、磷脂-S6核糖体蛋白(Ser 240/244)、TCF 1和GAPDH(均来自细胞信号技术,BEVERY,MA)的抗体。免疫反应用凝胶密度扫描法半定量测定,用MCID图像分析系统(图像研究公司)进行分析。

统计分析

所有结果均以平均±标准差(S.D.)表示。多组间的差异采用单因素或双向方差分析(ANOVA)。当方差分析显示有显着性差异时,用Dunnett‘s检验对各组进行配对比较。双尾未配对t试验或曼-惠特尼试验用于两组比较。1用卡方检验比较各组糖尿病发病率。在所有的分析中,P < 0.05 was considered statistically significant.

结果

ITregs改善T1D进展及改善β细胞功能

为了建立T1D临床前动物模型,C57BL/6小鼠注射多剂量链脲佐菌素(STZ),这是一种被广泛接受的模型。1A)。与文献报道的数据一致,注射STZ的小鼠在第一次给药后第9天出现进行性高血糖(图1)。1B)。为检测iTregs对T1D的治疗作用,用3×10过继转移C57BL/6小鼠,观察iTregs对T1D的治疗作用6ITregs在首次注射STZ期间。值得注意的是,注射iTregs的小鼠血糖水平明显低于单用STZ治疗的小鼠(模型)和CD4。+Foxp 3-细胞输注(MED)组(图1)。1B)。ITregs给药后,疾病的发生明显推迟,与对照组相比,iTregs组的糖尿病发病率显著降低(图1)。1C)。为了确定改善血糖控制是否与β细胞的变化有关,我们在iTreg给药后15天对STZ处理的小鼠进行了腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)。如图所示。1D3组小鼠腹腔注射葡萄糖15 min后血糖均达到高峰。然而,iTregs处理的小鼠对体内葡萄糖负荷的清除速度明显快于模型组和MED组;这种差异在120 min时达到显着性(图一)。1D)。曲线下面积也证明iTregs处理可以保留β细胞功能(图1)。1E)。为了进一步评估β细胞功能,在第15天测定了血清胰岛素和C肽水平。与先前的结果一致,iTregs处理的小鼠胰岛素分泌和C肽生成增加。1F,G)。为了直接揭示iTregs的保护作用,组织化学分析显示产生胰岛素的β细胞的保守性(如图所示)。)。以所有的胰岛为个体样本,iTregs处理的小鼠保持了更大的胰岛大小(图一)。1I与其他两组相比,胰岛产生胰岛素的β细胞具有更高的保守性(图二)。1J)。如果用每个样品的平均胰岛大小或β细胞面积相对于胰岛面积进行分析,我们可以看到,iTregs组小鼠的胰岛大小仍然较大(补充图)。斯2A)和更多的胰岛素产生的β细胞每个胰岛(补充图。斯2B)。这些结果表明,iTregs能改善STZ诱导的T1D小鼠模型的T1D进展,保护β细胞功能。

图1

ITregs改善了T1D的进展,改善了β细胞的功能。ITregs(CD4)+Foxp 3+或Med细胞(CD4)+Foxp 3-)来自Thy1.1+Foxp 3绿色荧光蛋白小鼠注射Thy1.2+T1D小鼠经尾静脉。A活体实验原理图。B三组小鼠非空腹血糖水平(n=每组6-8人)。数据以平均±S.D表示。C糖尿病的发病率。采用卡方检验对各组进行比较。DITregs给药后第15天IPGTT结果(n=每组6-10人)。采用Mann-Whitney检验对模型组和iTregs组进行比较,数据为平均±S.D。EIPGTT的AUC。双尾未配对t数据显示为平均±S.D。FG第15天血清胰岛素和C肽水平(n=每组4人)。双尾未配对t-检验;数据显示为平均±S.D。H胰岛素和胰高血糖素染色的典型图像。胰岛素或胰高血糖素在细胞中的表达表现为棕色染色。IJ每个胰腺切片所见的所有胰岛均被用于分析。三组胰岛大小及β细胞面积与胰岛面积关系的统计分析(n=每组5人)。单因素方差分析数据以平均±S.D表示.实验重复三次。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001; ns indicates no significance

过继转移的iTregs在体内迁移到胰腺和免疫器官并保持其表型特征。

ITregs迁移到病变器官对疗效有重要意义。为了研究过继转移的iTregs在体内的命运,从Thy1.1衍生出的iTregs+Foxp 3绿色荧光蛋白报告小鼠被转移到Thy1.2中+STZ诱导的T1D小鼠在注射后第15天和第30天用流式细胞仪检测iTregs在不同器官的分布。结果表明,注射的iTregs(CD4)+Foxp3-GFP+)脾脏、淋巴结(肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结),重要的是第15天和第30天的PLN。2A)。虽然脾脏和淋巴结的频率在第30天降低了,不管是在活细胞上还是在CD4上。+使用T细胞(图1)。2B和C),这些免疫组织中的iTregs数量保持稳定(如图所示)。二维空间)。活PBMCs中iTregs的频率在第30天与第15天基本相同,而在总CD4上则下降。+T细胞(图1.2E-G)。最重要和引人注目的是,iTregs迁移到胰腺并持续了至少30天(见图)。2H-J),表明有很强的能力回到目标器官。为了进一步研究转移的iTregs是否能在体内维持其表型特征,我们首先检测了调节性T细胞的主转录因子Foxp 3的表达,结果表明,调节性T细胞中Foxp 3的表达无明显变化(附图)。斯3)和收养后的转移(如图所示)。2K,L)。接下来我们决定在炎症条件下,iTregs是否能转化为Th1或Th17细胞。于注射后第30d取脾、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和胰腺淋巴结的淋巴细胞,用PMA和放线菌素体外刺激。用细胞内染色法检测iTregs中IFN-γ和IL-17A的产生。如图所示。2M,只有极少数iTregs在注射后30天内产生干扰素-γ或IL-17A,而Thy1.1。+CD4+Foxp 3Med组细胞产生上述细胞因子,表明iTregs在体内未转化为Th1或Th17细胞。

图2

过继转移的iTregs迁移到胰腺和免疫器官,并维持其在体内的表型特征。ITregs(CD4)+Foxp 3+)来自Thy1.1+Foxp 3绿色荧光蛋白小鼠注射Thy1.2+在第15天和第30天检测T1D小鼠和iTregs器官的分布、植入和稳定性。A显示iTregs(CD4)分布的有代表性的流式细胞术数据+绿色荧光蛋白+在脾脏(SP)、肠系膜和腹股沟淋巴结(LNS)和胰腺淋巴结(PLNs)的第15天(上)和第30天(下)。全部活细胞。活细胞总数中iTregs细胞百分比的分析(n=5)(B)与CD4有关+T细胞(n=5)(C)在SP、LNS和PLN中。双尾未配对t-检验;数据显示为平均±S.D。DITregs细胞数分析(n=7)在SP、LNS和PLN中。双尾未配对t-检验;数据显示为平均±S.D。有代表性的流式细胞仪数据(E)和统计数据(F)显示iTregs在PBMCs门控的总活细胞中的分布(n=5)。双尾未配对t-检验;数据显示为平均±S.D。G与CD4相关的iTregs细胞百分比分析+T细胞(n=5)在PBMC中。双尾未配对t检验,数据以平均±S.D表示.有代表性的流式细胞仪数据(H)和统计数据(I)显示iTregs在胰腺门控的总活细胞中的分布(n=5)。双尾未配对t检验,数据以平均±S.D表示.JCD4中iTregs细胞百分比的分析+T细胞群(n=5)胰腺。双尾未配对t检验,数据以平均±S.D表示.代表性流量数据(K)和统计数据(L)显示Foxp 3在第15天和第30天在CD4门控的不同组织中的表达。+Thy1.1+细胞(n=3)。数据以平均±S.D表示。M有代表性的流式细胞仪数据显示iTregs或Med细胞在第30天转化为Th1和Th17细胞;门控在CD4上+Thy1.1+细胞。实验重复三次。*P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001; ns indicates no significance

受体STZ诱导的T1D小鼠iTregs对内源性IFN-γ产生的CD8 T细胞和调节性T细胞的再平衡

为了探讨iTregs改善T1D进展的机制,我们在受体小鼠体内检测了内源性IFN-γ-和IL-17A产生T细胞和Tregs,多种证据表明效应T细胞和Tregs之间的平衡在T1D中起关键作用。内源性CD4产生IFN-γ和IL-17A的研究+或CD8+T细胞(Thy1.2)+STZ诱导的T1D小鼠脾、淋巴结(肠系膜、腹股沟、胰腺)经iTregs或对照组Med细胞注射后,用细胞内染色法检测。模型组、Med组和iTregs组中,IFN-γ-或IL-17A产生CD4的频率无明显差异。+T细胞或产生白细胞介素-17A的CD8+LNS中的T细胞(补充图)。斯4),脾脏,或PLN(数据未显示)。然而,干扰素-γ产生CD8的频率。+在第15天和第30天,iTregs组T细胞均显著减少,提示iTregs可能通过抑制CD8产生γ的能力而抑制T1D的进展。+T细胞(图1.3A-C).

图3

ITregs重新平衡受体STZ诱导的T1D小鼠内源性IFN-γ产生的CD8 T细胞和调节性T细胞(Tregs)。从SP、LNS和PLN中分离出淋巴细胞,用PMA(50 ng/ml)和离体霉素(500 ng/ml)体外刺激5 h,最后加入10μg/ml的Brefeldin A(10 ng/ml),细胞内IFN-γ在CD8上表达。+流式细胞术分析T细胞。A具有代表性的流式细胞术数据显示IFN-γ在CD8上的表达+Thy1.2+T细胞干扰素-γ的统计分析+CD8群体+Thy1.2+T细胞在第15天(B)和第30天(C)在不同的组织中(n=4)。数据以平均±S.D表示。D具有代表性的流式细胞仪数据显示Foxp 3的百分比+CD4门控细胞+Thy1.2+第15天T细胞.Foxp 3的统计分析+CD4细胞群+Thy1.2+第15天的细胞(E)和第30天(F)在不同的组织中(n=4)。数据以平均±S.D表示。在第15天,收件人Treg百分比与Tc1百分比的比率(G)和第30天(H) (n=每组4人)。数据以平均±S.D表示。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001; ns indicates no significance

其次,我们研究了iTregs对内源性Tregs的影响,其频率在T1D时降低。如图所示。3D,E,内源Tregs的频率(Thy1.2)+第15天iTregs处理小鼠脾脏和淋巴结(肠系膜、腹股沟和胰腺)较模型组和MED对照组明显增加,说明iTregs能改善调节性T细胞的稳态。NRP-1(NRP-1)可作为鉴别nTregs和iTregs的特异性细胞标记物,37因此,我们对NRP-1和Foxp 3进行了共染色,以确定内源性Tregs的增加是主要在胸腺(TTreg)中产生,还是在外周部位(PTreg)产生。如图所示。斯5受体Tregs上NRP-1的表达在三组间基本相同,提示iTregs主要是内源性nTregs,从而提高了T1D小鼠的Tregs百分率。证实iTregs能调节内源性调节性T细胞与产生γ的CD8之间的平衡。+T细胞(Tc1细胞),计算Treg/Tc1细胞比率。虽然在第30天内源性Tregs的频率在iTreg处理的小鼠中没有升高(图1)。3FITregs组的Treg/Tc1细胞比例在第15天和第30天均显著高于对照组(图1)。3G,H)。因此,iTregs可以在T1D小鼠模型中重新平衡Tregs和Tc1细胞。

ITregs通过抑制mTOR信号转导及促进tcf 1表达而抑制tc1细胞。

探讨抑制干扰素γ产生CD8的基础+我们首先用iTregs技术检测了CD8的增殖能力。+ITregs给药后的t细胞经Ki-67染色后,发现iTregs不改变CD8的增殖。+T细胞(图1.4A,B)。此外,我们没有观察到三组间不同程度的AnnexinV染色,表明iTregs不影响CD8的凋亡。+T细胞(图1)。4C,D)。然后,我们分析了iTregs是否能抑制Tc1细胞的分化。如图所示。4EITregs明显抑制Tc1细胞体外极化过程中IFN-γ的产生。由于TGF-β信号通路被认为可以调节iTregs介导的抑制功能,38,39然后,我们研究了tf-β本身是否也能抑制tc1细胞的极化,以及干扰tf-β信号通路是否不能抑制CD8所产生的干扰素-γ。+T细胞在体外共培养体系中加入活化素样激酶5(ALK 5,又称1型转化生长因子-β受体)抑制剂,可完全阻断iTregs对IFN-γ产生的抑制作用(如图5所示)。4E、F提示iTregs的抑制作用与TGF-β信号转导有关。

图4

ITregs通过mTOR和TCF 1信号转导的转化生长因子-β依赖性结合作用抑制Tc1细胞。具有代表性的流式细胞仪数据和统计分析表明,iTregs不影响CD8。+T细胞增殖(A, B)或凋亡(C, D)在体内(n=5)。单因素方差分析,数据以平均±S.D表示.天真CD8+体外将T细胞极化为tc1细胞,转化生长因子-β(2ng/ml),iTregs(iTregs:CD8)。+将T细胞=1:1或碱性5抑制剂(10μm)加入培养体系中。E, F具有代表性的流式细胞仪数据和统计分析表明,iTregs抑制了CD8细胞中IFN-γ的诱导。+T细胞,类似于转化生长因子-β,这种功能依赖于转化生长因子-β信号.数据以平均±S.D表示。五个独立的实验。G, H有代表性的流式细胞仪数据和统计分析显示S6蛋白在24小时内在不同组间磷酸化。数据以平均±S.D表示。四个独立的实验。I,J具有代表性的流式细胞仪数据和统计分析表明,在Tc1细胞诱导过程中,iTregs在72h仍保持高表达,这种作用部分依赖于转化生长因子-β信号。数据以平均±S.D表示。四个独立的实验。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001; ns indicates no significance

以前的研究表明mTOR活性是CD8所必需的。+T细胞维持效应细胞的分化和功能。40,41,42因此,为了确定iTregs是否通过抑制mTOR信号来抑制IFN-γ的产生,我们检测了tc1细胞分化系统中s6蛋白的磷酸化,该蛋白是mTOR活化的指标。我们发现iTregs处理对S6磷酸化有明显的抑制作用,这种抑制部分依赖于TGF-β信号,因为碱5抑制剂部分地抑制了S6磷酸化(如图所示)。4G,H).

由于T细胞因子1(TCF 1)也参与Tc1细胞的分化,炎症信号可抑制CD8期TCF 1的表达。+T细胞极化与CD8+缺乏Tcf 1的T细胞会发生默认的效应分化,43,44,45我们用流式细胞术检测tcf 1蛋白水平,以确定tcf 1是否参与iTreg介导的抑制CD8中干扰素γ产生的过程。+T细胞我们发现tcf 1的表达在效应细胞CD8中确实降低了。+T细胞分化,而iTregs处理保持高表达的TCF 1蛋白,这一作用也部分依赖于转化生长因子-β(图一)。4I,J)。这些结果共同提示,转化生长因子-β依赖的抑制mTOR信号和促进TCF 1是抑制Tc1细胞的关键。

ITregs对STZ诱导的T1D小鼠的治疗作用依赖于转化生长因子-β信号

为了扩大我们的发现,转化生长因子-β信号是至关重要的治疗作用在T1D,我们研究了碱5抑制剂在治疗的作用。如图所示。5A在iTregs治疗方案的背景下,每隔1周注射5次碱5抑制剂,如图所示。1A。与体外结果一致,干扰转化生长因子-β信号传导与碱5抑制剂,取消了iTregs在STZ诱导的T1D发展中的保护作用,如血糖升高所示(如图1所示)。5B糖尿病发病率增加(图一)。5C)。而且,与模型组相比,iTregs组有改善滑膜炎的趋势,而TGF-β信号传导阻滞组小鼠的胰岛炎较iTregs组更严重(如图所示)。5(d-F)胰岛大小和β细胞面积相对于胰岛面积的减小(图1)。5D、G、H和附图。斯6进一步证明iTregs在STZ-T1D中的保护作用依赖于转化生长因子-β信号转导。我们进一步研究了mTOR信号和TCF 1是否参与了iTregs的体外处理,发现mTOR mRNA和S6磷酸化水平明显降低,而TCF1mRNA和蛋白表达被促进,TGF-β信号抑制逆转了这些表型(如图所示)。5I-N)。这些结果表明,TGF-β对mTOR信号的抑制和TCF 1的促进是iTregs对STZ诱导的T1D小鼠模型的治疗作用的关键。

图5

ITregs对STZ诱导的T1D小鼠的治疗作用依赖于TGF-β信号转导.将碱5抑制剂注射到STZ-T1D小鼠体内,验证TGF-β在iTregs介导的保护中的作用。A活体实验原理图。B非空腹血糖水平和糖尿病发病率显示(n=5对模型组和n=6适用于iTregs组)。C糖尿病的发病率。卡方检验比较组。DHE、胰岛素和胰高血糖素染色4组。胰岛素或胰高血糖素在细胞中的表达表现为棕色染色。E, F四组间滑膜炎评分的统计分析(n=每组5人)。单因素方差分析数据以平均±S.D表示.G, H每个胰腺切片所见的所有胰岛均被用于分析。四组胰岛大小及β细胞面积与胰岛面积关系的统计分析(n=每组5人)。单因素方差分析数据以平均±S.D表示.I, J第15天LNS淋巴细胞相对mTOR和TCF 1 mRNA水平n=每组5人)。单因素方差分析数据以平均±S.D表示.K, L具有代表性的westernblot和统计学分析显示LNS细胞在第15天的淋巴细胞中有磷酸化的S6蛋白表达。n=每组5人)。单因素方差分析数据以平均±S.D表示.M, N具有代表性的Westernblot和统计学分析显示TCF 1蛋白在第15天的LNS淋巴细胞中表达。n=每组5人)。单因素方差分析数据以平均±S.D表示.实验被重复了两次n模型=15,模型+碱5抑制剂,iTreg+碱5抑制剂组和n=16对iTregs组而言。*P < 0.05, **P < 0.01, and ****P < 0.0001; ns indicates no significance

ITregs改善T1D小鼠β细胞功能的实验研究

除了评估预防作用外,我们还用STZ-T1D和NOD小鼠进一步评估了iTregs对建立的T1D的治疗效果。大多数小鼠在第一次注射STZ后第7天出现糖尿病。这些小鼠随机分为iTregs治疗组和模型组。工作模型如图所示。6A。如图所示。6BITregs治疗组10只小鼠中有6只和2只在细胞干预后第2天和第4天的非空腹血糖水平分别低于16.7mmol/L,而模型组无糖尿病缓解。ITregs注射后第6天血糖水平回升至与模型组相似的水平。细胞转移后1周的IPGTT结果如图所示。6d。ITregs治疗6天后,所有小鼠的血糖浓度均有所回升,但3只小鼠的β细胞功能仍比模型组小鼠强,这是模型组在120 min时观察到的低血糖水平的原因之一。实验后1天,分离3只小鼠胰腺,观察胰岛大小和β细胞功能。对每个胰腺三部分的胰岛进行了胰岛炎、胰岛面积和β细胞面积与胰岛面积的关系评价。根据浸润程度分为0~3分。如图所示。6E-GITregs移植后1周,滑膜炎的严重程度明显减轻。以所有的胰岛为个体样本,iTregs处理的小鼠保留了一个大得多的胰岛大小(图一)。6E与模型组小鼠相比,模型组每个胰岛产生胰岛素的β细胞较多。6E和(I)。如果用每个样品的平均胰岛大小或β细胞面积相对于胰岛面积进行分析,我们发现iTregs组小鼠的胰岛大小仍然较大(补充图)。斯7Aβ细胞面积与胰岛面积的关系未达到统计学意义(补充图)。斯7b)。由于iTregs的保护作用似乎没有持续很长时间,我们重新注入了3×106注射STZ后26天,iTregs进入小鼠体内。第二次iTregs移植后29天血糖水平未下降,7只小鼠中有1只血糖低于16.7mmol/L(图1)。6B).

图6

ITregs改善建立的T1D小鼠β细胞功能。用STZ诱导C57BL/6小鼠糖尿病,发病后注射iTregs。A治疗实验原理图。将iTregs注射到糖尿病小鼠体内(nSTZ注射后7d,3只β细胞功能改善的小鼠在细胞干预后第8天处死胰腺进行分析。第二次注射iTregs是在STZ注射后26天(n7),随后监测血糖水平。B非空腹血糖水平显示(n=7-10)。C糖尿病的发病率显示。D结果iTregs注射一周后进行IPGTT。双尾未配对t-检验;数据显示为平均±S.D。第一次注射iTregs后第8天,每组处死3只小鼠。HE、胰岛素和胰高血糖素染色的典型图像(E)。各组间滑膜炎评分的统计分析(n=3)。双尾未配对t检验;数据显示为平均值±S.D(F, G)。分析中包括了每个胰腺三个部分的所有胰岛。海岛面积统计分析(H)和β细胞面积与胰岛面积的关系(I)。双尾未配对t数据显示为平均±S.D。ITregs被注射到6周龄(n=每组5人)和10周(n每组5只)NOD小鼠。第0周为iTregs注射日,血糖监测81天。J两组糖尿病的发生率。K胰岛素染色的代表性图像。分析中包括了每个胰腺三个部分的所有胰岛。海岛面积统计分析(L)和β细胞面积与胰岛面积的关系(M)。双尾未配对t-检验;数据显示为平均±S.D。*P < 0.05, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001

我们还评价了iTregs对NOD小鼠的保护作用,这种作用是由于自身免疫介导的对胰腺β细胞的破坏而自发形成T1D的。虽然两组血糖水平的差异没有达到统计学意义(附图)。斯8A),iTregs显着地延缓了疾病的发生,降低了糖尿病的发病率。6J)。比较两组细胞转移后40d的β细胞功能。IPGTT实验中不同时间点血糖水平的差异及IPGTT的AUC差异均无统计学意义(附图)。斯8B、c)。胰岛素染色显示,iTregs处理后的小鼠胰岛面积明显增大,分泌胰岛素的胰腺β细胞增多(图一)。6K-M和补充图。斯8d、E)。这些结果表明,在建立的T1D环境下,iTregs能在一定程度上改善β细胞的功能。

讨论

T1D患者被证明在Treg细胞的频率和/或功能上存在缺陷,9,10,11对动物和人类的T1D都有保护作用。12,13,14迄今为止,较稳定的Treg种群iTregs在T1D中的作用很少被研究。在本文中,我们发现iTregs是稳定的,这与其他文献中的研究结果是一致的。15,19因为它们维持较高水平的Foxp 3表达,而很少表达促炎细胞因子,如IL-17A和IFN-γ。这些体外诱导的iTregs对STZ诱导的T1D具有保护作用。它们可以延缓T1D的发生,改善疾病的严重程度,如降低血糖水平,减少胰岛损伤,改善β细胞的形态和功能。

用多次小剂量STZ注射建立的T1D模型是一种广泛应用的T1D模型。无论是否有直接的毒性作用,随后的自身免疫反应都会导致β细胞凋亡,进而诱导T细胞浸润到胰岛内,提示该模型中存在免疫失衡的作用。46因此,iTregs在STZ-T1D中的功能并不奇怪,因为iTregs具有很强的免疫抑制功能。

虽然以前的一些研究报告了iTregs在T1D中的治疗潜力,25,26,27除了一篇文章提到iTregs可能通过FasL依赖的细胞毒性抑制Th1细胞起作用外,这一机制还没有得到彻底的研究。25由于T1D是公认的自身免疫性疾病,iTregs主要通过免疫抑制发挥作用,我们进一步阐明了iTregs对T1D的保护作用机制。在炎症性T细胞亚群中,Tc1细胞主要被iTregs抑制。当细胞毒性Tc1细胞在糖尿病前期小鼠和新诊断为1型糖尿病的患者中随着疾病的进展而积累时,我们得出结论:提示CD8的改变。+T细胞效应功能是iTregs治疗保留胰岛β细胞功能的基础。其机制可能与抑制Tc1细胞增殖、增加Tc1细胞凋亡、减少Tc1细胞浸润和/或抑制Tc1细胞分化有关。结果表明,iTregs不影响CD8的增殖或凋亡。+T细胞存在于脾脏或淋巴结中,但在体外明显抑制Tc1细胞的极化。CCR 5在Tc1细胞上的高表达,其配体为CCL 3、CCl 4和CCL 5。8,47Morlacchi等人以前的报告。其他人已经证实,Tregs可以靶向树突状细胞介导的促炎趋化因子(CCL 3和CCl 4)的产生,从而介导靶T细胞的合成减少。48,49在T1D小鼠中,iTregs是否具有减少Tc1细胞向靶组织迁移的能力尚不清楚,值得在不久的将来进一步研究。

转化生长因子-β是一种重要的多向性细胞因子,具有很强的免疫调节功能。38,39TGF-β可抑制Th1细胞发育过程中IFN-γ的表达。50此外,一篇论文还报道了tvt-β信号对CD4的关键作用。+CD 25+Treg细胞介导的CD8中自身反应性胰岛特异性细胞毒性T淋巴细胞的调节+T细胞介导的T1D模型。51因此,我们毫不奇怪地证明,iTregs对tc1细胞的调节作用也依赖于tf-β,因为使用碱5抑制剂阻断tf-β信号传导完全消除了cd8对干扰素γ产生的抑制作用。+T细胞体外培养。

卵泡调节性T细胞能显著抑制CD8的活化+T细胞在一定程度上依赖于IL-10,可能还依赖于转化生长因子-β.52据报道,IL-10对iTregs的免疫调节功能也很重要。38然而,在我们的研究中,我们发现IL-10信号在Tc1细胞极化过程中对iTregs的抑制作用是可有可无的,因为我们在培养系统中加入一系列剂量的抗IL-10抗体后,IFN-γ的表达没有明显变化(数据未显示)。这种差异可以用不同的细胞培养系统和不同的指数参数来解释。

由于研究表明在维持效应细胞CD8时需要有mTOR活性。+T细胞分化和mTOR是转化生长因子-β在小鼠和人NK细胞中的重要靶点,导致NK细胞的发育和杀伤活性停止。53,54结论:iTregs通过转化生长因子-β介导的mTOR失活抑制Tc1细胞的分化。Tcf 1缺乏症导致CD4中IFN-γ生成增加。+T细胞,而TCF 1的过度表达则导致IFN-γ的产生受到抑制.55最近的研究表明,TCF 1抑制效应因子CD8。+T细胞的分化和功能直接或间接通过表观遗传修饰的干扰素-γ增强子,Tcf 1的剂量和蛋白稳定性是抑制IFN-γ产生的关键。56所有这些研究都支持我们的发现,即iTregs可能通过维持TCF 1蛋白的高表达而抑制Tc1细胞。我们的结果表明,转化生长因子-β也需要这种作用.TGF-β介导的TCF 1持续表达的一个可能机制可能是抑制转录因子信号转导子和转录激活因子(STAT)4的表达,因为Tc1细胞极化系统中使用的炎症细胞因子IL-12可以通过STAT 4诱导TCF 1表达下调。45TGF-β通过下调STAT-4的表达,特异性地抑制Th1细胞的分化。57然而,仍需进一步的实验,尤其是转基因小鼠,以直接证明转化生长因子-β如何抑制mTOR激活,维持TCF 1的表达,并确定糖尿病时Tc1细胞中mTOR与TCF 1信号转导的关系。

由于iTregs对糖尿病发病有如此强大的保护作用,我们评价了其在建立的T1D中的作用。结果显示,细胞转移后不久,iTregs降低了血糖水平,改善了β细胞功能,但这种作用仅持续了几天。ITregs主要通过免疫抑制发挥作用,细胞转移后iTregs可显著抑制糖尿病小鼠的自身免疫应答,从而导致血糖水平降低,β细胞功能改善。然而,早期糖尿病小鼠的自身免疫反应可能如此强烈,以至于iTregs未能持续抑制它,从而导致血糖水平回升。增加细胞转移产品中的iTregs细胞数量和频率可能有助于解决这一问题,这可以进一步测试。令人惊讶的是,一只小鼠在注射iTregs大约两个月后血糖达到了正常水平。一种解释可能是,iTregs除了发挥免疫抑制功能外,还具有修复受损组织的能力。以前的研究报告说,Tregs可以通过直接与组织祖细胞的相互作用或通过与支持细胞的相互作用来促进组织修复,从而为组织修复创造合适的干细胞生态位。58和安非他明,59角质细胞生长因子60CCN 3,61VEGFA,62Jagl,63和IL-1064在组织修复过程中起着重要的作用。在不久的将来,有兴趣确定iTregs在T1D小鼠或其他疾病模型中是否具有再生作用。

除了STZ-T1D模型外,还利用自发发展为糖尿病的NOD小鼠,探讨了iTregs的治疗作用。由于小样本的限制,我们只能看到血糖水平的下降和糖尿病发病的延迟。值得注意的是,iTregs确实保持了更大的胰岛大小和更多的功能β细胞,这促使我们优化细胞干预的剂量和频率,并在未来使用更多的NOD小鼠来进一步阐明iTregs的治疗作用。

综上所述,本研究证实了iTregs在STZ-T1D模型中自身免疫应答和β细胞保护中的治疗作用。其作用机制可能与tf-β依赖性地降低CD8中的IFN-γ表达有关。+T细胞在分子水平上,转化生长因子-β抑制mTOR激活和维持TCF 1蛋白的高表达可能参与了iTregs介导的对Tc1细胞的抑制作用。7)。我们的工作为延缓糖尿病的发生和发展提供了一种潜在的新的治疗策略。

图7

STZ-T1D小鼠iTregs迁移模型的建立、稳定性及功能研究。ITregs迁移到PBMC、胰腺、脾脏和淋巴结。ITregs在STZ-T1D小鼠体内存活至少30天,维持Foxp 3的表达及对IL-17和IFN-γ分泌的抗性,表明iTregs在体内稳定。ITregs对受体小鼠β细胞功能有保护作用,其机制可能是通过提高受体小鼠的Treg水平而抑制1型细胞毒性T细胞(Tc1)功能,从而重新平衡受体的Treg/Tc1细胞比例。ITregs对Tc1细胞的作用依赖于转化生长因子-β介导的联合作用对mTOR和tcf 1信号转导的影响


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