超纯化脂多糖揭示TLR 4的物种特异性信号偏差：巨噬细胞功能的重要性

TLR 4位点和细菌来源的脂多糖在转录因子、辅助性分子和产物的下游激活中起着重要作用。在这里，这是通过使用经典激活和交替激活的巨噬细胞来证明的.我们发现，当极化时，人巨噬细胞差异表达和定位TLR 4，从而导致对来自以下方面的LPS的偏误识别和信号传递。铜绿假单胞菌、大肠杆菌和肠道沙门氏菌。活化分析表明，在经典活化的巨噬细胞中，铜绿假单胞菌TLR 4到p65的细胞膜信号依赖于TAK 1和TBK 1信号。大肠杆菌信号依赖于或独立于内小体，利用TAK 1-和TBK 1-信号诱导p65和IRF 3诱导基因和细胞因子。肠球菌然而，只有p65和IRF 3通过内小体信号介导磷酸化。这一发现概述了先天免疫细胞(如巨噬细胞)区分细菌种类和通过TLR 4启动特异性应答的明确信号机制。

慢性炎症性疾病，如炎症性肠病(IBD)，部分原因是机体对微生物的免疫反应失调。这种失调，可能是由感染引起的，也可能是通过大量自然共生导致的，而致病菌被称为致病细菌。在人类群体中可以经历这种转变的常见的共生细菌包括，但不限于，铜绿假单胞菌, 大肠杆菌，和肠沙门氏菌1。通过适应性的信号机制和增加的毒力因子，这些细菌可能成为问题：附着增加，生物膜形成，和侵袭性。2。因此，能够区分这些不具威胁的共生微生物和那些会对宿主造成伤害的微生物，似乎是身体应该发展出来的一个明显特征。然而，目前的文献对宿主先天免疫系统如何实现这一差异知之甚少。天然免疫细胞库的一个关键组成部分是广泛的模式识别受体(PRRs)的表达，它涉及到对大量微生物成分的感知。

在PRRs的超家族中，一个很大且特征良好的家族是Toll样受体(Toll样受体)，它广泛分布于质膜表面，或结合在许多天然免疫细胞的细胞器中。目前的证据表明，所有的TLRs，除内含子dsRNA受体TLR 3外，都是通过髓系分化初级反应88(MyD 88)依赖途径发出信号的。

LPS受体tLR 4的表达和定位受到严格调控，目的是通过共同微生物的存在来限制促炎介质的大体诱导，这是一个耐受性的过程。3。典型的是，TLR 4的绝大部分表达在细胞膜上，在细胞膜上可以感受到胞外细菌脂多糖，诱导级联事件，最终诱导活化B细胞(NF-κB)驱动的核因子κ-轻链增强子(NF-B)驱动的细胞因子。然而，有时TLR 4在细胞表面内吞受体/配体复合物后，可利用含有tir结构域的诱导型干扰素(Trif)，导致干扰素调节因子3(Irf 3)诱导的Ⅰ型干扰素应答。4.

许多寄生在肠道的常见细菌很容易被机会性感染细菌所淹没，或者通过环境压力而表现出一种更具致病性的表型。5。所有已知的革兰氏阴性菌都在细胞壁外膜结构中表达高水平的物种特异性脂多糖，其长度可以通过相移调节过程来控制。这一现象的目的是辩论的；然而，我们和其他许多人认为，除了一个节能的过程，脂多糖缩短和延长可以帮助细菌粘附，致病性，和免疫系统的能见度。6.

上述情况；大肠杆菌, 肠球菌和铜绿假单胞菌这是三种具有致病特征的血清型(变体)的常见细菌株。由于它们的脂多糖含量，它们都有激活TLR 4的能力，尽管它们的感染特征(如它们感染的地点和方式)引起了人们对哪些细胞能够识别它们的疑问。在这个名单的最前面是巨噬细胞。外周来源的巨噬细胞和驻留的巨噬细胞都有可能通过大量表达TLR 4来识别LPS。还应注意的是，在炎症情况下，例如在慢性炎症性疾病和细菌感染中，它们的表型发生了变化。这种表型转移在理论上可以进一步调节TLR 4的动力学。虽然有越来越多的证据表明，不同种类的细菌改变了TLR 4的激活，但活菌系统中的确切原因仍然只是理论性和争论性的。

巨噬细胞是天然免疫系统和宿主防御入侵病原体的关键.它们通过识别、吞噬和参与免疫炎症反应来作出反应.巨噬细胞是一种可塑性细胞，根据形态、功能和观察目的可细分为多种类型。最常见的两种典型的巨噬细胞亚型是促炎经典激活的M1(早期炎症期)和交替激活的溶解/修复性M2(晚期炎症期)。这些终末分化途径最初被命名为模仿当时研究的TH1/TH2范式。7,8,9，可在佛波酯12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)处理的单核细胞中，通过多种因素共同刺激。一般情况下，培养的巨噬细胞与来自大肠杆菌无论是单独或与干扰素γ一起，都会向经典激活的M1表型推进，而与IL-4和IL-13共同刺激则会影响巨噬细胞向M2的极化，这是另一种状态。近年来，这一现象被证明是可逆的和可切换的，进一步证明了巨噬细胞的可塑性。10,11。现在人们更广泛地认识到巨噬细胞涵盖了一系列的表型，尽管m1和M2的总体标准仍然被广泛提及。12。巨噬细胞表达高水平的PRRs，包括TLR 4，并对LPS产生大量的细胞因子和趋化因子作出反应。有趣的是，巨噬细胞极性在慢性疾病的进展和解决中是非常有趣的，因为许多实验疗法包括将这些表型从炎症转移到修复。

越来越多的证据表明，天然来源的多糖有可能成为具有药理作用的免疫调节剂，但关于细菌源性脂多糖的完整报道缺乏描述和广泛的忽视，许多可能具有有益的作用。13。本研究的总体目标是阐明物种特异性LPS识别和随后的诱导炎症通道极化经典和交替激活的巨噬细胞。

试剂

所有试剂都是为其细胞培养能力购买的。未定量检测内毒素水平的产品暴露于HEK293-TLR4报告细胞株，其浓度和时间用于所有检测以筛选是否存在污染。所有产品均按制造商的指示，采用皮尔斯显色剂Lal内毒素定量测定法(Cat No：88282)，检测出内毒素含量低(EU<0.0 1)或无法检测的产品。公司、目录编号和使用的浓度在整个文本中按要求记录。纯化LPS肠沙门氏菌(L 5886-10毫克)，铜绿假单胞菌(L 9143-10毫克)及大肠杆菌O 127：B8(L 3129~10 mg)购自Sigma Aldrich，在无内毒素细胞培养水中重组，通过强涡混合10 min使其均匀均匀。储存在玻璃闪烁瓶中，放置在−80°C处，直至使用。氯喹二磷酸(Cat No：C 6628)和TAKINIB(猫编号：SML 2216)是从Sigma Aldrich购买的，并按照制造商的指南进行了重组。MRT 67307(Cat Ref：inh-MRT)是从Invivgen购买的，并按照制造商的指示进行重组，并储存在−80°C直到使用为止。

内毒素的超纯化

采用Hirschfield等人描述的纯化方法。14，获得了用于进一步实验的超纯LPS。总之，购买的LPS首先在添加0.2%三乙胺(TEA)的无内毒素水中重新悬浮.在溶液中加入脱氧胆酸盐(终浓度为0.5%)，然后立即加入500升饱和水苯酚。样品在冰上孵育5分钟，然后在4°C下离心2分钟，10,000×g。将水(顶)层转移到一个新鲜的管道中，将苯酚(下)相混合，再用1ml的水饱和酚进行萃取。水相调整为75%乙醇和30 mm醋酸钠，在−20°C下沉淀至少1h，在0.2%TEA的初始体积中重新悬浮，并假定100%的回收率。在细胞刺激前，将样品稀释后再放入细胞级水中。

细胞培养

人THP-1单核细胞株按标准培养方案在RPMI中加入10%FCS和1%Pen/Strep。每4天分裂一次，以保持细胞增殖能力，防止细胞过度生长。所有细胞都被保存在37℃的孵化器中，5%的CO2大气层。用50 ng/ml PMA诱导细胞分化为静息(M0)巨噬细胞48 h后，进入经典激活型(M1)或交替型(M2)表型。用50 ng/ml重组干扰素γ(PeproTech cat#300-02)刺激M0静止巨噬细胞24h，可获得M1表型。用25 ng/ml重组人IL-4和IL-13(PeproTech cat#200-04和#200-13)刺激静息的M0巨噬细胞24h，诱导M2巨噬细胞分化。

流式细胞术

用含Fc的FACS洗涤缓冲液(PBS pH 7.2、5%胎牛血清和0.1%叠氮钠)阻断巨噬细胞在冰上5 min的非特异性抗体结合。然后用细胞表面染色抗体CD 14克隆63D3、Biolegend、CA、USA)或TLR 4(Cat#312802克隆HTA 125、Biolegend、CA、USA)或同等浓度的同型与氟载体匹配的对照组(CA，Biolegend，Cat#400111和400257)在冰上培养30分钟，在4°C下保持黑暗，然后将细胞在1毫升FACS洗涤缓冲液中洗涤，并在800×100×C下离心。g在4℃台架离心机上放置3 min，固定在含有0.5%(v/v)福尔马林的FACS洗涤缓冲液中。在使用BD FACS Canto(BD，美国)进行分析之前，细胞要通过100μm的滤器通过FACS管。为研究细胞内/总蛋白的表达，在阻断期后，用渗透流式细胞仪(FACS)洗涤缓冲液(FACS洗涤液加1%w/v皂甙(Sigma，USA))在冰上浸泡30 min，在黑暗中加入抗TLR 4抗体或同类型对照，在冰中孵育30 min。然后按照以前的详细处理单元格。

免疫荧光

1×105THP-1单核细胞分化为静止的M0巨噬细胞的8孔室幻灯片，然后被推进到M1或M2表型如上所述。染色前用4%多聚甲醛固定30 min，2%牛血清白蛋白在PBST(TritonX 100，0.3%)中渗透1h。用纯化的抗人CD 284(TLR 4)抗体(Cat#312802克隆HTA 125，Biolegend，CA，USA)在4°C下过夜100 g/ml，在摇床上冲洗3次，用大鼠抗小鼠二次抗体(100μg/ml)在眼眶板摇床室温下染色2h。细胞被反染色并安装在含有矢量盾的DAPI中(CAT#H-1200，载体实验室，美国)，并安装了一个用于成像的对撞机。由Diane&Irving Kipnes Lymphedema成像套件提供的LeicaSP 8倒置共焦显微镜获得了图像。

qPCR

用QIAGENRNA总清除试剂盒，按照制造商的要求，从给定样品中分离出总RNA。根据制造商的描述，使用EvaGreen RT转换试剂盒在梯度热循环器中转换了100毫微克的RNA(ABMbio，美国)。在ABI StepOnePlus PCR系统中，将转化后的cDNA样品中的1毫微克加入到亮绿SYBR qPCR主混合物中，进行qPCR分析。PCR条件为：95°C为1 min，95°C为40次，30 s为60°C，30 s为72°C，最后一轮为72°C，为10 min。15。使用的引物序列详见表1.

ELISA法

酶联免疫吸附试验(ELISA)根据制造商的指示进行。用ELISA高结合96孔板，在RT下，在推荐稀释的搅拌下，用酶联免疫吸附法(ELISA)将100株一级抗体孵育2h。用0.1%吐温-20的PBST(0.1%吐温-20)冲洗3次，每次冲洗5 min，每次冲洗一次。非特异性结合用200μmol/L的BSA在PBST中用200μmol/L的BSA在相同的轨道摇床上停留1h。然后，在4°C的预包衣和封闭的ELISA平板上加入标准和刺激细胞的条件培养基，必要时予以稀释，4℃时用相同的方式清洗未绑定的产品。将稀释后的二级HRP结合抗体加入盘子中，孵育1h，再去除未结合组分，洗净平板。每口井加入100μl TMB底物，待样品显色后再加入0.1 N HCl停止显影。在405 nm处用SPECTRAMAX平板阅读器读取所有平板，并根据标准曲线测定细胞因子的浓度。

免疫印迹

THP-1单核细胞(1×10)66孔组织培养板已分化为M1巨噬细胞。用NP-40裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂鸡尾酒、氟化钠、原代戊酸钠、TritonX-100)对细胞进行刺激。然后对样品进行超声处理，以确保蛋白质完全溶解和解离，并在12,000×g在4°C作用10 min后，用Pierce BCA法确定蛋白浓度并将其归一化，并将10g蛋白加载到每口井中。样品用4-20%SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶(Biorad，USA)在120 V温度下分离90 min，直至梯子按要求解离。然后将样品转移到硝化棉膜上，用Ponceau红染色证实了转移效率。所有膜在5%BSATBST(0.1%吐温-20)中阻断2h，用TBST洗涤后，按厂家指示(3%BSATBST：1：1000)O/N，4°C洗涤3次，再用HRP-结合二次抗体(TBST：1：5000)在RT上检测1小时。最后用TBST冲洗三次，用新制备的鲁米诺检测液显影，并立即成像。

图解设计

使用BioRender.com创建了图形描述。

统计方法

数据表示为平均值(SEM)的平均±1标准误差。实验以最小一式三份的形式进行。对参数数据采用双尾非配对t检验，对非参数数据进行Man-Whitney检验。使用单向Anova进行多项分析。临时在指示的地方进行图基测试。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000115.

分化的经典激活的m1巨噬细胞表现出TLR 4的内化。

髓系细胞，如巨噬细胞，已知表达高水平的TLR 4，因为这些先天免疫细胞能够通过产生大量的趋化和炎症介质迅速对感染作出反应。首先，我们首先通过qPCR、流式细胞术和免疫荧光共聚焦图像分析，对M1和M2分化的THP-1巨噬细胞中TLR 4的定位和表达进行了研究。首先，对几个特征良好的M1和M2标记(CXCL 10、CCR 7、IL-12、CD 206、CD 163和CCL 17)的分析证实了静止表型(图1)。1a)16,19。流式细胞仪显示TLR 4在M1巨噬细胞中的主要表达为胞内表达(68.08±3.17%)。1M2主要表达于细胞表面(75.99±8.75%)。1d)。这是通过表面染色和总染色的比较，通过皂甙的渗透作用来确定的。同样的巨噬细胞的免疫荧光显像进一步证实了TLR 4在M1巨噬细胞中的点状分布(图1)。1而M0和M2巨噬细胞在细胞质中分布均匀(图一)。1EI，III)。

物种特异性LPS对M_1和M_2巨噬细胞因子产生的影响

考虑到TLR 4在巨噬细胞极化背景下定位的差异，我们用三种常见的革兰氏阴性共生菌LPS攻击M0、M1和M2巨噬细胞，但也有已知的机会致病菌；大肠杆菌(O 127：B8)肠球菌(血清型Typhimurium)和铜绿假单胞菌(血清型10.22)。根据我们先前的工作，概述了细胞区分LPS血清型的能力，我们推测共生细菌及其相关的LPS可以以不同的方式刺激TLR 4。20.

我们在此报告，诱导炎症介质：IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α，是通过对这些巨噬细胞的LPS的刺激而发生显著改变的。铜绿假单胞菌，大肠杆菌或肠球菌(无花果)2a)。

肠球菌LPS刺激内小体内的TLR4-IRF 3

通过TLR 4在M_1巨噬细胞胞内区的存在(图1)。1)，我们假设细胞内病原体对LPS的反应，例如肠球菌和/或大肠杆菌可能是通过一个内胚体依赖的途径来定向的。为了研究TLR 4是否被内小体酸化激活，我们用羟基氯喹预防TLR 4的发生。P65的下游磷酸化表明大肠杆菌和肠球菌有限合伙人，但不是铜绿假单胞菌，通过内小体室发出信号(如图所示)。3a)。只大肠杆菌和肠球菌LPS诱导：IP-10合成，经羟基氯喹处理后有明显的烧蚀作用(图1)。3b)。用ELISA法检测所有LPS诱导的肿瘤坏死因子α、IL-6和IL-8的产生.这种生产大大减少了大肠杆菌和肠球菌LPS通过添加羟基氯喹刺激细胞，提示TNFα、IL-6和IL-8的产生是由IRF 3驱动的(如图3所示)。3(c-E)。衍生自铜绿假单胞菌以规范的方式只激活p65磷酸化，因此在所有测试参数中不受羟基氯喹处理的影响。这些数据表明大肠杆菌和肠球菌LPs可以激活内质结合或内质内转运的TLR 4，诱导irf 3驱动的炎症反应，而铜绿假单胞菌LPS信号通过细胞表面TLR 4驱动的反应，独立于内小体。

LPS在M1巨噬细胞中的偏置信号是TAK 1和TBK 1依赖性的

虽然我们不能在此回答，一个纯化的产品，如LPS，是否有额外的处理，由内小体允许它的功能活跃，我们可以说，它的激活是重要的，在TLR4-LPS的识别。TLR 4被不同种类的LPS激活的途径是下一个问题。因此，我们的研究重点是M1巨噬细胞，这是由于TLR 4的分裂现象和通过内小体区分LPS信号的能力(图1)。2)。为了进一步阐明TLR 4信号是否个别偏向细菌LPS，我们利用药理干预手段改变TLR特异性细胞内信号蛋白丝裂原活化蛋白激酶7(MAPK 7，又称TAK 1)和坦克结合激酶1(TBK 1)。TAKANIB和MRT 67307已被证实以高度选择性和控制性的方式阻止这些激酶的激活，因此我们试图使用这些药物分别区分TLR 4的激活途径和p65或IRF 3的最终磷酸化。21,22.

LPS诱导p65和IRF 3磷酸化治疗经典激活的M1巨噬细胞(图5.4a)。有趣的是，与我们之前的数据一致，所有的LPS都诱导了p65磷酸化(如图所示)。4IRF 3磷酸化仅由大肠杆菌和肠球菌(无花果)4(全部)。TAK 1和TBK 1的抑制作用表现出明显的偏倚途径。铜绿假单胞菌LPs通过TAK 1和TBK 1诱导p65磷酸化，大肠杆菌和肠球菌然而，只有通过TAK 1信号导致p65磷酸化，并通过TBK 1专门用于IRF 3磷酸化。从图中得到的数据。3，我们还可以推测，tbk 1-irf 3轴可能是通过tLR 4的内小体激活而介导的。大肠杆菌和肠球菌LPS刺激细胞(图示：图。4b)。

与tlr超家族的其他成员不同，TLR 4是目前已知的唯一能够在配体结合后触发myd 88依赖和独立通路的受体成员。23。依赖于MyD 88的信号主要在NF-κB的激活中达到顶峰，NF-B作为一种强有力的炎症诱导剂，而MyD 88非依赖性通路主要激活IRF 3调控基因，促进抗病毒型干扰素。TLR 4通过这些机制中的每一种机制发出信号的能力被许多人看作是一种人造产物，几乎没有证据表明这是为什么会发生的配体的确切原因，但意识到它的必要性。24。我们的结果首先证明了myd 88依赖的和独立的途径之间的偏倚信号可以解释对特定物种的LPS，特别是来自细胞内病原体的lps的反应的差异，例如肠球菌在较小程度上大肠杆菌。其次，利用分化的THP-1人巨噬细胞，我们的发现表明极化导致TLR 4在细胞上和细胞内的差异表达和定位，从而允许对信号进行物理鉴别。特别是，我们证明m1巨噬细胞(经典活化的炎性巨噬细胞)在分化后的胞内间隔内表达TLR 4，这些受体被证实是通过一种内胚体机制来激活的。肠球菌LP导致一个与MyD 88无关的IRF 3级联。第三，我们建立了物种特异性LPS对M1和M2巨噬细胞内TLR 4的差异激活对基因转录以及细胞因子和趋化因子产生的影响。此时，我们认识到，在这些细胞内使用人工极化系统，如PMA-分化，可能并不代表信号通路的真正范围。例如，IL-1β通常需要一个两步的、caspase-1依赖的信号系统来进行分裂和分泌.然而，有文献表明，如果脂多糖污染了细胞质室，非典型的炎症小体(caspase 4/5)可以切割IL-1β，这可能意味着分化的m0和m1巨噬细胞具有更高的吞噬能力。25.

由于TLR 4-配体的多样性，包括微生物相关分子模式，如LPS，在宿主内识别革兰氏阴性菌之间的变异范围可能有很大的不同。这些结构变异在感染和疾病进展过程中的后果目前正被许多团体广泛地研究，并取得了有趣的结果，然而，仍然缺乏明确的共识。26,27。研究这些不同的结构在感染和自身免疫性炎症中所起的作用是一个很有科学意义的领域，TLRs也是感染和疾病期间干预的治疗目标。28。很明显，TLRs可以以一种剂量依赖的方式对配体产生反应，但是有能力区分在单个病原体上发现的不同结构单元确实是一项宏伟的进化设计。

总体而言，LPS等外源分子通过识别细胞表面受体(如TLR 4)进入细胞，激活下游细胞内反应。细胞表面受体的内吞作用是巨噬细胞用于吞噬细菌或微粒以进行溶酶体破坏的特征；或在某些情况下内化，以提交给细胞内受体。29。利用这一途径，先天免疫细胞，如巨噬细胞，可以内化微生物的产品，并允许呈现给细胞内受体进行交替的通路激活。TLR 4通过一种与myd 88无关的机制，而不是经典的myd 88依赖的途径，进行内化和信号传递。4。然而，我们的发现表明，经典激活的m1巨噬细胞内化表达tLR 4对不同形式的lps是有区别的，例如大肠杆菌-, 肠球菌-和铜绿假单胞菌-来源的LPS得到承认，并据此采取行动。

我们已经评估并概述了一个假设，即那些接触高度PAMP/潮湿的丰富环境的炎症性巨噬细胞，将他们的TLR4s内化，作为降低他们对周围环境的敏感性的一种机制。然而，如果它们被致病性细胞内细菌感染，如肠球菌(S.enterica)另外，活化的M2巨噬细胞在修复期有利于TLR 4在细胞表面的表达，这可能是为了探测剩余的微生物和损伤产物，以促进伤口愈合所需的细胞因子。来自不同细菌的lps可以激活人脑胶质瘤细胞和小鼠巨噬细胞中不同的myd 88依赖和不依赖的通路，尽管对这种识别能力还没有完全了解。24,30。与我们的研究相似，这两篇论文都证明了myd 88不依赖于tLR 4的激活。肠球菌(S.enterica)有趣的是，这种鉴别能力可以被调整和发展，以一种受控的方式耗尽和/或调节TLR 4-信号通路，从而消除NF-κB和/或irf信号，以便更好地研究刺激对治疗研究的总体影响。31.

从无偏倚的NF-κB/IRF 3到更多的抗炎IRF 3级联，lps-TLR 4信号的平衡是调节对LPS耐受性的一个已知特征。32。这种平衡转变在慢性疾病(如炎症性肠病、肌萎缩侧索硬化症、肝病或风湿病)中的作用仍然知之甚少，但为今后的研究开辟了一条途径，特别是在已知涉及细菌产品和/或NF-κB/IRF 3信号的疾病中。15,33,34,35。在不断扩大的微生物群及其参与疾病进展的领域中，我们推测这种区分能力可能在某些病人群和感染中失效。总之，我们的数据显示细胞因子分化的巨噬细胞能够以一种依赖配体的方式区分和响应特定物种的LPS。我们展示了这些细胞对LPS的偏见和无偏信号，以及巨噬细胞的极性如何改变它们的检测能力。肠球菌通过TLR 4的再分布。值得注意的是，这些差异可以进一步看出，下游信号可以分为TAK 1依赖和TBK 1依赖机制。有了这些发现，我们希望能够更清楚地研究细菌与宿主之间的相互作用在内毒素信号方面的作用。