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抗菌能力[医]沙维叶蝉和石榴植物提取物对临床致病菌的作用与其多酚类成分有关

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发表时间:2021-01-13 11:09作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

抗菌药物耐药性对全世界的人类健康构成严重威胁。植物化合物由于其潜在的抗药性修饰能力,可能有助于克服抗生素的抗药性。从11株具有临床相关性的细菌分离株中筛选出几种植物提取物和纯多酚化合物。两个表现最好的特工,[医]沙维叶蝉(Cs)及石榴(Gp)提取物,被测试为100。金黄色葡萄球菌临床分离,导致平均MIC50值在50-80g/mL之间。CS提取物含有可水解的单宁和黄酮类化合物,如杨梅素和槲皮素衍生物,具有较高的抗甲氧西林活性。金黄色葡萄球菌分离物。Gp萃取物主要含有可水解的单宁,如苦参碱和黄芩苷,对甲氧西林敏感。金黄色葡萄球菌分离物。广义线性回归和多重对应统计分析表明,CS提取物的高敏感性与细菌对β-内酰胺类抗生素和喹诺酮类药物的耐药性有关。而对GP提取物的敏感性与对喹诺酮类和苯唑西林敏感的细菌有关。细菌对GP和CS提取物的敏感性与细胞壁破坏机制有关。最后,一种不同的抗菌活性金黄色葡萄球菌根据分离株的耐药谱和多酚类成分,观察到分离株的耐药性,这可能导致包括抗生素和植物提取物在内的组合疗法的发展。

导言

多药耐药微生物数量的增加对世界范围内的人类健康构成了严重威胁,除非采取严厉措施,否则这一数字将继续增加。在管理一些严重的传染病过程中,几乎没有其他治疗方法,这是迫在眉睫的危险。2050年的预测是每年有1000万人死亡,全球经济成本为86万亿美元。1。此外,科学界目前和近年来都没有发现新的抗生素。制药公司投资开发新抗生素是不确定的,因为细菌耐药性可能会迅速发展,导致它们无法收回投资。2。这种令人关注的趋势可以在图中观察到。1.

图1

发现新种类抗生素和鉴定细菌耐药性的大致日期。

由于传统的药物疗法正在失去疗效,基于天然抗菌药物的新疗法正在成为治疗医院感染的替代或补充疗法。天然组合,如含有多种不同分子的植物提取物,包括多酚,已显示出抗菌活性。这些组合可以对抗许多不同的细菌分子靶点,有时可能避免常见的抗生素耐药机制。3。有证据表明,多酚和植物提取物能够破坏细菌质膜,抑制外排泵,抑制生物膜的形成,并抑制与耐药性有关的蛋白质(如PBP2a)的作用。4.

多酚类化合物具有较大的结构变异性,但它们的结构中有共同的酚类结构(附图)。沙一)。此外,多酚通常以与碳水化合物结合的形式出现,或与有机酸形成酯类,大大增加了它们的化学多样性。多酚类化合物在整个进化过程中都调节其多样性,作为许多不同分子靶点的配体,从而产生高分子混杂性。5。这种多靶点性状是植物多酚抗菌能力的关键,也是其与传统抗生素协同作用的关键。6。具有抗菌能力的多酚类化合物有黄酮醇、槲皮素和山奈酚,其最低抑菌浓度分别为1.95g/mL和7.8g/mL。金黄色葡萄球菌。富含多酚的植物提取物也被证明具有显著的抗菌能力。例如,从[医]西斯特乌斯母牛, [医]白蜡, [医]棒状cistusclusii[医]沙维叶蝉的MIC值低于100微克/毫升金黄色葡萄球菌3。不同植物提取物的化学成分Cistus的种类和种类石榴在过去已经得到了充分的审查7,8。此外,抗菌活性与金黄色葡萄球菌大肠杆菌这些提取物中含有可水解的单宁和黄酮类化合物。9,10,11.

本工作的目的是测试复杂植物提取物的抗菌能力,如石榴沙维叶草与以前报道的抗菌能力,和一些选择纯多酚类化合物,以作出选择表现最好的进一步抗药性细菌分析。此外,本研究旨在探讨所选提取物的抗菌活性与临床分离物的耐药谱之间是否存在某种关系。金黄色葡萄球菌。此外,我们还利用不同的统计方法,根据抗生素耐药谱和耐药机制,研究了多酚类成分或提取物类型是否对细菌的药敏有影响。

结果

首次筛选:纸片扩散法

由3种不同的植物提取物组成的小组(CS、Salviifolius C.salviifolius;PN,柑桔;GP,石榴)和7个纯多酚类化合物(GA,没食子酸;P,红芩苷;q3g,槲皮素-3-葡萄糖醛酸;m,杨梅素;N,柚皮素;EA,纤维素酸)是根据现有文献和研究小组先前的实验初步筛选出的,这些药物对细菌模型显示出活性。9,12。对下列微生物种类的临床分离株进行了筛选:金黄色葡萄球菌, 粪肠球菌, 屎肠球菌, 大肠杆菌, 肺炎克雷伯菌, 肠杆菌SPP.粘质沙雷氏菌, 沙门氏菌SPP.铜绿假单胞菌, 鲍曼不动杆菌嗜麦芽窄食单胞菌.

进行纸片扩散抗菌试验,作为第一次筛选最有效的化合物或提取物为进一步详尽的抗生素谱。表中显示了每种细菌对每种提取物或纯化合物的敏感分离物的百分比。1。对某一化合物具有抑制晕的分离物被认为是对该化合物敏感的分离物,无论其直径如何。每种细菌所使用的临床分离菌数量的差异是由于患者在选择30天期间从医院收集的细菌的差异所致。

表1革兰氏阳性球菌(第1-3行)、肠杆菌(第4-8行)和非发酵革兰阴性杆菌(第9-11行)对每种提取物或纯化合物的敏感菌株百分比。虚线把不同种类的细菌分开。*金黄色葡萄球菌不清楚地包括MRSA和MSSA分离物。

根据所获得的结果,进一步的调查,以确定最有效的药物在这第一次筛选对最敏感的物种临床相关性。根据这一推理,CS和gp被选择用于金黄色葡萄球菌由于它们在临床上的重要性,易于实验室培养,并在第一次筛查中取得了良好的效果。化合物P(纯红芩苷)虽然对几种细菌也有效,但由于其经济成本高,是GP和CS提取物的主要成分,因此其活性在一定程度上被这些提取物所覆盖。

提取物的酚类含量及HPLC-MS分子特征

第一次筛选后,用没食子酸当量(GAE)法测定所选提取物的总酚含量,并用HPLC-MS对其全组分进行表征。CS提取物总酚含量为60.1±5.5mg GAE/g提取物。而GP提取物的总酚类含量较低,为35.9±2.5mg GAE/g提取物。

用HPLC-MS对CS和GP提取物进行了表征,采用了专门为这些植物提取物设计的方法,如“材料和方法”一节所述。基峰色谱图如图所示。2,已鉴定的化合物、色谱和质谱数据列于表中。2用于CS和Table3为GP提取。通过建立以黄芩苷和槲皮素为代表化合物的水解单宁和黄酮类化合物的标准曲线,对提取液中的主要化合物进行了定量测定。这两种化合物的标准曲线包括在附图中。S2.

图2

CS基峰色谱图(a)和GP提取物(b)高效液相色谱分析。

表2用HPLC-MS鉴定CS提取物中的化合物。
表3用HPLC-MS鉴定GP提取物中的化合物。

CS提取液中可水解的单宁,并以苦黄芩苷为标准进行定量,分别为红芩苷(峰5和峰6分别为异构体Ⅰ和异构体II)和果梗素(峰2)。这些化合物的浓度分别为0.299、0.608和0.077 mg/mL。CS提取液中总可水解单宁浓度为0.984 mg/mL,相当于提取物的32.800%w/w。GP提取液中可水解的单宁为:红芩苷(第7、8、9峰)、苦参素(峰5)、脚霉素Ⅰ(峰6)和葡萄糖苷(峰10)。这些化合物的测定浓度分别为0.017、0.270、0.514、0.062、0.021和0.030 mg/mL的黄芩苷当量。总可水解单宁浓度为0.914 mg/mL黄芩苷当量,相当于提取物的30.460%w/w。

以槲皮素为代表类黄酮对多酚类化合物进行了定量分析。CS提取物中的黄酮类化合物为杨梅苷(峰11)、杨梅素3-阿拉伯糖苷异构体I(峰13)、杨梅素3-阿拉伯糖苷异构体II(峰14)、槲皮素葡萄糖苷(峰15)和山奈素二糖苷(峰18)。这些化合物的测定浓度分别为0.0154、0.0021、0.0066、0.0116和0.0029 mg/mL槲皮素当量。CS提取液中总黄酮含量为0.0386 mg/mL槲皮素当量,相当于提取液的1.286%w/w。总黄酮提取液中只有一种黄酮,即槲皮素葡萄糖苷(峰11),测定浓度为0.0057 mg/mL,相当于提取液的0.190%w/w,约为CS黄酮含量的10倍。每个提取物上的主要化合物的结构如附图所示。S3在线。

第二次筛选:用微量稀释法进行抗菌药物分析

采用P96平板微量稀释法对CS和gp提取物对100的抑菌活性进行了二次筛选。金黄色葡萄球菌对临床分离的50株MRSA和50株MSSA进行了研究。抑制细菌生长50%的最低浓度值(MIC)50)对每一个分离物都进行了方法部分的解释。MIC分布50的每一个被测试的分离物的两个提取物的值。金黄色葡萄球菌如图所示。3。特定MIC50每个摘录的值可以在补充表中看到沙一S2在线。

图3

MIC的方框图50针对MRSA和MSSA的CS提取物(绿色)和GP提取物(橙色)的分布情况。方框内的X表示平均值的值,水平线表示中值。

平均MIC50CS提取物对MRSA的抑制值为51.21μg/mL,GP提取物的值为72.89μg/mL。MIC之间没有显着性差异50在这种情况下,观察到了这两种提取物的值(双尾)。p值=0.0657.0 5>0.0 5)。平均MIC50CS提取物的MSSA值为80.70g/mL,GP提取物的MSSA值为51.67g/mL。两种提取物对MSSA的抗菌活性有显着性差异(双尾)。p值=0.0012<0.01,**)。

相反,当比较每种提取物对mrsa和mssa分离物的活性时,我们发现CS提取物对mrsa(双尾)更有效。p值=0.0019<0.01,**)。在比较gp提取物与mrsa和mssa(双尾)的活性时,无显着性差异。p值=0.0709.0 5>0.0 5)。MIC50每个分离物的值是独立的,CS与gp MIC之间没有直接的相关性。50研究菌株的值(数据未显示)。

抗生素耐药性与提取物活性关系的研究

所有分离物金黄色葡萄球菌以临床常用抗生素耐药谱为特征,通过MIC确定菌株对抗生素的耐药性是否与提取物的抗菌作用有关。50价值。这些配置文件包含在补充表中的每个单独的S3在线。

在图中。4,平均MIC50CS(A)和gp(B)提取物的值代表每一个敏感或耐药的分离物。金黄色葡萄球菌。不像之前的图。3,现在平均MIC50值根据电阻或灵敏度进行分组。金黄色葡萄球菌针对先前用于描述这些分离物的临床抗生素组的分离物(见补充表)S3)。每种抗生素的单独比较也显示在补充图中。S4在线。

图4

比较MIC50CS摘要的值(a)和GP(b)按抗生素敏感性(圆形)或耐药性(方形)分组的金黄色葡萄球菌提取物。相见甲氧西林OXA苯唑西林将军庆大霉素托布妥布霉素CIP环丙沙星,列夫左氧氟沙星TMX甲氧苄啶/磺胺甲恶唑FOS磷霉素威利红霉素克莱克林霉素泰特四环素货车万古霉素泰伊替考拉宁,DAP达普霉素利涅佐利德,MUP莫匹罗星。错误条不包括在此图中以最小化其上包含的符号,而是包含在补充图中。S4在线。

当将CS和GP的MIC值分组时金黄色葡萄球菌通过对特定抗生素的耐药性分析,可以发现某些处理组之间存在着明显的差异,这取决于抗生素的不同。CS提取物对耐药细菌的作用一般比对敏感细菌的活性更强(图1)。4a)。相反,GP提取物对敏感细菌的抑制作用大于对抗性细菌的作用(图一)。4(红方块位于蓝色圆圈之下,灰色方块位于金圆圈之上,不管阻力如何)。CS提取物显示出更高的抗菌能力。金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素(甲氧西林和苯唑西林)耐药的菌株,比对敏感菌株(p < 0.01, **). Similar results were obtained for other antibiotics, such as fosfomycin, daptomycin and mupirocin, but without showing statistical significance (p>0.05)。相比之下,GP提取物对敏感菌株的活性高于耐药菌株,而不考虑抗生素的类型(圆圈在方格以下),但磷霉素除外。这些差异在统计学上是显著的(p < 0.05, *) for oxacillin and quinolones (ciprofloxacin and levofloxacin).

广义线性模型回归

用GLMR对MIC的行为进行了一致的解释。50CS和GP提取值金黄色葡萄球菌根据他们对临床抗生素的耐药性。补充表S4S5在线显示GLMR分析的结果,如方法一节所述。

结果表明,预测MIC是可行的。50根据每个分离物对抗生素甲氧西林的耐药性或敏感性测定CS提取物的价值(p=0.014,*),苯唑西林(p=0.014,*),环丙沙星(p=0.003,**和左氧氟沙星p=0.007,**)。相反,对于gp提取,这似乎是不可能的,因为没有任何参数能够显着地解释它对MIC的贡献。50价值。在这两种情况下,对替考拉宁的敏感性似乎都很大,但这是因为没有发现对替考拉宁耐药的菌株,因此不可能在分析和产量值与初始截留值完全相等的情况下对它们进行比较。

多重对应分析(MCA)

MCA用于进一步确定提取物的抗菌活性与每株细菌对给定抗生素的敏感性之间的关系。在MCA中,行变量和列变量之间的关系以及每个变量的不同层次之间的关系都可以得到。这种分析允许将分类/分类数据转换为数据的交叉表和二维图像,从而简化了它们的解释。13。在此基础上,探讨了两个MCA维数的不同解。

第一个解决方案是基于将单个分离物直接表示为点。根据该方法,第一维度占方差的38.73%,第二维度占7.22%,占方差的45.94%。结果如图所示。5.

图5

MCA结果为个别分离物为点。不同临床分离株的分布金黄色葡萄球菌根据他们对临床使用的抗生素和提取物的耐药性分析。

如图所示,MRSA分离物有明确的分组,其正因子1值(红色圆圈),而MSSA组主要为负因子(蓝方格)。这种分组表明,不同的菌株对甲氧西林的耐药性或敏感性不同,证实了前几部分的结果,即对甲氧西林的耐药性是影响提取物活性的决定因素(见图五)。34)。此外,还可以在图中观察到其他分组。5(黑色大写字母)。A群含有一系列不均一的菌株,耐药率高达4种抗生素,但没有共同的特性,因为它接近原点。B组包括32株主要对大多数被测抗生素敏感的分离物,因此可以认为它是本研究中最敏感的人群。B组中9株对大多数抗生素也有敏感反应,8株对ERI和CLI耐药,而B组中部分菌株仅表现为中度耐药。D组只有6株分离物,其中5株对β-内酰胺类(MET和OXA)和对喹诺酮类药物(CIP和LEV)的总或中度敏感。E组包括15株对β-内酰胺和喹诺酮类药物具有共同耐药性的分离株,其中14株伴随耐药。F组中有25株菌株对β-内酰胺类和喹诺酮类药物具有耐药性,而24株菌株对ERE不耐药。此外,F组还含有大部分MIC相对较低的菌株。50CS提取物的值,其中17株在50株对CS最敏感的分离物中。

第二种方法是将分类值(对某一抗生素/提取物的抗药性或不耐药)直接表示为点数。对万古霉素(Van)、克林霉素(CLI)、左氧氟沙星(LEV)和环丙沙星(CIP)也有中等敏感性。由于这些菌株中没有一株具有这些特性,所以未包括对万耐或替考拉宁(teicoplanin,TEI)耐药菌株的数据.在此分析中,通过比较不同的MIC,确定了对CS和gp提取物的敏感性。50值为每个分离物的平均MIC值。50对全部100个分离株群体,CS为65.34 g/mL,GP为62.96g/mL。如果单个MIC50均高于所有菌株的平均值,该菌株被认为是抗性菌株。否则,如果该值较低,则该分离物被归类为敏感株。第一维度占方差的44.17%,第二维度占9.85%,占方差的54.02%。得到了一个范畴点的联合图,如图所示。6。类别量化图是一种显示变量判别的替代方法,可以识别分类关系。

图6

MCA结果的分类值(抵抗,敏感或中间)作为点。根据对不同临床抗生素和提取物的耐药性或敏感性,对不同菌株的分布进行分类。R(红色文本和红色圆圈),I(黑色文本和黑色*符号)和S(蓝色文本和蓝色方块)分别表示抵抗,中间和敏感。两个放大的插入物和抗生素之间的联系已包括在内,以澄清补充图。S5.

结果如图所示。6明显地将大多数靠近水平轴的点(因子2=0)分组,这表明这个二维对点分布的影响很小,而且F1因子对这种分布的影响更大。此外,大多数点接近轴截距(0:0点),表明它们不受任何维度值的影响。在得出这一初步结论后,可以从这一分析中得到一些有趣的结果。显示对抗生素耐药的多数点在地块的右侧(F1值为正),而与抗生素敏感性有关的大部分点在左侧。这个一般结论只有两个例外,克林霉素(CLI),其阻力点(CLI-R)在图的左边,CS提取,其点也是倒置的。最后的结果表明,菌株对CS提取物的敏感性与其对几乎所有抗生素的耐药性有关,证实了图中的结果。4。换句话说,CS提取物对耐药菌株特别有效.

另一个相关结果与不同抗生素的作用机制有关。根据其作用机制将抗生素和提取物分为五类:蛋白质合成抑制剂(GEN、TOB、ERI、CLI、Tet、LIN和MUP)、细胞分裂抑制剂(CIP和LEV)、质膜干扰物(DAP)和细胞壁干扰物(MET、OXA、FOS、VAN和TEI)以及其他机制(TMX、CS和GP提取物)。补充图S5联机显示了MCA图的补充版本,显示了这些机制。令人惊讶的是,呈现质膜和细胞壁破坏机制的抗生素与F1轴一致,F2值接近0。这与CS和GP提取物相似,提示它们的作用机制可能与细胞膜或细胞壁的改变有关。另一方面,抑制蛋白质合成和细胞分裂的抗生素表现出更广泛的分布,除了与F1和F2维度的关系外,还阻碍了我们得出任何结论的能力。

讨论

在本工作中,天然纯化合物和提取物,由于其潜在的抗菌能力,已被挑战对不同的微生物具有临床相关性,以研究其作为新的抗菌剂的用途。采用两步筛选设计,为进一步研究选择最佳人选。第一次筛选使用了来自11种不同菌株(3株革兰氏阴性菌和8株革兰氏阳性菌)的105株临床分离株,结果表明,3种纯化合物和2种提取物对其有活性。金黄色葡萄球菌[医]麦芽病。的可用分离物数目麦芽芽胞杆菌我们的地理区域很低,所以研究的重点是金黄色葡萄球菌。当对该微生物的结果进行分析时,只有3个纯化合物(P,Q3G和GA)和两个提取物(CS和GP)呈阳性结果,尤其是化合物P、CS和GP提取物。此外,P也是两种提取物中的主要成分。这些化合物和提取物由于其抗菌活性而被研究过。金黄色葡萄球菌,确认其与未来发展的相关性3.

一般来说,CS提取物对耐药细菌的作用比对抗生素敏感的细菌更有效,而GP提取物对临床常用抗生素敏感的细菌更有效。当使用CS提取物对抗对β-内酰胺类抗生素耐药的细菌时,就证明了这一趋势,具有统计学意义(p < 0.05, *). Significant differences were also observed in GP extract against bacteria sensitive to quinolones and oxacillin (p < 0.05, *). These results were reinforced by using GLMR and MCA analysis. These results were also consistent with those obtained by Atef M. et al., in which differential antimicrobial activity of plant extracts against several strains of 铜绿假单胞菌对不同的抗生素耐药谱进行了观察和相关分析。14.

在本研究中,平均MIC50CS提取物对临床分离的MSSA的效价为80.67μg/mL,对MRSA的效价为51.21μg/mL。不同抗菌药物的抗菌性能沙维叶草我们的小组和其他人曾报道过提取物,因此产生了类似的MIC。50值:11μg/mL12在45到50μg/mL之间9都反对金黄色葡萄球菌CECT 59(MSSA)关于MRSA,先前的一项研究对MIC进行了量化。50对临床分离的利比亚MRSA株的CS提取物,浓度为25 mg/mL15。这个MIC50其值远高于我们从CS提取得到的值。这种差异可能是由于用于获取CS提取的不同方法造成的。Abdurrezagh E.等人使用的提取物。采用甲醇和水(8:2,v/v)的混合物进行常规萃取,过滤干燥,无需进一步纯化,也不提供任何其他分析数据。我们的萃取物是在不使用乙醇的情况下得到的,然后用FPX 66树脂进行最后的柱分馏,得到多酚(60%w/w)的萃取分数。不同的抗菌能力也可能是由于不同的。沙维叶草用于生产提取液的原料,因为植物中的多酚含量可能因环境条件、压力或甚至一年中发生收集的时间而异。16.

本研究确定了平均MIC值。50GP提取物对MSSA的测定值为51.67g/mL,对MRSA的值为72.89μg/mL。其他研究测定了石榴干皮提取物对mssa(Atcc 11632)和mrsa(Atcc 33591)的抗菌作用。50Mssa和mrsa的值在100到250μg/mL之间。17。根据制造商的信息,GP萃取物也是经过一种亲和树脂纯化后得到的,类似于用来获得CS萃取物的方法。这一过程确保了高多酚含量,可以发生在CS提取,解释了本研究的更好的结果,当在那些在文献中。

另一个值得讨论的方面是,在本研究中使用的两种多酚类提取物表现出非常不同的活性,取决于测试的细菌。这很可能是由于他们的多酚组成不同。HPLC-MS分析结果表明,两种提取液中最丰富的成分为可水解单宁,其相对含量分别为32.800%和30.460%。因此,活性的差异应取决于较少的化合物。对7种不同类型的黄芩苷进行了抑菌活性测定。金黄色葡萄球菌分离物(29213、25923和5株食品分离物)的最低抑菌浓度(μ)为2 5 0g/mL。18。GP提取液中只含有可水解的单宁(纤维素和速滑单宁)和一种很低浓度的黄酮醇,而CS萃取物中含有较多的黄酮类化合物(黄酮类、黄酮类和黄烷醇类)、酚酸和香豆素。以前的研究表明,某些多酚类化合物的结构与其对敏感和耐药抗生素细菌的差异活性有关。关于MRSA,多酚呈现某些化学基团,如COOH和OH基团。矫形第2段职位,或O-CH3苯环的位置,似乎增加了特异性抗mrsa活性。19CS提取物中的黄酮类化合物,而PG提取物中的黄酮类化合物不具有这些特征。CS提取物对抗药性细菌的高活性也可以解释为类黄酮和可水解单宁在一定浓度下的协同作用,正如我们小组先前描述的那样。12。在GP提取液中不存在可水解的单宁

根据GLMR和MCA的统计结果,我们可以得出结论,细菌对所研究的提取物的敏感性与临床分离株的耐药谱有关。金黄色葡萄球菌。特别是,细菌分离物对β-内酰胺类抗生素和喹诺酮类药物的耐药性与其对CS提取物作用的敏感性直接相关。相比之下,PG提取物对喹诺酮类和苯唑西林敏感的细菌效果更好。另一方面,基于分类值的MCA提示了一种与质膜或细胞壁断裂有关的机制。这一结果与先前报道的结果是一致的,此前报道认为这些机制是多酚类物质(如可水解的单宁)的主要分子靶点。3。尽管如此,还需要进一步的机械研究来证实这一假说。

总之,CS和GP提取物显示了最高的抗菌活性,在所有使用的天然抗菌药物,对11种不同的微生物种类具有临床相关性。此外,CS提取物具有较高的抗药性。金黄色葡萄球菌临床分离株对敏感菌株更有效,而PG对敏感菌株更有效。应用广义线性模型回归和多重对应统计分析表明,提取液的抗菌能力取决于每株细菌的临床耐药谱。含有可水解单宁和黄酮类化合物的CS提取物对β-内酰胺耐药菌更有效,而以水解单宁为主的GP提取物对喹诺酮类和苯唑西林敏感菌更有效。我们推测CS提取物对抗生素耐药细菌的优越活性可能与黄酮类化合物的存在或可水解单宁与黄酮类化合物的协同作用有关。根据细胞壁破坏机制,提出了细菌对GP和CS提取物的敏感性与抗性谱之间的联系。这些观察为今后的研究开辟了进一步的可能性,研究重点是细菌对某些类抗生素的耐药性与具有更强抗菌活性的天然分子之间的关系。这种方法可以开发个性化的联合抗生素治疗耐药感染,更有效,更少依赖化学合成的分子。

材料和方法

伦理陈述

本研究所用的所有程序和方法都是按照有关准则和条例进行的,并曾由米格尔·埃尔南德斯大学道德和廉正研究委员会批准,参考资料为UMH.IBM.VMM.05.15。

该委员会放弃了对这项研究的额外知情同意的需要,因为所有样本都是在阿利坎特大学总医院的通常临床实践中获得的,并得到了相应的知情同意。这些同意书仍由医院保管,并纳入每个病人的临床病史。这些知情同意明确包括未来用于研究目的,始终保持病人的匿名性。

植物提取物及纯化合物的筛选与采购

以下纯化合物是从Sigma-Aldrich(美国米苏里)购买的:没食子酸、红芩苷、槲皮素-3-葡萄糖醛酸、杨梅素、柚皮素和纤维素酸。石榴柑桔分别从Monteloeder S.L.和Nutracitrus S.L.公司获得果实提取物。沙维叶草提取液是在实验室中用水溶液萃取叶,然后用AmberLite FPX 66树脂(杜邦,美国特拉华州)进行柱层析纯化,其特征如下8,9. 沙维叶草标本在Alicante(西班牙)Elche的Miguel Hernández大学培养,经提交人鉴定后收获。有代表性的样品以CS190723-EBC的形式存放并保存在样品收集中。

抗菌分析

在纸片扩散试验中,将已知量的化合物或提取物(40g)稀释在5升蒸馏水中,用5毫米直径的小纸片放置在培养皿中,其中微生物先前广泛撒在半固态Mueller-Hinton琼脂上(美国马萨诸塞州默克·米利布特,美国马萨诸塞州)。所有盘子中均为阳性(带抗生素的圆盘)和阴性(经磷酸盐缓冲液调节到pH7.4的圆盘)。在浸有抗菌活性的圆盘周围产生了抑制晕。每项测试一式两份。对下列微生物种类的分离物进行了抗菌分析:金黄色葡萄球菌, 粪肠球菌, 屎肠球菌, 大肠杆菌, 肺炎克雷伯菌, 肠杆菌SPP.粘质沙雷氏菌, 沙门氏菌SPP.铜绿假单胞菌, 鲍曼不动杆菌嗜麦芽窄食单胞菌。这些物种的选择是因为它们在卫生领域的重要性,因为它们的临床影响和耐药性的发展。这些微生物是从阿利坎特总大学医院的病人临床样本中提取的。

根据EUCAST程序和CLSI标准对每个分离物进行药敏试验。根据EUCAST的分类,所有菌株都被归类为抗性(R)、敏感(S)或中间(I),并列在补充表中。S3.

对96口井板进行了平板微量稀释法测定.不同菌株的微培养金黄色葡萄球菌在10种不同浓度(2~0.0004 mg/mL)的平板上进行了抑菌活性测定。所有平板均以环丙沙星阳性(环丙沙星)和阴性(提取液、载体和非接种样品)为对照。每个钢板一式两份。培养基为Muell-Hinton肉汤(美国马萨诸塞州默克·米利波尔).37°C培养24h后,用氯化碘四唑盐(Sigma-Aldrich,Misuri,USA)染成活菌红色。37°C平板培养30 min后,用分光光度计(BioTek Synergy HTX,Vermont,USA)测定在570 nm处的吸光度,测定每口井中微生物的增殖情况。得到的吸光度值与每口井中的活菌数成正比。用GraphPad Prism 6软件对所得数据进行分析。

总酚类含量测定

用没食子酸当量法(GAE)测定96孔板中总酚含量。20。首先,将每个样品的10μL与50μL的Folin-Ciocalteu‘s酚试剂混合.1分钟后,100升钠2协和3混合液(20%,w/v)和840升蒸馏水混合。反应在黑暗中30 min。用分光光度计在700 nm处测定了平板吸光度(BioTek Synergy HTX,美国佛蒙特州)。没食子酸的标准曲线(Sigma-Aldrich,Misuri,美国)以前是用已知浓度的水溶液编制的。用GraphPad棱镜6软件对吸光度数据进行了分析。结果以没食子酸当量(g GAE/100 g植物干物质)表示。

高效液相色谱分析

利用Agilent LC 1100系列(Agilent Technologies,Inc.,Palo Alto,CA,USA),利用前面描述的Esquire 3000+(Bruker Daltonics,GmbH,德国)质谱,采用高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)分析了第一次筛选中筛选出的提取物的分子组成。12。简要地说,HPLC仪器配备了泵、自动放大器、紫外-可见二极管阵列检测器和柱式烤箱.HPLC仪采用ChemStation软件进行控制。该仪器配有电喷雾电离源和离子阱质量分析仪.用Esquire控制软件和DataAnalysis3.4软件操作质谱仪。色谱柱为Agilent Poroshell 120 RP-C18柱(4.6×150 mm,2.7m)。

样品分离方法由1%甲酸(A)和乙腈(B)的线性梯度组成。梯度从B的5%开始,30 min增加到B的25%,45 min达到45%,51 min增加5%,再增加5 min用于柱重平衡。流速为0.5mL/min。二极管阵列探测器的波长分别为280 nm、320 nm和340 nm.ESI电离源以负模工作产生[M−H]。离子。ESI条件为:脱溶温度360°C,汽化器温度400°C,干气(氮)12 L/min,雾化器70 psi。数据采集采用离子阱采集时间为200 ms的全扫描模式(50~1400 m/z)。

利用自制的酚类化合物库进行hplc-dad分析,并将样品中峰的保留时间、紫外光谱和质谱数据与文献报道的真实标准和数据进行比较。7。使用DataAnalysis3.4软件进行了光谱解释和主要化合物的鉴定(Bruker Daltonics,GmbH,德国)。

以槲皮素为代表类黄酮对多酚类化合物进行了定量分析。以苦黄芩苷为代表的水解单宁,对该多酚类化合物进行了定量测定。用于测定提取物中多酚类化合物的标准曲线所用的红芩苷和槲皮素都是从默克(德国)购买的。软件ChemStation for LC 3D(Agilent Technologies生命科学和化学分析,WaldBronn,德国)用于定量。在8个浓度水平(0.25~0.25mg/mL)上,测定了响应的线性范围,并对每个浓度进行了三次注射。用六点回归曲线进行了化合物定量评价的校正图(R)。2>0.996)7.

统计分析

抑制细菌生长50%的最低浓度(MIC)50)用GraphPad棱镜6对每个分离物和处理与数据集之间的显着性差异进行处理,并对微稀释法分析得到的数据进行处理。用最小二乘非线性拟合(测井抑制器与变斜率归一化响应,方程:y=100/(1+10^))对所收集的数据进行分析。50(−X)×山坡))50价值。最后的图表是使用MicrosoftExcel 2016生成的。用Microsoft Excel和Google Colab与木星笔记本电脑、MCA-1.0.3、Pandas v0.25.3和Matplotlib Python v3.2.0进行了广义线性模型回归(GLMR)和多重对应分析(MCA)。一方面,GLMR一词通常是指给定连续和/或范畴预测因子的连续响应变量的传统线性回归模型。在这种情况下,假设响应变量服从正态分布。另一方面,MCA接受多个分类变量,并试图识别这些变量级别之间的关联。可以认为它类似于定量变量的主成分分析。与其他多元方法类似,它是一种降维方法,将数据作为二维空间中的点进行降维。


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