电场处理后小鼠肺免疫细胞浸润的变化

目前，外生电场在人体治疗中的应用有很多方面。有趣的是，电场也被证明改变了免疫细胞的迁移和功能，表明了电场免疫疗法的潜力。电场治疗(EFT)对肺的影响知之甚少。为了确定EFT是否与肺免疫细胞浸润的变化有关，我们采用不同的EFT应用方法建立小鼠模型，用流式细胞术和细胞因子/趋化因子复合法检测细胞和可溶性介质。EFT与治疗后2h内肺中性粒细胞的短暂增加和嗜酸性粒细胞的减少有关，并伴有IL-6水平的升高。为了检测EFT是否能改变相关疾病模型中嗜酸性粒细胞/中性粒细胞的吸收，采用小鼠气道变应性炎症模型。变应原致敏小鼠的四次EFT剂量导致过敏原挑战后中性粒细胞增多，嗜酸性粒细胞浸润减少，表明EFT可持续改变炎症。采用弹性通气法对过敏性炎症小鼠进行肺功能测定。EFT治疗后小鼠吸气能力增强，其他指标肺功能均未减弱.这些数据提示EFT可以在不影响肺功能的情况下操纵肺内的免疫细胞浸润。

正常的细胞生理学涉及内源性电场的产生跨膜和身体部位，促进细胞和溶质的运动，以保持动态平衡。近年来，利用外源电场进行细胞或组织治疗已成为人们关注的一个领域。为了研究目的，电穿孔技术是一项关键技术，它通过增加细胞膜上的电势，从而创造膜孔，使遗传物质通过转染转移到细胞中。1,2。不同大小的细胞需要不同的电压才能渗透，因此可以根据大小选择细胞在混合培养中转染。3,4。在临床实践中，肌肉刺激、心脏功能和基于伤口愈合的电场疗法都显示出有益的效果，也是目前正在进行的研究领域。5。外源电场也被用来操纵免疫细胞。Dna疫苗在电穿孔水平电压下使用外源电场，可能是由于局部细胞死亡和树突状细胞和巨噬细胞的动员，因此在皮肤中具有更强的免疫原性。6。膜极化的改变也会影响细胞因子受体膜的迁移率和下游的细胞内信号。7。特别令人感兴趣的是，外源性电场治疗肿瘤可以通过增加肿瘤浸润淋巴细胞的数量来提高抗肿瘤免疫能力。8。此外，EFT还能预防原发性肿瘤切除后动物模型治疗后的转移，这意味着长期免疫的诱导。8,9,10。这些研究表明，通过EFT对免疫细胞的操纵，可以通过非侵入性方法改变或改善炎症性疾病。

尽管EFT在各种应用中有着潜在的应用前景，但外界对外源性电场对气道和肺功能的影响，以及在过敏性哮喘等疾病中是否有治疗作用，知之甚少。哮喘是一种常见的疾病，其特征是支气管炎症和气道狭窄，原因是对吸入过敏原的不适当免疫反应。嗜酸粒细胞哮喘是全球主要的健康负担，在一些地理位置和年龄组发病率高达20%。11。在易感个体中，吸入过敏原沉积在呼吸道并导致嗜酸性粒细胞为主的炎症。嗜酸粒细胞哮喘的治疗方法包括吸入性和全身性皮质类固醇，以及抑制黏膜炎症的新的靶向单克隆抗体。12。这些疗法针对的是症状，在改变疾病过程方面的疗效有限。EFT可能通过改变对过敏原产生的免疫浸润或细胞因子和趋化因子来影响疾病的进程。

我们试图确定EFT对肺部炎症和肺功能的影响，在一定的剂量和时间参数范围内，用电场的全肺照射来确定EFT对肺部炎症和肺功能的影响。此外，将EFT应用于小鼠过敏性炎症模型，观察其对Th2驱动的上呼吸道炎症的影响。我们发现EFT引起的肺免疫反应的变化可能会为未来的治疗进一步发展。

小鼠及样品的制备

所有研究均采用NCI的C57BL/6小鼠。动物被安置在罗切斯特大学医学中心的病毒中，在特定的无病原体条件下。所有的实验程序都是按照在亚非法律协商委员会批准的设施中照顾和使用实验室动物的机构指南进行的。所有的动物协议都得到了罗切斯特大学动物保护和使用委员会的批准。肺标本的制备。免疫组织化学方法：用福尔马林扩张肺，切除后石蜡包埋。将肺组织切成5微米切片，在pH9.5下蒸取抗原，加入链霉亲和素/生物素封闭试剂(链霉亲和素/生物素阻断试剂盒#SP-2002载体实验室，Burlingame，CA.)。组织切片在4°C下用1UG/ml抗中性粒细胞抗体(NIMP-R14#ab 2557；ABCAM，剑桥，MA.)其次为山羊抗大鼠生物素化二次抗体(7.5μg/ml)，作用30 min(载体实验室#BA 9400)。组织切片用Vecathain亲和素/生物素化复合物ABC试剂盒标记，然后与民建联过氧化物酶底物(载体实验室，#SK-4100)反应。多重和流式细胞仪分析，肺切除和匀浆在1mL PBS在茶过滤器上。离心后，取上清液在标记管中进行多重分析。肺微丸在37℃下，加入0.1mg/mL DNaseⅠ(Sigma-Aldrich，#DN 25)和0.1mg/mL解放酶(Roche，#5401119001)中孵育40 min。肺部被周期性地震动，以确保组织的消化。然后通过100 um过滤器过滤肺部并离心。上清液被丢弃，红细胞溶解。细胞再经100μm过滤器过滤，离心，再悬浮在300μL的pbs中进行流式细胞术分析。脾脏标本的制备。将脾脏切入5ml完全培养基和玻璃匀浆器，以打破开放组织。所产生的匀浆通过100 um过滤器过滤并离心。红细胞溶解，样品在离心前再次过滤。细胞在pBS中重新悬浮，进行流式细胞术分析。

中性粒细胞体外培养

EFT处理或对照肺消化如上，然后用Macs中性粒细胞分离试剂盒(Miltenyi)对单细胞悬液进行负富集。从不同样本中分离出的细胞群在3×10的完全培养基中被镀制。5在存在或不存在5μM R 848(Invivogen)的情况下，每井在96井圆形底板中的细胞。分别于4h取中性粒细胞检测IL-6的自发释放，培养16h后取R 848刺激的中性粒细胞。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清液中IL-6水平。

电场处理

将4%异氟醚通过鼻锥暴露在生物安全柜中。麻醉后，垫或镊子电极涂上导电凝胶，以避免动物直接接触，并应用于胸壁(垫电极)或鼻桥(镊子电极，BTX，哈佛仪器)。为了产生外加电场的EFT，使用了一个方波电穿孔器提供一个设定的电压在一定的时间(ECM 830方波电穿孔，哈佛仪器)。标准EFT剂量为8个10 ms脉冲，200 V/cm.计算电极之间的距离，以考虑鼻腔桥和胸壁方法之间的差异。EFT后，将导电凝胶从毛皮中清除，动物被送回笼子，并监测其恢复情况。模拟EFT涉及到异氟醚的暴露和导电凝胶的应用，但在没有EFT的情况下。初步研究采用了脉冲长度和剂量范围，从而形成了用于所述研究的方法(数据未显示)。

过敏性炎症模型

单纯小鼠于第0天腹腔注射20μg氢氧化铝4 mg，第6天腹腔注射OVA 5 mg，致敏鸡卵清蛋白(OVA；SigmaⅤ级)。第8~13天，经鼻注射OVA 10μg OVA 20μL PBS连续6天。最后一次挑战后两天，处死小鼠进行终点分析。

流式细胞术和多重

细胞因子和趋化因子从肺组织匀浆中用自定义多重分析法(Bio-Rad)根据制造商的指示进行测定。在罗切斯特大学人类免疫学核心的Bio-Rad Bio-Plex仪器上进行了检测，并在罗切斯特大学的Flow Core进行了流式细胞术检测。肺单细胞悬液先用FC阻滞染色，再用氟铬结合抗体染色。洗涤后，细胞在pbs中重新悬浮，并使用自定义配置LSRII(BD)进行分析。在所有研究中，使用了以下抗体面板：F4/80(FITC)、Siglc-F(PE)、CD 45(PE-Dazzle 594)、B 220(PE/Cy5)、Ly6G(PE/Cy7)、CD 64(APC)、CD 103(APC-R700)、CD11b(APC-Fire 750)、Live/Dead(Aqua/Pacific Orange)、MHC II级I类。a/我e(太平洋蓝)和CD11c(亮紫罗兰605)。所有的抗体和活/死染色均来自Biolegend。所有实验均采用适当的阴性和荧光阴性对照。采集后，用Flowjo软件版本10(BD)进行分析。

肺功能测量

成年小鼠用氯胺酮/西拉津(100 mg/kg)麻醉，用19毫米钝尖插管进行气管切开，并放置在小型哺乳动物呼吸机上(加拿大蒙特利尔，SCIREQ，挠曲Vent)。动物用加热垫取暖，并通过EKG进行监测。EKG导联一旦到位，小鼠就会被1毫克/千克溴化安定麻痹，以确保在实验过程中不会自发活动。小鼠机械通气，潮气量10 mL/kg，呼吸150次/min，PEEP 3cm H。20，和21%-50%的FiO 2。在无菌的PBS中，用增加剂量的甲基胆碱(0-100 mg/mL)对小鼠进行攻击，并采用多种通气策略来表征气道的特性。最后一次给甲胆碱后，用氯胺酮过量处死小鼠，取肺作进一步分析。

统计

所有分组比较采用单因素方差分析和Tukey多重比较试验。在肺功能测量方面，采用双向方差分析(ANOVA)对各剂量范围内的甲基胆碱进行比较.一个p值<0.05者为显着性。

作为EFT是否与急性影响气道内免疫细胞浸润相关的第一次试验，在单剂量胸壁EFT和流式细胞术对消化的肺匀浆进行2，24，48h后取肺组织(Supp中的门控策略)。图形1)。EFT后2小时，肺中性粒细胞数量短暂增加，到EFT后24小时恢复到正常水平(如图所示)。1a)。EFT后2 h嗜酸性粒细胞恢复下降，24和48 h增加(图1).1b)。单核细胞从EFT后2小时增加到24小时(见图)。1c)。树突状细胞和肺泡巨噬细胞在时间点上无差异(图)。1(d-F)EFT后48h肺细胞整体恢复增加(图1)。1g)。采用免疫组织化学方法检测模拟组和EFT后2h肺组织中性粒细胞的定位。模拟和EFT处理的标本在实质内中性粒细胞的定位无明显差异，但由于任何组织切片中的中性粒细胞数量都很低，所以很难进行综合分析(数据未显示)。

鉴于EFT后细胞动力学观察到的急性变化，对肺上清液进行了基于珠的多重检测，以确定细胞因子水平是否被EFT改变。IL-6水平在EFT后2h升高，24 h后恢复至EFT前水平(图1)。2a)。GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-10水平始终保持一致(图1).2(b-E)。为了确定中性粒细胞在EFT后2h的大量涌入是否会导致IL-6的增加，我们从酶消化肺中富集了Mock小鼠和EFT后2 h小鼠的中性粒细胞，并在中性粒细胞中产生IL-6的诱导剂R 848存在或不存在的情况下进行了培养。13。中性粒细胞培养中IL-6的恢复在两组间具有可比性(Mock 174+/−93 vs EFT 220+/−110 ng/ml)，pR 848(Mock 279+/−85 vs EFT 314+/−59 pg/ml)p>0.05)。

另外进行了一项实验，以确定是否与周围免疫细胞浸润的变化有关的EFT穿过胸壁。为了检验这一点，在进行了胸壁EFT和流式细胞术后，切除了肺和脾脏。为了确定重复的EFT应用是否具有加性效应，包括在献祭前2、24和48小时接受EFT的一组人。肺细胞的恢复与以前的研究相似。1和未显示的数据)。与对照组相比，EFT可引起脾细胞浸润的微小变化(图1)。3)。与其他组相比，连续三次剂量的EFT使免疫细胞恢复相似，只有B淋巴细胞恢复比对照组增加(图一)。3e)。这些数据提示，胸壁EFT可引起局部免疫细胞浸润的短暂变化，而这些变化不能系统地反映出来，并且可以改变EFT的时间和剂量，而不会显着地改变淋巴器官的免疫细胞恢复。

由于EFT后肺内嗜酸性粒细胞/中性粒细胞比率发生了急性变化，采用Th2介导的气道炎症模型，观察EFT是否与抗原激发后肺细胞浸润的变化有关。为此，小鼠在明矾中用OVA致敏，然后在EFT存在或不存在的情况下，用鼻内途径与OVA进行攻击(见图)。4a)。比较了EFT方法的不同变化。首先，我们比较了胸壁(使用垫电极)和鼻桥(使用镊子电极)的EFT传递。第二，将一次EFT剂量与其他挑战日(Quad-EFT)的四次剂量进行了比较(见漫画，图1)。4a)。在所有情况下，EFT是在OVA挑战前立即交付给动物的。单个EFT组于第14天给予EFT治疗，与Quad-EFT组的治疗时间相同。一个EFT剂量通过鼻桥传递与肺免疫细胞浸润的微小变化相关，中性粒细胞的轻微减少是OVA攻击后观察到的唯一变化(SUPP)。图形2和未显示的数据)。不做多次鼻EFT。然而，与模拟组和单一EFT组相比，在胸壁上接受Quad-EFT的小鼠的中性粒细胞显著增加，而肺中嗜酸性粒细胞减少(图1)。4b、c)。Quad-EFT组的嗜酸性粒细胞恢复未达到天真、非过敏小鼠的水平(图一)。4c)。这导致嗜酸性粒细胞显著减少：与模拟对照组和单只EFT小鼠相比，Quad-EFT组的中性粒细胞比率明显降低，并且与天真、非过敏小鼠的水平相当(图一)。4d)。

为了确定变应性炎症模型中免疫细胞浸润的变化是否与趋化因子分泌有关，肺上清液用珠为基础的复合化学因子进行了检测，这些趋化因子已知可在炎症期间引导白细胞迁移。与对照组相比，4-EFT组9种趋化因子中有8种具有较低的平均恢复率，但结合3个独立实验(SUPP)，均无统计学意义(P>0.0 5)。图形3)。为了确定EFT是否引起肺功能的改变，对OVA/Alum致敏小鼠和OVA致敏小鼠进行了挠曲试验。在所使用的甲基胆碱剂量范围内，Quad-EFT小鼠的吸气能力高于Mock(图1)。5a)。肺功能的其他指标在各组间是相同的(图一)。5(b-E)。

这些数据探讨了EFT作为一种潜在的治疗策略在改善肺内免疫细胞动力学方面的应用。选择的EFT剂量是在一个可接受的范围内的外源电场治疗已经在人类使用。14。总的来说，EFT与肺细胞和可溶性介质的轻微和短暂变化有关，表明对组织的毒性很低。脾脏周围免疫细胞不受EFT的影响。事实上，连续三次EFT剂量在48小时内对天真的小鼠并没有导致我们手中的免疫细胞数量有任何明显的变化。虽然在这些研究中没有测试到较宽的EFT剂量范围，但电场剂量可能会被调整，以便将其影响集中在组织内的特定细胞类型上。例如，由于较大的细胞在较小的场强下被渗透，如果它们与组织内其他细胞的大小有足够的不同，就有可能在组织内电穿孔特定的细胞。4。因此，细化剂量和定时方案可能会导致更有针对性的结果，从而避免毒性和优化细胞动力学的变化。

最一致的发现是多项实验中肺中性粒细胞的增加，这令人惊讶地伴随着EFT后嗜酸性粒细胞的减少。这一观察是通过肺变应性炎症模型复制的。嗜酸性粒细胞和中性粒细胞在哮喘中的作用是复杂的，特别的哮喘内源性常与嗜酸性粒细胞、中性粒细胞或两者的富集相一致。嗜中性粒细胞或混合表型哮喘可能与类固醇耐药有关，而嗜酸粒细胞性哮喘在本质上常伴有高度极化的Th2型炎症。12,15。由于EFT能够改变嗜酸性粒细胞：肺中性粒细胞比率，无论是在正常小鼠(2小时内)还是在EFT后几天内，变应原挑战小鼠，这是一个有趣的探索如何改变这两种关键细胞类型可以改变临床结果。中性粒细胞的激增伴随着白细胞介素-6的增加，这已被证明与人类的哮喘有关。16,17,18。IL-6可能在中性粒细胞性哮喘中富集。19最近的动物研究表明，IL-6缺乏的小鼠在过敏性哮喘模型中增加了肺浸润的嗜酸性粒细胞。20。提示瞬时EFT诱导的IL-6的产生可能是肺组织细胞蓄积变化的原因之一。然而，EFT诱导的中性粒细胞在OVA挑战后的变化也被观察到，如果剂量和时间是优化的话，可能会有更长期的影响。需要进一步研究EFT对肺细胞浸润的短期和长期影响，以及哮喘的临床表型。

为了探讨EFT作为一种潜在的肺干预手段，了解EFT与肺功能的关系是至关重要的。总的来说，EFT对肺功能的影响很小，从治疗的角度来看，这是令人鼓舞的。在我们的实验中，吸气能力是唯一显示出EFT变化的参数。慢性阻塞性肺疾病或哮喘/慢性阻塞性肺疾病患者经支气管扩张剂和/或联合治疗后，吸气能力可增加，并与肺功能增强有关。21,22,23。然而，吸气能力在哮喘中的作用尚不清楚。24。与此相关的是，EFT治疗的小鼠肺顺应性倾向较高，但没有统计学意义。虽然这些结果总体上是有希望的，但还需要更多的工作来确定EFT是否是治疗哮喘或其他炎症性气道疾病的可行的治疗方法。