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去甲基化酶抑制剂GSK-J4通过促进树突状细胞重新合成维甲酸来抑制炎症性结肠炎

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发表时间:2021-01-15 10:57作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

树突状细胞(Dendriticcells,DC)促进T细胞对自身抗原的耐受,诱导对无害抗原的炎症反应.这种双重潜力使DC成为炎症性疾病的基本参与者。炎症性结肠炎小鼠模型和炎症性肠病(IBD)患者的证据表明,IBD的肠道炎症主要由T-助手-1(Th1)和Th17细胞驱动,提示DC在IBD的发展中起着重要作用。本研究表明,组蛋白去甲基化酶JMJ3/UTX的选择性抑制剂GSK-J4可通过降低DC的炎症潜能和增加其耐受性特征来减轻炎症性结肠炎。机理分析表明,GSK-J4增加了表观遗传信号的激活,降低了树突状细胞视黄醛脱氢酶亚型1和3启动子的抑制标记,促进了维甲酸的产生。这反过来又会对调节性T细胞(Treg)产生影响,增加他们的谱系稳定性和肠向性,并增强他们的抑制活动。我们的结果为IBD患者的治疗开辟了新的途径。

导言

为了避免在没有威胁的情况下发生炎症反应,必须通过获得一种具有抑制功能的表型(即调节性T细胞;Treg)来消除对自身或外来无害抗原反应的T细胞,这是树突状细胞(DC)发挥基本作用的过程。事实上,树突状细胞的本构性耗竭导致自发性致死性自身免疫1。相反,在炎症和自身免疫紊乱的发病过程中,树突状细胞似乎是诱导T细胞对无害抗原反应的炎症表型的关键。2。树突状细胞促进耐受或诱导对无害抗原的炎症的双重潜力使这些细胞在炎症性疾病的生理病理过程中起着重要的作用。

肠粘膜是主动诱导免疫耐受的主要组织之一,例如来自食物和共生微生物的免疫耐受。因此,肠黏膜耐受机制的失效导致了炎症性肠病(IBD)的发生,IBD是一组慢性消化道炎症性疾病,其中克罗恩病和溃疡性结肠炎最为常见。来自炎症性结肠炎小鼠模型和IBD患者的证据表明,IBD的肠道炎症主要由T-助手-1(Th1)和Th17细胞驱动。3从而提示了发展中国家在IBD发展中的重要作用。

克鲁登尼尔等人证明选择性组蛋白去甲基化酶抑制剂gsk-j4能抑制巨噬细胞产生促炎细胞因子。4。事实上,最近发现GSK-j4抑制巨噬细胞中nlrp 3炎性小体的活化,从而减弱炎症性结肠炎小鼠固有免疫介导的炎症反应。5。尽管如此,我们最近发现GSK-j4在dc中诱导了一种耐受性表型,增加了Treg的产生和潜能,从而减弱了中枢神经系统中自身免疫的表现。6。因此,我们研究了这种药物的治疗作用如何依赖于炎症性结肠炎小鼠模型中的DC。

结果

组蛋白脱甲基酶JMJD 3/UTX的选择性抑制改善炎症性结肠炎的表现

为了评价GSK-J4的治疗潜力,我们采用小鼠模型,采用右旋糖酐硫酸钠(DSS;图1)诱导的炎症性结肠炎模型。1a)。重要的是,GSK-J4的治疗降低了DSS治疗小鼠的体重和发病率。1b、c)。疾病表现的减轻与肠道炎症的减少有关,这是由结肠缩短的衰减所决定的(如图所示)。1(D)减少炎症细胞因子IL-6和IL-17的产生,而不影响肠黏膜中TNF-α和IFN-γ的产生(图一)。1(E),建议选择性地抑制Th17反应。评价该药的治疗效果是否与CD4的炎症和抑制性亚群的频率变化有关。+T细胞经GSK-J4或载体处理后,在饮水中给予DSS诱导结肠炎。在发病高峰期(诱导后第12天),我们从结肠固有层(Clp)、肠系膜淋巴结(Mln)和脾脏中分离出单个核细胞,并对CD4的功能表型进行了分析。+T细胞。而GSK-J4对浸润CLP的Treg和Th1频率没有影响,我们观察到该药物明显降低了肠粘膜中Th17的频率(图一)。S1a-C)。因为Treg产生的IL-10是维持耐受性,特别是肠组织耐受性的基础。7我们还分析了IL-10产生CD4的频率。+中电中的T细胞。结果表明,全身性GSK-j4增强了白细胞介素-10(IL-10)产生CD4的频率。+在不影响CD4产生IL-10的情况下,CLP中的T细胞+来自MLN和脾脏的T细胞(图)。S1D)。有趣的是,Foxp 3在IL-10中的表达分析+CD4+T细胞显示,系统的GSK-j4增加了Foxp 3的频率。伊-10+CD4+T细胞(类似TR1抑制性淋巴细胞的表型)8),但不是Foxp 3+伊-10+CD4+T细胞(图1.S1E,F)。因此,这些结果提示,全身性GSK-J4给药增加了TR1细胞的频率,减轻了肠道炎症时结肠粘膜中Th17的反应。为了深入了解GSK-J4在T细胞产生IL-10中的作用机制,我们进行了类似的实验,但在早期(诱导后第8天)分析了T细胞的功能表型。尽管我们观察到结肠Foxp 3增加IL-10产量的趋势+Treg细胞经GSK-J4处理后,与对照组相比,任何T细胞表型均无显着性差异(图二)。S2A,B)。同样,在诱导结肠炎后第8天,我们也没有观察到GSK-J4处理的小鼠结肠粘膜分泌炎症或抗炎细胞因子与对照组相比有任何差异(图1)。S3)。这些结果提示,在炎症性结肠炎中观察到的GSK-J4的治疗效果包括T细胞在肠道粘膜疾病表现高峰期增加IL-10的产生。

图1

GSK-J4治疗改善DSS诱导的急性结肠炎。用1.5%DSS诱导C57BL/6小鼠结肠炎。每日1 mg/kg,每日1 mg/kg,5天,开始DSS治疗。(A)说明了实验设计的方案。(B)体重变化与初始体重的关系是在疾病发展的整个过程中计算出来的。(C)在整个疾病发展过程中的临床评分。(D)各组于结肠炎诱导后第14天测定结肠长度。(BD)值表示18-22的平均值±扫描电镜。B,C)或11-12(D)每组小鼠。(E在疾病严重程度高峰(第12天),处死小鼠,在新鲜培养基中培养24h,检测培养上清液中IL-17、IL-6、肿瘤坏死因子(α)、干扰素(IFN-γ)的分泌情况。每组5~9只小鼠,平均值为±SEM。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ***p < 0.0001 as determined by Student’s t-test (B,C,E)或单向方差分析,然后是图基的后特别测试(D)。注:无显着性差异。

由于DSS诱导的结肠炎模型依赖于天然免疫和适应性免疫,我们接下来的目的是分析GSK-J4在缺乏适应性免疫的情况下对肠道炎症的治疗作用。为此,我们利用了缺乏的动物芦苇1基因,编码重组激活基因1,这是T和B淋巴细胞发育的一种酶基础。有趣的是,虽然我们没有观察到两组在结肠粘膜中产生炎症或抗炎细胞因子的差异,但系统给药葛兰素激酶-j4可显著减轻小鼠的体重。芦苇1−/−小鼠对DSS引起的炎症性结肠炎(图一)。S4)。这些结果表明,药物的治疗效果,至少在一定程度上,依赖于先天免疫。由于先前的研究表明gsk-j4可以减少巨噬细胞的炎症反应。4,5下一步,我们试图证实GSK-J4在巨噬细胞中的抗炎作用。与以往的研究相一致,我们观察到系统性的GSK-J4给药可导致巨噬细胞减少巨噬细胞产生肿瘤坏死因子(α)。S5)。先天性淋巴样细胞(ILCs)大量存在于肠粘膜中,在肠粘膜中起着调节肠内稳态的重要作用。9。因此,我们还确定了GSK-J4对这一部分先天细胞在DSS诱导的肠道炎症中的作用。我们的结果表明,全身注射GSK-J4可选择性地降低结肠粘膜中ILCs的频率,而不降低小肠固有层中ILCs的频率(如图所示)。S6A,B)。有趣的是,这种效应并不是由于ILCs对IFN-γ或IL-10产生的改变所致(如图所示)。S6B)。总之,这些结果表明,全身注射GSK-J4所产生的治疗效果,至少在一定程度上是由于对天然免疫系统具有抗炎作用。然而,GSK-J4在肠道炎症适应性免疫中的潜在作用仍未得到充分的探索。

组蛋白脱甲基酶JMJD 3/UTX在DC体内的选择性抑制减轻炎症性结肠炎的严重程度

因为我们以前发现gsk-j4通过产生具有较高抑制活性的Treg来增加dc的耐受性功能。6我们想知道这种药物是否在肠道炎症的情况下对DC有直接作用。为了解决这一可能性,我们接下来进行了实验,让接受结肠炎的小鼠接受GSK-J4体内外处理的DC的静脉转移(如图所示)。2a)。结果表明,接受GSK-J4处理的DC转移小鼠与未接受DC治疗的小鼠相比,其炎症性结肠炎的表现减弱,这是由体重减轻和结肠长度缩短所决定的。2b、c)。此外,我们观察到Th1和Th17炎性CD4的频率降低。+接受GSK-J4处理的DC的小鼠,其T细胞亚群和Treg在CLP和MLN中的百分比高于未接受DC治疗的动物(图1)。2(d-F)有趣的是,尽管用gsk-j4系统治疗小鼠增加了产生IL-10的CD4的频率。+T细胞在CLP中不影响Treg浸润CLP的百分比(图)。沙一)接受gsk-j4处理的dc小鼠出现较高比例的Treg,而对产生IL-10的CD4的频率没有影响。+中电T细胞(图1)。2F、g)。这种差异可能是由于全身GSK-J4对天然免疫细胞的作用,当DC与药物体外孵育后转移到DSS治疗的小鼠时,这种作用是避免的。

图2

GSK-J4体外处理DCS可改善DSS诱导的急性结肠炎.骨髓来源DCCd45.1+/+ Cd45.2−/−小鼠经车(对照组)或25 nmgsk-j4处理18h后,再用3×10。6DCS/小鼠腹腔注射。转野生型Cd45.1−/− Cd45.2+/+接受者老鼠。用1.5%DSS处理6天后,立即诱导受体小鼠结肠炎。(A)说明了实验设计的方案。(B)体重变化与初始体重的关系是在整个疾病过程中计算出来的。每组4~10只小鼠的平均±扫描电镜值。(C)各组于诱导结肠炎后第9天测定结肠长度。每组8~10只小鼠的平均±扫描电镜值。(B,C)作为对照组,一组小鼠不接受DSS治疗。(DG在疾病严重程度高峰(第9天),处死小鼠,从脾脏、肠系膜和结肠中分离出单个核细胞,然后在Bbrefeldin A存在下用PMA/ionomycin体外刺激,流式细胞仪进行细胞内细胞因子染色分析。频率(D)干扰素γ+, (E)IL-17A+, (F)Foxp 3+,和(G)IL-10+CD4细胞+从脾脏、肠系膜和结肠中分离出T细胞。每组5只小鼠的平均值为±SEM。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 as determined by one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test (B,C)或双向方差,然后是Bonferroni的后特别测试(DG)。注:无显着性差异。

根据GSK-J4在炎症性结肠炎背景下对树突状细胞的显著抗炎作用,进一步探讨其作用机制。重要的是,维甲酸(RA)在肠道相关淋巴组织中尤其丰富,对诱导Treg分化和产生IL-10有很强的作用。10。此外,与其他来源的树突状细胞不同,来自谷丙转氨酶表达的维甲酸脱氢酶(RALDH)的DC。11,这使得这些细胞可以利用食物中含有的维生素A作为底物合成RA。12。GALT-DC通过产生RA诱导肠归巢受体CCR 9和α4β7在活化的CD4中上调。+T细胞,印在这些细胞中的肠向性13。因此,在没有炎症信号的情况下,galt-dc将抗原呈现给天真的CD4。+在mln中的T细胞诱导抗原特异性分化,使这些天真的T细胞向具有肠向性的Treg细胞分化,从而促进口腔耐受性。14。由于RA能改善DC对肠道组织的取向,我们首先假设GSK-J4也可能改善DC对谷丙转氨酶(GALT)的趋向性。因此,我们分析了GSK-J4体外处理对炎症性结肠炎小鼠不同组织DC浸润程度的影响。结果表明,GSK-J4对DSS小鼠脾、MLN和CLP的浸润无明显影响。S7),从而排除了该药物的抗炎作用可能是由于树突状细胞在谷丙转氨酶中的浸润增加所致。

组蛋白去甲基化酶JMJD 3/UTX在DC中的选择性抑制通过增强H3K4me3标记和降低H3K27me3对这些细胞RALDH的表达和活性的影响拉尔夫1Raldh3启动子

接下来,我们分析了gsk-j4是否对galt-dc产生RA有影响,从而通过CD4增加IL-10。+T细胞这些分析表明,GSK-J4处理确实促进了MLN树突状细胞RALDH-活性的显著增加。结果还提示,GSK-J4治疗后,对CLP浸润的DC有较高的RALDH活性(图1)。3A、B)。值得注意的是,在dss诱导的结肠炎高峰(第12天)观察到了这一效应,但没有在较早的时间点(第8天;图)观察到。S2C,D)。在无炎症刺激或有炎症刺激的情况下,从MLN或脾中分离出并经GSK-J4体外处理的DC中,RALDH-活性也有类似的增强作用(图1)。4A、B)。由于RALDH有三种亚型,在某些细胞类型中表现出明显的底物亲合性和差异表达。15,16,17进一步分析GSK-J4对DC不同RALDH亚型表达的影响,并与RA的直接作用进行比较。有趣的是,我们的结果表明拉尔夫1Raldh3转录,虽然它有一个星期的影响,在水平Raldh2成绩单。相反,RA的作用仅限于Raldh2转录(图1.3c)。在LPS存在的情况下,也观察到类似的结果(见图)。4c)。综上所述,这些结果表明GSK-J4和RA在促进DC耐受性潜能方面具有互补作用。

图3

GSK-J4通过富集标记H3K4me3和降低h3k27me3对树突状细胞的RALDH活性和表达的影响。拉尔夫1Raldh3推动者。(A)在第12天从小鼠结肠固有层(结肠)和肠系膜(MLN)分离的DC中,用Aldefluor法测定RALDH活性的代表点图,如图所示。1数字代表相应象限中细胞的频率。(B)Aldefluor的频率+CD11c+每组至少有6只动物的细胞。(C,D)脾CD11c+用25 NMGSK-J4或10 NMRA治疗C57BL/6小鼠DCS 16h。C)RT-qPCR分析拉尔夫1(顶部面板)Raldh2(中间板),及Raldh3(下面板)在DC上进行表达。以18S RNA为对照,实现相对表达水平的规范化。(D在GSK-J4存在或未加GSK-J4的情况下,用100 ng/mL LPS刺激DC 16h,用H3K4me3(顶板)、H3K27me3(下板)特异性抗体进行染色质免疫沉淀(芯片)检测。H3K27me3或H3K4me3与拉尔夫1(左面板)Raldh2(中间的小组),以及Raldh3(右面板)用特异性引物qPCR定量。PCR产物归一化为输入DNA和组蛋白H3水平。该值代表6个独立实验的平均值±扫描电镜。*p < 0.05; **p < 0.01, ***p < 0.001 as determined by Student’s t-test (B)或单向方差分析,然后是图基的后特别测试(C,D)。注:无显着性差异。

图4

GSK-J4能促进脾或多克隆树突状细胞中RALDH的活性。(a-B)CD11c+DCS是从mln中分离出来的(A)和脾脏(B)在25 NM、GSK-J4或10 NM RA存在或不存在的情况下,用100 ng/mL LPS刺激或未刺激16h。顶面板显示有代表性的RALDH活性点点。数字表示相应象限中细胞的频率。底部面板显示Aldefluor的频率。+CD11c细胞+门是从至少六个独立实验中得到的。(C)脾CD11c+用100 ng/mL LPS刺激c57bl/6小鼠的dcs,在25 nmgsk-j4存在或不存在时,用rt-qPCR分析。拉尔夫1(左面板)Raldh2(中间板),及Raldh3(右面板)在DC上进行表达。以18S RNA为对照,实现相对表达水平的规范化。数据代表6个独立实验的平均值±扫描电镜。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 as determined by one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test (AC)。注:无显着性差异。

因为gsk-j4是已知的组蛋白h3赖氨酸脱甲基酶jmjd 3的特异性抑制剂。18的不同启动子中组蛋白甲基化水平的影响。拉尔德在发展中国家。为此,我们测定了组蛋白h3在赖氨酸4(H3k4me3)和赖氨酸27(H3k27me3)的三甲基化程度。19。与GSK-J4诱导转录的选择性作用一致拉尔夫1Raldh3,这种药物对DC的治疗增加了h3k4me3启动子中允许标记的程度。拉尔夫1Raldh3,但对Raldh2启动子(如图所示)3d)。相反,gsk-j4大大降低了h3k27me3启动子中抑制标记h3k27me3的水平。拉尔夫1Raldh3,对Raldh2启动子(如图所示)3d)。因此,这些结果揭示了gsk-j4通过在表观遗传修饰水平上对dc产生耐受性行为而产生的分子机制。拉尔夫1Raldh3推动者。

组蛋白脱甲基酶JMJD 3/UTX的选择性抑制促进DC对RA的重新合成

由于我们的结果表明RA和GSK-J4在促进DC的耐受性潜力方面起着互补的作用,因此我们接下来评估GSK-J4是否能够增强RA在肠向分化中的作用。为此,用gsk-j4、RA或两者共同处理的DC与天真的CD4共培养。+测定T细胞、肠向性的获取和Treg-表型.Ra可增加Treg分化的程度(图1)。5A,B),如前所述20。类似地,GSK-J4促进Treg的产生,实际上,我们观察到RA和GSK-J4在获得Treg-表型时都有加性效应(图1)。5A、B)。如出一辙,RA增强了肠归巢受体α4β7和CCR 9的表达。5C、D)21。当天真的T细胞与GSK-J4共同孵育时,也发现了类似的增加,这可能是由于DC在药物影响下产生RA的结果。RA联合GSK-J4对肠道归巢受体的表达有轻微但明显的加性效应(图一)。5c,D)。重要的是,我们观察到GSK-J4对树突状细胞诱导的Treg分化程度依赖于RA受体(RAR)的刺激,因为RAR-拮抗剂(LE135)对DC的预处理可以消除GSK-J4对Treg生成的影响(见图)。S8).

图5

GSK-J4促进DC对RA的合成。天真CD4+CD 25Foxp 3T细胞Foxp 3绿色荧光蛋白在标准的Treg极化条件下(IL-2),或在25 NM GSK-J4、10 NM RA或两者同时存在下,用脾DC和抗CD3 Ab对小鼠进行细胞分选和激活。(A,B)以绿色荧光蛋白的频率来评价iTreg产生的程度。+(Foxp 3)+)CD4中的细胞+人口。(A)代表点-阴谋和(B)给出了量化结果。(C,D)检测CD4细胞中CCR 9和α4β7的表达。+T细胞(C)代表点-阴谋和(D)给出了量化结果。数据代表6个独立实验的平均值±扫描电镜。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001 as determined by one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test (AC)。注:无显着性差异。

为了评估gsk-j4也可能直接影响有利于肠向性和获得Treg-表型的T细胞,我们激活了天真的CD4。+T细胞在Treg极化条件下,在不存在DC的情况下,具有抗CD3和抗CD 28抗体(Abs)。在这些条件下产生的Treg然后用GSK-J4、RA或两者共同处理.这些结果表明,无论是RA还是GSK-J4单独或联合作用,都能显著提高Treg的发生。中9)。这些结果与Mucida和他的同事之前的研究结果不同。22。我们结果的不同可能是由于我们的iTreg标准极化条件不仅包括转化生长因子-β和IL-2,还包括抗IL-4和抗IFN-γ抗体,而Mucida和他的同事只使用TGF-β和IL-2。由于这里使用的iTreg极化条件更严格,我们在基本的标准条件下观察到了≈50%的iTreg转换(图1)。中9)我们没有观察到RA或GSK-J4治疗后进一步增加。另一方面,在缺乏DC的情况下,只有RA,而不是GSK-J4诱导肠归巢受体的表达。此外,GSK-J4对增强RA在T细胞肠向性印迹中的作用没有影响(图1)。中9)。因此,这些结果排除了GSK-J4对T细胞的直接作用,从而增强了GSK-J4的抗炎作用是由于对DC的直接作用促进了这些细胞的耐受性行为。

GSK-j4增强Treg对肠道炎症的抑制作用和谱系稳定性。

为了评估GSK-J4是否对Treg功能有影响,我们接下来分析了该药物存在下产生的Treg抑制活性。为此,在GSK-J4处理或不处理DC的情况下,对Treg进行分化,确定其抑制作用为抑制效应T细胞增殖的能力。结果表明,在GSK-J4存在下产生的Treg表现出较高的抑制活性(图1)。6A、B)。为了确定这种效应在肠道炎症中的相关性,我们接下来在GSK-J4或载体存在下生成Treg,然后进行i.v。转移到先前由DSS诱导炎症性结肠炎的受体小鼠。结果表明,接受GSK-J4产生的Treg的小鼠,其疾病表现不如在没有药物的情况下接受Treg转移的小鼠严重(图一)。6c)。因此,这些结果表明,在GSK-J4存在下产生的Treg在体内具有更强的抑制作用,从而减轻肠道炎症。

图6

GSK-J4暴露于DCS能产生抑制活性较高的Treg。天真CD4+CD 25Foxp 3T细胞Foxp 3绿色荧光蛋白在标准Treg极化条件下,用脾DC和抗CD3 Ab对小鼠进行细胞分选和活化,在无(对照)或存在GSK-J4-25NM的情况下。培养5天后,绿色荧光蛋白+用细胞分离器纯化Treg细胞,并对其体外抑制活性进行分析。A,B)和体内(C). (A,B)效应分子CD4+CD 25用5μMCTV负载T细胞,在不同的Teff:Treg比下,用DC和抗CD3抗体激活T细胞。3天后,流式细胞术将Teff增殖定量为CTV相关荧光的稀释度。作为测定Teff最大增殖的对照组,Teff在不存在Treg(不含Treg)的情况下被激活。(A)显示了CTV稀释曲线的代表性直方图。标记显示Teff呈CTV稀释(左标记),Teff无CTV稀释(右标记)。每个标记所覆盖的细胞的百分比被指示。(B)将抑制程度量化为Teff增殖抑制率与最大增殖百分率(不含Treg)。数据代表三个独立实验的平均值±扫描电镜。(C)Treg是i.v.移交(7.5×10)5(每只小鼠细胞)转化为WT受体小鼠,8天内同时接受1.5%DSS。体重变化与初始体重的关系是在疾病发展的整个过程中计算出来的.数据表示每组4只小鼠的平均±扫描电镜。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 when Treg and Treg + GSK-J4 groups are compared as determined by Student’s t-test (B,C).

一些研究表明,Treg可能在包括肠道炎症在内的炎症条件下转分化为Th17炎症表型。23,24。因为我们之前已经证明了用gsk-j4生成的Treg表现出一个降低的表型可塑性。6我们想知道GSK-J4是否影响炎症性结肠炎的Treg稳定性。作为第一种方法,我们在GSK-J4存在下生成Treg,或者仅仅是车辆,然后他们在体外暴露于Th17偏倚的条件下。结果表明,在药物存在下产生的Treg维持了较高程度的Foxp 3表达。7A,B)并获得较低的产生IL-17A的能力(如图所示)。7A,C),表现出较高的表型稳定性和较低的可塑性。作为处理GSK-J4对Treg稳定性影响的第二种途径,在GSK-J4或载体存在下体外产生Treg,然后转入DSS处理的小鼠体内。10天后,对受体小鼠的MLN和脾脏中转移Treg的表型进行分析。结果表明,在GSK-J4存在下产生Treg时,这些细胞在脾脏和MLN中均保持较高程度的Foxp 3表达。7d、E)。相反,GSK-J4导致肠道炎症下Th17表型的获得减少(图1)。7D、f)。总之,这些结果表明,在GSK-J4处理的DC存在下产生的Treg具有更高的谱系稳定性。

图7

暴露在GSK-J4中的DCS产生的Treg具有更高的谱系稳定性。天真CD4+CD 25Foxp 3T细胞Foxp 3绿色荧光蛋白Cd45.1+/+ Cd45.2−/−在标准Treg极化条件下,用脾DC和抗CD3 Ab对小鼠进行细胞分选和活化,在无(对照)或存在GSK-J4-25NM的情况下。培养5天后,绿色荧光蛋白+CD4+细胞分离纯化Treg细胞。(AC)Treg在Th17条件下孵育5天,流式细胞仪检测Foxp 3和IL-17A的表达水平。(A在Th17偏颇的条件下,在(顶部面板)或之后(底部面板)孵化之前或之后的代表点--Treg图。点状图上的数字表示每个象限中单元格的百分比.(BC)Foxp 3的量化+ (B)和IL-17A+ (C)CD4的频率+T细胞群每个符号表示从单个鼠标获得的数据(n=每组4)。平均±扫描电镜显示。(DF)Treg是i.v.移交(7.5×10)5(每只老鼠的细胞)进入WTCd45.1−/−Cd45.2+/+2 4h后给予1.5%DSS 8天的受体小鼠。在结肠炎诱导后第10天,从脾和肠系膜分离细胞,并分析foxp 3和IL-17A在CD4中的表达程度。+CD45.1+流式细胞术检测人群。(D)CD4对CD45.1和Foxp 3对抗IL-17A的典型点图。点状图上的数字表示每个区域或象限中单元格的百分比.红色箭头表示分析过的大门。(e-F)Foxp 3的量化+ (E)和IL-17A+ (F)CD4的频率+CD45.1+人口。每个符号表示从单个鼠标获得的数据(n=每组3-4)。平均±扫描电镜显示。*p < 0.05; **p < 0.01 as determined by Student’s t-test (B,C)或双向方差分析,然后是Sidak的后特别测试(E,F)。注:无显着性差异。

讨论

本研究表明,组蛋白去甲基化酶JMJ3/UTX的选择性抑制剂GSK-J4能抑制DSS诱导的急性结肠炎。力学分析表明,这一效应是由组蛋白翻译后修饰的变化所介导的。拉尔夫1Raldh3树突状细胞中的启动子增强了RALDH的活性,有利于RA的新合成。这反过来又会诱导Treg具有更高的抑制活性和稳定性,以及增强肠向性。

重要的是,我们的结果证实了GSK-J4治疗炎症性肠病的潜力。在这方面,最近的一项研究表明,口服葛兰素激酶-j4能抑制dss诱导的小鼠炎症性结肠炎模型的肠道炎症。5。该研究的机理分析提供了GSK-J4对巨噬细胞作用的证据。作者发现,JMJD 3的抑制作用使核因子-红血球相关因子2(Nrf 2)基因启动子的H3K27甲基化程度降低,从而下调了其在巨噬细胞中的表达。值得注意的是,Nrf 2的表达是激活NLRP 3炎性小体所必需的,因为Nrf 2的敲除抑制了LPS或庆大霉素刺激的巨噬细胞中Nrf 3的活化。5。尽管这项研究提供了证据证明GSK-J4在DSS诱导的炎症性结肠炎过程中对巨噬细胞的相关作用,但我们的发现揭示了GSK-J4治疗活动中的另一个相关机制,这一点以前没有得到重视。在这方面,我们的发现显示gsk-j4对调控的重要作用。拉尔德转录,使树突状细胞对RA的合成显著增加,从而增强了其耐受性活性。

新出现的证据表明,JMJ 3和UTX脱甲基酶不仅参与肠道炎症,而且还参与类风湿关节炎、多发性硬化症、脓毒症、过敏性哮喘和糖尿病等其他炎症性疾病。因此,GSK-J4在不同病理条件下具有抗炎作用。例如,这种药物可以减轻由尘螨引起的气道炎症。25或呼吸道合胞病毒感染26...通过靶向天然免疫细胞,gsk-j4可以减少脓毒症的炎性细胞因子风暴。27,28改善多发性硬化症小鼠中枢神经系统自身免疫功能的形成。6。此外,直接作用于与炎症性疾病有关的靶组织,如关节炎的关节。29或胰腺β-细胞在糖尿病中的作用30,GSK-J4能明显减轻这些疾病动物模型中的炎症反应和疾病表现。同样,GSK-j4治疗对肾细胞UTx活性的抑制也减轻了2型糖尿病小鼠糖尿病肾病所致的肾损害。31。这些研究表明,JMJD 3和UTX脱乙基酶是炎症的主要调节因子。因此,GSK-J4似乎是一种有前景的治疗药物,对广泛的炎症性疾病有有益的作用。

根据GSK-J4的广谱抗炎作用,该药物可能通过作用于不同数量的炎症白细胞而发挥作用。在这方面,gsk-j4在巨噬细胞中的抗炎作用不仅是通过抑制nfr 2基因的表达,进而激活nlrp 3炎症体而产生的。5,同时也通过诱导抗炎微RNA miR-146 a的表达。27。另一方面,抑制中性粒细胞中的jmjd 3脱乙基酶可降低膜蛋白酶3的表达,而膜蛋白酶3的表达对IL-1β的产生至关重要,从而减弱了它们的炎症活性。28。此外,gsk-j4治疗可显著减少促炎细胞因子的产生,并降低IL-15刺激的人原代NK细胞杀伤细胞毒性所需的机制的表达。32。有趣的是,基因JMJD 3缺乏或GSK-4介导的JMJD 3活性的药理抑制对CD4有直接影响。+T细胞分化抑制Th17表型的获得33。此外,gsk-j4通过作用于树突状细胞,抑制促炎细胞因子的产生,增加抗炎介质的分泌,从而减少炎症淋巴细胞Th1和Th17的参与,促进实验性自身免疫性脑脊髓炎中Treg细胞的产生。6。除了后一种GSK-J4效应外,我们在本研究中提供了一个更深入的机制洞察,表明该药物对树突状细胞产生RA有很强的促进作用,诱导这些细胞从免疫原性向耐受性转变。

重要的是,Mucida和他的同事曾证明RA对天真的CD4有影响。+T细胞分化,促进转化生长因子-β诱导的T细胞增殖,并限制转化生长因子-β和IL-6诱导的T细胞转化为Th17。34。同样的作者后来也证明,即使在不存在dcs的情况下,RA也通过直接影响Treg来支持tf-β介导的Treg分化。22。同时,Hill和他的同事也证明RA可能通过抑制记忆/效应分子CD4的抑制作用而促进Treg在体内的分化。+T细胞对Treg生成的影响35。此外,我们在此观察到RA对DC的作用可能会增加它们诱导天真的CD4转化的能力。+T细胞以RAR依赖的方式进入Treg(如图所示)。S8)。可能所有这些RA介导的机制在体内共同作用,促进外周Treg的产生。值得注意的是,组蛋白去甲基化酶JMJD 3/UTX在DC中的选择性抑制可引起RALDH活性的升高,增加这些细胞的RA产量,进而影响RA介导Treg转化的三种机制。

材料和方法

动物

实验采用6~12周龄C57BL/6背景小鼠。野生型(WT;Cd45.1−/− Cd45.2+/+)和同异基因Cd45.1+/+Cd45.2−/−老鼠以及Foxp 3绿色荧光蛋白记者老鼠是从杰克逊实验室购买的(酒吧港,ME)。所有小鼠都是按照无病原体设施的机构指南进行维护和操作的,该机构是在Ciencia&Vida基金会道德审查委员会批准后进行的。

抗体

抗CD3,抗CD 28,抗CD 16/32,抗CD4-APCH 7,抗CD 25-APC,PE抗IL-17A,PECY 7抗IFNγ,PeCy7抗CD45.1。抗IL-4、抗IFNγ、PE抗α4β7、APC抗CCR 9、UV 421抗IL-10或PE抗CD11c。抗H3K4me3和抗H3抗体是从Abcamm(英国剑桥)购买的。抗H3K27me3和正常兔IgG抗体是从美利波(MA,美国)购买的。6.

流式细胞术

经表面染色或特异性抗小鼠抗体(见“抗体”一节)染色后,用流式细胞仪检测T细胞和DC细胞表面和细胞内标记物的表达。36。简单地说,对T细胞进行细胞因子分析时,在37℃下用50 ng/mL的PMA和1g/mL的离子霉素在0.01mg/mL的BFA(Sigma-Aldrich)存在下刺激4h。细胞内染色,先用ZombieAqua(Zaq)固定活力试剂盒(Biolegend)染色,再用细胞表面标记物染色,再用固定/渗透液重新悬浮。表面标记物染色后,用1%甲醛固定细胞,用3%BSA和0.5%皂甙进行渗透,细胞内蛋白进一步染色。所有数据在FACSCantoII(BD生物科学)上收集,用FACS Diva软件(BD,新泽西州)或Flowjo软件(TreeStar)进行分析。扎克+细胞被排除在分析之外。

从脾脏、肠系膜和结肠固有层中获取细胞

用剪刀切取脾脏或MLN制成脾和mln细胞悬液,37℃下用1mg/mL胶原酶D(Roche)和50g/mL DNase I(Roche)消化45 min。细胞悬液经70μm细胞滤池(BD生物滤池)过滤,红细胞经氯化铵-钾缓冲液在RT下裂解5 min,再悬浮于PBS+10%FBS中进行进一步分析。对结肠进行解剖,用无钙的HBSS 1x清洗两次便,取出大便。2+2+最后纵向地打开了。在此之后,将结肠切成0.5厘米的块,用无钙的HBSS 1x冲洗。2+2+在含有2%FBS和1 MHEPES的IEL培养基中37℃下孵育30 min,并不断搅拌。用70-μm细胞过滤器清洗结肠片,用1 mg/mL胶原酶D(ROCHE)和0.25 mg/mL DNase I(ROCHE)分别在37°C的IEL培养基中连续搅拌45 min。消化后的组织通过70μm细胞过滤器获得一个细胞悬液,在Percoll梯度下离心(67%/44%)。将单个核细胞从间期取出,再悬浮于培养液中进行进一步分析。

细胞分离与体外T细胞分化

采用微球偶联抗CD11c Ab(Miltenyi Biotec)的MACS纯化试剂盒,对Wt(C57BL/6)小鼠脾脏树突状细胞进行了阳性筛选。避免最初的Foxp 3污染+CD4+T细胞,我们分离出天真的CD4+T细胞Foxp 3绿色荧光蛋白报告鼠37。脾CD4+T细胞Foxp 3绿色荧光蛋白按照制造商的指示,用CD4分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)对小鼠进行负性选择,并通过CD4分类进一步纯化。+CD 25Foxp 3使用FACS ARIA II细胞分类器的细胞(Becton Dickinson,NJ,美国)。在极化实验中,DC或平板结合抗CD3和可溶性抗CD 28在25 NM GSK-J4存在或不存在时刺激天真T细胞。对于无dc刺激,U底板用pbs稀释10μg/mL抗CD3,在培养物中加入1g/ml可溶性抗CD 28。38。对DC刺激,先与GSK-J425NM或载体(0.1%乙醇)孵育18h,在1μg/mL抗CD3存在下,以1:5的比例洗涤培养5天。ITreg标准极化条件下培养物含5 ng/mL TGF-β、10 0U/mL IL-2、10μg/mL抗IL-4和10μg/mL抗IFN-γ。当指示时,除标准极化条件外,在培养基中加入10 NMRA、25 NMGSK-J4或两者兼用。

Treg-Th17转分化试验

天真CD4+CD 25绿色荧光蛋白T细胞Foxp 3绿色荧光蛋白通过细胞分类和iTreg产生小鼠,如上文所述。CD4+绿色荧光蛋白+ITreg随后通过细胞分选和培养纯化(10)。5DC(2×10)4抗CD3抗体(1μg/mL)存在于含2%FBS和1 MHEPES、37°C和5%CO的IMDM培养基中的96孔板上2。在Th 17条件下培养细胞,分别为:TGF-β1(5ng/mL)、IL-6(20 ng/mL)、IL-1β(10 ng/ml)、抗IL-4(5μg/mL)和抗IFNγ(5μg/mL)。用流式细胞仪定量表达Foxp 3和IL-17A,评价Treg稳定性和向Th17系的转分化。

体外抑制试验

天真CD4+T细胞Foxp 3绿色荧光蛋白在树突状细胞存在时,小鼠被分化为iTreg(GSK-J4治疗与否)。孵化4天后,iTreg(绿色荧光蛋白)+CD4+)用细胞分选法分离。CD4+CD 25用5μMcTV负载幼稚T细胞,然后培养(5×10)。4细胞/井)与发展中国家(10个)4在U底96孔板中加入抗CD3抗体(1μg/mL),增加iTreg(Teff:Treg比2:1,1:1和1:2)。三天后,在CD4中评估Teff的增殖程度。+CTV+流式细胞术检测人群。

Aldefluor试验

用ALDEFLUOR染色试剂盒(StemcellTechnologies)测定DC中RALDH的活性。简短,106DCS/mL在含Aldefluor试剂(1.5M终浓度)的ALDEFLUOR试验缓冲液中,在Deab(二乙胺苯甲醛,15M)存在或不存在时再悬浮,37°C下孵育45 min,4°C下用APC-共轭抗CD11c孵育30 min。ALDEFLUOR反应细胞用流式细胞仪(FACS Canto II细胞仪)进行分析,数据用FACS Diva软件(BD)进行分析。

实时RTPCR法分析RALDH同工酶mRNA的表达

CD11c+C57BL/6小鼠脾DC在25 NMGSK-J4存在或不存在时,用100 ng/ml LPS刺激16h。细胞裂解,提取rna,并按前面描述的方式生成cdna。39。一个10-l的实时PCR反应包括2.5lcDNA,51KAPASYBR FAST(KAPA生物系统),500个NM引物和制造商指示的水。PCR进行了40次循环,其中95°C熔融(30 S),61°C(18 S RNA)或63°C(Raldh1,raldh2和raldh3退火(45 S),72°C延伸(40 S)。所有反应均在转子基因Q(奇根)上进行。引物序列如下:RALDH 1正向,5‘-GAC agg CTC AGA TTG GCT-3’;RALDH 1反向,5‘-AAG ACT TTC CCA TTG AGT G-3’;RALDH 2正向,5‘-CAG AGA GTG GGG-3’;RALDH 2反向,5‘-ACA GAA AGA GAG-GAG-3’;RALDH 3向前,5‘-CAC agg CTC CAT TGTG G-3’;RAHLD 3反向,5‘-TGT GCT GGGG-3’;18 s前推,5‘Gg Gg GAA GGGA-3’;RALDH 3前推,5‘-CGT GCT GGGG-3’;RAHLD 3反向,5‘-TGT GGAA GGG-3’;18S RNA逆转,5‘-CGG GTC GGG AGT GGG TAA TTT-3’。在相对定量方面,用前面描述的−ΔΔct方法与18 srna的表达进行了比较,使每个样本的mrna表达标准化。40.

染色质免疫沉淀与实时PCR

细胞分选后,CD11c+用1%甲醛固定DCS 10 min,芯片后进行实时PCR。6。RALDH 1、RALDH 2和RALDH 3启动子的引物如下:RALD-HP正向启动子,5‘-TCC TTC AAG GTC TGT GAC AGC-3’;RALD-HH 1反向启动子,5‘-AAC agg GAC CTG agg AGT GTG TTT-3’;RALDH2P正向启动子,5‘-GGT GTG GAT GGGAG AAA GGA AA-3’;RAH2P反向,5‘-CAT CTG CGG GGG GTT TTATT-3’;RALDH3P正向,5‘-GGGGA AAC TTC TTCC-TCAC-3’和H3LDP‘-RAAC 5’CTAC‘CTC-CTGGG GGG GTT TGTATT-3’;RALDH3P正向,5‘-GGGGA AAC TTC TTCC-3’。PCR为40次,95°C为10s,59℃为5s,72℃为5s(延伸)。

葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发结肠炎及评价

C57BL/6小鼠急性DSS结肠炎的实验研究41。组成DSS组或DSS+GSK-J4组小鼠,于第1天灌胃1.5%(w/v)DSS(分子量:36~50 kDa,MP生物制剂)。每隔一天提供一次新的DSS解决方案。此外,小鼠接受静脉注射。注射车辆或0.5毫克/千克谷胱甘肽-J46在不同的时间,如下所示。通过体重测量、大便稠度评定和血便检测,每日评估结肠炎的疾病症状。临床评分采用以下指标:0,正常排泄物和无血;1,软排泄物和无血;2,非常软的粪便和血液痕迹;3,结肠炎和血液。在其他急性结肠炎实验中,10个6骨髓来源载体处理或GSK-J4处理的DC从WT小鼠中转移。在开始急性结肠炎实验的同一天进入WT C57BL/6受体。

离体结肠切片培养及细胞计量学珠阵列

一厘米2在37°C和5%CO条件下培养24 h,在1mL IMDM培养基中培养结肠组织。2。取离体结肠切片培养上清液,在−80°C保存,用CBA进一步分析。用小鼠Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒(BD生物科学)分析细胞因子的产生。

发展中国家的产生

用上述方法制备了wt小鼠骨髓来源的dc前体。42。在RPMI 1640培养基(HyClone,Logan,UT)中添加5%热灭活FBS(生物工业,Beit Haemek,以色列)和10 ng/ml重组小鼠GM-CSF(PeproTech,Rocky Hill,NJ)。常规检测DC分化程度,获得≥90%CD11c。+细胞。在一些实验中,第5天DC要么用DMSO(车辆处理的DC),要么用10 NM GSK-J4(GSK-J4-处理的DC)脉冲18小时,洗涤并用于进一步的实验。

统计分析

数据以平均值±扫描电镜和P数值分析采用学生t检验或单向方差分析,然后按前面所述使用Prism(GraphPad软件)对Dunnett的测试进行分析。6。在某些情况下,P利用Mann-Whitney秩和分析了双尾秩和的值。U-使用GraphPad Prism软件进行测试。NS,没什么意义。重要价值被表示为*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.


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