小牛回肠早期微生物学、免疫学和本体论转换的综合分析

阿伯丁安格斯小牛从出生后立即处死至96日龄(DOA)，并采集回肠标本进行微生物、组织学和免疫学分析。费米克特出生后立即在小牛回肠内发现细菌，并在出生至96 DOA的所有时间点一直保持着主导门的地位。门的时间位移明显增加拟杆菌出生后随时间增加放线菌久而久之。在细胞水平上，回肠绒毛的细胞密度随着时间的推移而显著增加。先天细胞室主要由嗜酸性粒细胞和巨噬细胞组成，适应性T淋巴细胞比例较低，而T细胞(包括上皮内层T细胞)的相对丰度随着时间的推移而增加。根据炎症传感器基因的表达水平来评估回肠细胞的免疫能力。NLRP 3，以及炎性细胞因子IL1A, IL1B和IL 33-从出生起，所有这些都显著增加。相反，抗炎细胞因子基因的时间减少。IL 10从出生就被发现了。本研究提供了一个完整的基础微生物学，组织学和免疫学数据的新生儿回肠免疫适应微生物定植在小牛。

最近的研究集中在每一个新生儿所面对的微生物群的检测和特征上，这导致我们对生活在真核生物中的原核生物物种的理解有所扩展，包括人类。1。在家畜种类中，其特点是有限的，但反刍动物的胃肠(GI)是主要的重点，这导致了最初的好氧和兼性厌氧菌的全面特征，例如葡萄球菌，链球菌，肠球菌和肠杆菌利用可利用的氧气，并允许随后建立厌氧菌2,3,4。在出生后的几天和几个星期内，会出现产甲烷菌、真菌和原生动物。5。现在大家都知道，新生反刍动物消化道代表着一系列独特的生态生态环境，它们蕴藏着独特的微生物群落，将在成年动物的消化、健康和动物生产中发挥关键作用。6,7,8.

在出生后的几个小时和几天里，新生小牛只接受液体的初乳饮食，然后是提供早期微生物的牛奶，这些微生物可以在肠道中定居。9。在这一阶段，瘤胃壁的一种特殊的结构适应被称为食道沟，它将牛奶直接输送到胃胃，在引入固体食物之前不会发生瘤胃发育。随着母体抗体的被动转移，初乳和牛奶也向新生儿输送生长因子(胰岛素样生长因子-IGF-1和激素)，这些因素通过促进小肠上皮细胞的增殖和绒毛及隐窝的生长而影响肠道的发育。10。尽管现在对新生婴儿的原核生物复杂性有了详细的了解，但是随着时间的推移，宿主是如何识别、响应和适应它的，目前还不太清楚。此外，这种最初的定植对多种复杂的生理过程有着重要的影响，尤其是免疫系统的适当发展，所有这些都必须受到严格的调控，以防止与炎症相关的组织病理和死亡。

在产前解剖形成的同时，反刍动物免疫系统的功能发育发生在产后.在适应性免疫系统发育之前，新生儿主要依靠先天免疫系统来防止感染。现在人们认识到，这些早期的宿主-微生物相互作用也有助于免疫系统的程序设计。5。虽然微生物群落对包括宿主肠在内的粘膜表面的快速定植可能会引起病理性炎症，但其预防炎症失控和维持稳态的机制尚不完全清楚。已经确定了一些调控策略，包括微生物产生信号的机制，以促进调节性免疫细胞的成熟，并防止免疫反应的过度激活。11,12。“炎症性无反应”一词用于描述在建立保护性微生物群的过程中，炎症反应的暂时沉默。然而，这些机制在非模型生物中缺乏经验证据。

牛肠道免疫细胞沉积最丰富的部位是回肠。回肠是小肠的一部分，小肠粘膜下层含有高浓度的淋巴结节，称为Peyer‘s斑。这些结节形成肠相关的淋巴组织，被称为肠道的“免疫传感器”。13。这些由滤泡相关上皮(FAE)组成的免疫中心对于区分致病性和共栖细菌至关重要。部分上皮层含有专门的M细胞，这些细胞作为转运细胞(腔内蛋白和抗原)从肠腔到免疫细胞，从而成为耐受或免疫激活的门户。这些相互作用是通过居住在上皮细胞上的细胞受体以及免疫细胞介导的，称为Toll样受体(Toll样受体，TLRs)。无菌动物Git的上皮细胞减少了TLRs的表达，说明肠道共有微生物促进了这些受体的表达。14。Lotz等人报道说，下调检测细菌脂多糖的tLR 4信号通路可防止炎症反应。15。在小牛身上进行的一项研究表明，与6个月时相比，出生后几周小肠中的几个TLRs和抗菌肽的mrna表达水平下降。16。此外，IL1和IL6小牛空肠的基因表达最近被证明受到出生方法的影响。17。在牛体内，Peyer‘s斑块的FAE不仅对初生白细胞进入新生儿循环有重要作用18同时也是包括分枝杆菌在内的传染病抗原，因此在对这些病原体的免疫反应中起着至关重要的作用。19。已知牛的许多有问题的肠道感染都是以肠道的M细胞为靶点的。20,21,22因此，表明该地区寄主与病原的相互作用是至关重要的。然而，人们对早期组织和免疫系统成熟的模式以及定植微生物如何与宿主相互作用以促进体内平衡的知识有限。

本研究的目的是全面描述从出生到96天，随着回肠形态的发育，微生物多样性的变化和免疫应答的发展。了解宿主-微生物相互作用在早期的整合、协调和个体发生是设计保护牛犊免受机会性细菌和病毒感染的新策略的关键。

年龄对新生小牛回肠细菌群落动态的影响

细菌16S扩增序列共产生29,169,392个序列，经初步处理后，平均每个回肠样品获得788,362个高质量序列，读取次数从207,609到3,071,093不等(中位数=583,507)。绝大多数的读类分类成功，只有0.39%，3.4%，20.87%的未分类，分别在门，科和属的水平。

小牛早期回肠中发现20个细菌门(补充表)1)。然而，在任何一个取样时间点，只有5个样本的丰度>5%，如图所示。1一个。费米克特在96天的取样窗中，新生小牛的回肠仍然是最主要的门，占出生时检测到的总细菌序列的83%，从53-86%到96 DOA。蛋白细菌 (7.86%)、疣状 (5.61%) 拟杆菌 (1.96%), 放线菌 (0.81%), 衣原体(0.39%)和协同(0.28%)门组成的剩余部分细菌序列(合计总数17%)在出生时。在家庭层面，链球菌科强优势，占该科细菌序列的76.21%。其他相对丰度较高的家庭包括维管菌科 (5.6%), 巴氏科(3.37%±0.33%)肠杆菌科 (2.12%), 弯曲菌科 (1.59%), 龙须草科 (1.28%), 维龙葵科(0.53%)和银合欢科(0.28%)。这8个家族共约占所有检测到的细菌序列的91%。出生时，大部分序列(71.21%)属于该属链球菌，带着阿克曼西亚 (5.6%)、乳球菌(4.92%)、肠杆菌 (2.9%)、大肠杆菌(2.11%)和弯曲菌(1.59%)属次之。所有其他属的相对丰度较低，每个属占回肠标本总细菌序列的不到1%。

用无量纲多尺度法(NMDS)和PERMANOVA法检测不同年龄组小牛回肠细菌群落结构是否存在显着性差异(达96 DOA)。细菌群落分布在门、科、属层次上呈年龄相关聚类，而nMDS图仅显示在属层次聚类。1在96 DOA时，小牛的细菌群落结构可以观察到，在所有其他时间点，离群落相当远。同样，新生小牛(0 DOA)和小牛在7 DOA时的细菌群落与所有其他时间点非常不同，但有几个离群点除外。PERMANOVA分析证实牛犊回肠中的细菌群落结构在所有6个时间点上都有差异，如在nMDS图上观察到的。P=0.0001)。

用相似率(SIMPER)分析(补充表)确定了不同时间点造成群落结构差异的细菌门。2)。尽管费米克特在取样的所有时期，该门都是占主导地位的门，该门相对丰度的变化并不是群落结构差异的主要驱动因素。在大多数时间点，造成群落结构差异的主要原因是另一个占主导地位的门，细菌。该门的相对丰度从出生开始增加到7 DOA，这解释了新生和小牛在7 DOA时群落结构差异的19.7%。相对丰度的减少疣状菌、衣原体、协同菌和纤维菌还导致了不同时间点细菌群落结构的差异。相对丰度蛋白细菌从出生到28度下降，虽然这个门对出生时观察到的任何差异没有贡献，但在那之后确实起了作用。相反，相对丰富的放线菌从出生到28 DOA，但当它解释了28日龄和96日龄小牛的细菌群落差异的11%时，下降了96 DOA。

在属层次上，相对丰富度链球菌，肠杆菌，阿克曼氏菌和乳球菌回肠中7 DOA的相对丰度低于出生时的水平。类杆菌，Prevotella，Subdoligraum和肠杆菌都增加了。这些细菌解释了新生小牛和周龄小牛回肠细菌群落结构差异的大约15%。分属序列洋底粒和类杆菌与其它细菌相比下降了14 DOA。双歧杆菌，Sharpea，Olsenella，Veillonella，Prevotella和镓菌在14 DOA时，它们都增加了相对丰度，共同解释了7 DOA和14 DOA细菌群落分布差异的15%以上。

在21度，相对丰度链球菌，乳球菌，维罗氏菌和梭菌森苏斯特里托都下降了，而Succinivibrio，Alobaculum，Faecali细菌，Sutterella和非分类属α-蛋白细菌和类杆菌都增加了。当这些属结合在一起时，它们在回肠细菌结构的时间点之间的差异中占15%。在28度，相对丰度Succinivibrio，Alobaculum，Faecali细菌，Prevotella和非机密α-蛋白细菌和类杆菌再次下降罗布托西亚和夏皮亚增加.最后，在96度时，相对丰度有所下降。双歧杆菌和链球菌而相对丰度酵母菌，酵母菌，土耳其杆菌，大肠埃希菌和非分类属反刍动物科(Lachnospiraceae)和念珠菌断奶后28天(断奶前)和96天(断奶后)小牛回肠细菌群落结构差异均有增加，占总数的14%。

在门的水平上，细菌丰富度和多样性(根据Shannon-Wiener指数)在出生至7 DOA之间有所下降(按Shannon-Wiener指数计算)。P=0.0005和P分别=0.003)。细菌丰富度恢复到14日龄新生小牛的水平(P=0.004)(补充表3)。在属层次上，出生至7 DOA之间细菌丰富度、均匀度和多样性也下降。P=0.0005)，此后波动。有趣的是，尽管有这些波动，但没有明显的差异(P新生小牛回肠与新生小牛回肠细菌丰富度、均匀度或多样性均>0.05。

新生小牛出生至96日龄回肠的形态学变化

小牛回肠绒毛长度在出生至7日龄时显著减少(P<0.01)。P=0.008，图1。2(A)96日龄时的绒毛长度与新生小牛相比无显着性差异(P>0.05)。P=0.8，图1。2b)。各年龄组绒毛宽度相似。

总体而言，每个回肠绒毛的平均免疫细胞数从14 DOA显著增加，14时显著增加(P < 0.05), 21 and 28 DOA (P < 0.0001) (Supplementary Table 4)。到96 DOA时，细胞总数几乎增加了一倍，显示了大量的细胞浸润到绒毛中(P < 0.0001, Fig. 2c)。在D7、D14和D96分别有2只动物和D21、D28各1只动物的固有层粘膜中观察到少量中性粒细胞，偶有细胞增多(数据未显示)。嗜酸性粒细胞和巨噬细胞分布均匀，分布在固有层粘膜的绒毛和隐窝的水平(图)。2(C)这些先天细胞是最丰富的。此外，在Peyer‘s斑块上的粘膜下层和所有年龄组的卵泡中都有少量的单个巨噬细胞。与出生相比，28和96 DOA时巨噬细胞数显著增加(P < 0.05) and macrophages remained the most abundant cell type throughout the 96 day sampling period. In contrast, eosinophils displayed s significant decrease at 7 and 14 DOA relative to birth (P < 0.05, Fig. 2c)。

出生时适应性细胞数量最低，但T淋巴细胞数量从出生开始逐渐增加，在21、28和96 DOA时T细胞数量显著增加(P<0.01)。P < 0.01). Adaptive T-cells showed a similar mucosal distribution and also infiltrated the mucosal epithelial lining cells (referred to as intra-epithelial lymphocytes). From 14 DOA, the number of intra-epithelial lymphocytes significantly increased up to and including 96 DOA (P < 0.01, Fig. 2c)。在D28和D96时，Peyer‘s斑块上粘膜下层见少量T细胞，滤泡内单个T细胞较少。在固有层粘膜中，所有年龄组仅检测到单个B细胞，因此这些细胞不包括在细胞计数中。绒毛扩张淋巴管在D7、D14和D28处偶有B细胞充盈。此外，B细胞在Peyer‘s斑块的淋巴滤泡中广泛可见.此外，在Peyer‘s贴片上的粘膜下层也观察到一定数量的B细胞(数据未显示)。在穹顶区，0天观察到单个T细胞，随年龄增加而增加(附图)。1)。少量B细胞进入穹顶区并浸润FAE。随着年龄的增长，这些数目略有增加，浸润FAE的B细胞数量也略有增加。同样，巨噬细胞在淋巴组织中的数目随着年龄的增加而增加。

小牛回肠绒毛的典型图像如图所示。3从出生起的年龄组-0(a至c)、7(d至f)、14(g至i)、21(j至l)、28(m至o)和96(p至q)DOA。7、14 DOA组绒毛固有层粘膜浸润嗜酸性粒细胞数较出生时减少约50%。嗜酸性粒细胞的数量在28 DOA上增加，96 DOA的水平最高。T细胞在固有层粘膜和粘膜上皮中观察到，随着年龄的增长，T细胞明显增多。进入绒毛固有层粘膜的巨噬细胞数量也增加到28岁。

早期小牛回肠免疫细胞丰度与细菌相对丰度的相关性

三种优势免疫细胞类型(嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞)与优势菌的相关性在门和属水平上均显示出一定的信息相关性。回肠绒毛平均T淋巴细胞数与门相对丰度呈正相关念珠菌但与疣状。相反，平均每个绒毛嗜酸性粒细胞数与门的相对丰度呈负相关。拟杆菌(表)1).

上皮内T细胞的丰度与门的相对丰度呈负相关，在病原菌抗性和组织耐受性中起重要作用。蛋白细菌, 疣状恐怖症，Tenericutes，Synergistes和镰刀菌在回肠中消化(附图)。2)。上皮内T细胞丰度与未分类细菌的相对丰度呈较低的正相关，但其他无统计学意义。

在属水平上，绒毛中的平均T细胞数与其相对丰度呈正相关。奥尔森拉，酵母菌，土耳其杆菌和未分类属念珠菌和乳螺科与乳球菌，链球菌，琥珀酸杆菌，弯曲菌，肠杆菌和阿克曼西亚(补充图。3).

上皮内层的T细胞丰度也与许多相同的细菌属呈负相关(乳球菌，链球菌，琥珀酸杆菌，弯曲菌，肠杆菌和阿克曼西亚)。绒毛上皮内层的T细胞群与细胞的相对丰度存在一定的正相关关系。土耳其杆菌和未分类属龙须草科和念珠菌(补充图。4)。相反，绒毛嗜酸性粒细胞的丰度与任何细菌属均无明显的正相关，仅与细菌属呈中度负相关。布劳提亚和小球。

同样，肠绒毛巨噬细胞的丰度与回肠中特定细菌属的丰度没有显著的正相关，只有中度的负相关。洋底粒(补充图。3)。其余细菌门或属与出生至96 DOA之间小牛绒毛中任何免疫细胞的丰度均无显着性相关性(P>0.05)。

宿主基因在回肠中的表达

QPCR检测宿主免疫系统促炎和抗炎相关细胞因子基因的表达水平。趋化因子表达增加的一致趋势IL8在出生时观察到，在96 DOA时，这一增加达到统计学意义(图1)。4)。IL 1家族的促炎细胞因子在出生时也有类似的表达增加。表达IL1A与出生相比，7和14 DOA显著增加；IL1B表达在同一时间点显著增加(P < 0.05). In contrast to this pattern of activation, both anti-inflammatory genes analysed showed a distinct reduction in levels present from birth with a significant reduction in IL 10到7点。有趣的是，对编码细胞因子的基因检测到了两相反应模式。IL 33由出生至7岁及28岁分别显著增加(P < 0.05). Expression of the inflammasome sensor NLRP 37DOA时，基因相对于出生时也显著增加(P < 0.05). Pearson’s correlation analysis showed no strong relationships between the abundance of different immune cells and the expression of genes encoding cytokines in the ileal villi (Supplementary Fig. 5a)。然而，上皮内T细胞丰度与上皮内T细胞的表达呈正相关。IL1βIEL T细胞丰度与IL 10(补充图。5b)。

近年来，对反刍动物肠道微生物群的研究有所增加，目前已有大量关于微生物数量和细菌种群与环境有关的变化的信息。5,16,23,24,25。然而，与出生后的结构性适应有关的特定部位微生物群的建立，以及对新生儿免疫的影响，一般都是作为反刍动物生物学的不同方面来研究的。大多数研究新生小牛消化道发育个体发育的研究往往只关注一个时间点，通常是瘤胃，这是可以理解的，因为它约占成年动物整个胃的70%，是一种独特的消化环境。此外，根据粪便样本的分析，可以作为指示下消化道可能存在哪些微生物的代用品。26,27,28没有揭示区域规范，它限制了我们理解特定区域关系的能力。

初始定殖

初生小牛GIT最初的微生物定植是独一无二的，因为在这个阶段瘤胃是不起作用的，在这方面，绝大多数已知的都是从老鼠和其他单胃动物模型中推断出来的。虽然胃肠道的基本组织结构是在妊娠期形成的，但出生后立即发生快速的形态和功能发育。29,30。从据称在子宫内无菌的环境来看，出生后的小牛必须立即适应具有巨大微生物复杂性的子宫外环境。在一系列动物中，细菌和拟杆菌是众所周知的居住在阴道管大坝分娩前和占大多数的细菌出现在新生儿肠在出生后立即。31,32与本研究对回肠的研究结果一致。在这项研究中，费米克特在新生小牛中存在最高相对丰度，这与其他研究报告的幼仔回肠细菌分布一致。23也在山羊身上33。此外，在本研究中，在出生后立即在回肠中检测到的大多数其他微生物属于门。蛋白细菌, 疣状, 拟杆菌, 放线菌, 衣原体和协同。在成年母牛回肠中也发现了类似的成分。8。这种垂直传播表明，母体对早期肠道微生物组成有很强的影响。Yeoman等人将小牛腔内微生物区系与母体初乳、乳房皮肤、阴道刮片中的微生物区系进行比较，发现其中一个母牛源中也检出了46%的微生物。在本研究中，有8个家庭(链球菌科，疣状球菌科，巴氏杆菌科，肠杆菌科，弯曲菌科，藻科，植物科和银合欢科)在幼仔回肠检测到的所有细菌序列中，约占91%。链球菌科到目前为止最主要的9。在属一级，属的成员链球菌被发现占主导地位。有人认为，最初的殖民者，如链球菌和肠球菌利用肠道中的有效氧，创造一个厌氧环境，方便严格厌氧菌的回肠定植。5。在属的水平上，所有序列中的大部分属于6个属，它们都是厌氧菌、兼性厌氧菌或微嗜氧微生物，与肠道环境有关。最丰富的，链球菌(71.21%±4.47%)居住在幼仔的肠道中，在出生后24小时占主导地位。34.

在人类身上，类杆菌和双歧杆菌是否存在两个主要的肠道细菌属，对共同生物免疫耐受性的发展有贡献？35说明宿主微生物在早期肠道和免疫系统发育中的重要作用。然而，我们的数据表明类杆菌和双歧杆菌占细菌群落总数的不到1%，表明在定殖过程中有明显的物种特异性差异.在小牛身上，费米克特在回肠消化过程中始终是最丰富的门，对不同年龄组小牛之间细菌群落结构的总体差异贡献不大。虽然丰度很低，拟杆菌是造成新生小牛和周龄小牛细菌群落结构差异的主要原因，这些时间点之间的相对丰度增加。拟杆菌产生糖苷水解酶来降解甘氨酸，因此，出生后这种增加可能与宿主消化需求的增加有关。36。这表明宿主与微生物的相互作用以及促进胃肠道发育和刺激免疫耐受的机制可能是物种特异性的，因此不能假定人类或啮齿动物的研究结果适用于反刍动物肠道中发生的相互作用。

免疫发育

Peyer‘s斑块内的免疫细胞以及相关的上皮细胞都有模式识别受体，包括Toll样受体，这些受体可导致细胞因子的表达和宿主防御肽的产生。37正是这些功能分子决定了免疫反应的进程。然而，新生儿先天免疫反应的调节被认为是宿主在殖民初期避免不必要的炎症反应的一种机制。除了固有的机制外，抗炎的Th2型反应、过敏和T细胞缺失的发展都被认为有助于免疫耐受。38。这种免疫耐受对于让有益的非致病菌进行定植是很重要的。39,40，建立稳态，并保护粘膜组织免受有害的炎症反应。

NLRp 3是多蛋白天然免疫复合物的一员，被称为炎症小体，它能感知各种内源性和环境性刺激，从而调节稳态或损伤控制。41。增强表达NLRP 3提示它在回肠功能中起着保守的调节作用。巨噬细胞等先天细胞也是肠内稳态的关键调节因子。42它们在出生后立即在小牛回肠中被大量检测到。这里显示的巨噬细胞浸润绒毛固有层粘膜的巨噬细胞数量增加是细胞因子的一个可能来源，而这些细胞因子明显增加。IL1A和IL1B编码关键的炎症蛋白，在本研究中回肠增加，他们的表达是已知的通过NLRP 3炎症体介导。强效趋化IL8基因增加，在96 DOA时达到统计学意义。转化生长因子β是耐受性反应和抗炎细胞因子表达的强诱导剂。IL 107DOA明显减少，在出生时起一定作用。提示IL 10在调节新生儿回肠炎症中起一定作用。随着时间的推移，大量嗜酸性粒细胞流入回肠，在出生时发现了最大数量。在肠绒毛中，回肠最接近外部环境和微生物群落的部分，嗜酸性粒细胞约占宿主细胞总数的三分之一。虽然在新生儿回肠绒毛中存在嗜酸性粒细胞的情况以前没有在任何物种中报道过，但最近已经报道了这些细胞的调节亚群。嗜酸性粒细胞已被证明对肠道微生物群的调控和调节性T细胞的发育具有重要意义。43,44。对嗜酸性粒细胞功能的新认识正在开始出现，包括它们在肠道中的作用。45作为稳态的关键调节因子46。IL-33是嗜酸性粒细胞招募和调节性T细胞增殖的关键介质。47，从而促进Th2偏倚的免疫反应。因此，这种细胞因子在牛体内的表达明显增强可能在这方面发挥作用。

这种先天细胞的涌入和回肠中免疫细胞的明显存在支持了先前的报道，即回肠是哺乳动物肠道中免疫微生物相互作用的关键部位之一。13,48,49,50。从适应性细胞的观点来看，新生小牛回肠绒毛中的T细胞相对丰度较低，但在7、14和21 DOA时T细胞数量显著增加。在我们的研究中，嗜酸性粒细胞和T细胞的数量呈反比关系，这可能是由嗜酸细胞群体调节的。51.

宿主-微生物相互作用

委员会成员拟杆菌在诱导调节性T细胞促进上皮修复，促进对微生物的耐受性，以及启动对自身和细菌抗原的免疫反应方面有作用。52。与这些发现相一致，在目前的研究中，记录到相对丰富的拟杆菌回肠中T细胞的丰度与回肠呈正相关。肠上皮内的T细胞通过细胞毒性T细胞相关和抗炎分子，提供了抵御屏障内侵入体的第一道防线，并通过细胞毒性T细胞相关和抗炎分子与病原体抗药性和组织耐受性相联系。53,54。上皮内淋巴细胞调节失调与黏膜屏障完整性丧失、感染易感性及慢性炎症过程有关。在本研究中，回肠上皮内T细胞在7，28 DOA时明显增加。波动可能代表着试图平衡由微生物涌入引发的细胞毒性反应与组织耐受反应之间的平衡，以避免组织的长期炎症和随后的组织损伤。

回肠组织的独特物种特征，特别是在Peyer‘s贴片中，已经从小鼠和人之间的细胞组成的角度来描述。13。这里首次记录了与新生牛回肠的初始定植和适应相关的与年龄相关的结构、细胞和分子变化。新生反刍动物在出生后的头几周内对各种病毒和细菌肠道感染高度敏感。55肠道微生物群在启动宿主git的形态和免疫发育中起着至关重要的作用。56。在这里，我们记录了大量天然免疫细胞(嗜酸性粒细胞和巨噬细胞)在回肠中的存在，作为宿主-微生物相互作用和新生儿免疫系统教育的重要门户。新生儿早期免疫系统发育不良可能对终生免疫产生负面影响。57,58因此，这些综合发现为今后的干预研究提供了一个重要的基线。NLRP 3炎症小体的适当激活和回肠组织中嗜酸性粒细胞的扩张可能对调节出生后立即发生的不适应性炎症很重要，值得进一步研究。

实验设计

上述所有程序均经马达加斯加动物伦理委员会批准，并根据1876年“动物虐待法”和1994年欧洲共同体条例(“1876年动物虐待法修正案”)，在爱尔兰卫生产品管理局的实验许可下进行。这项研究是作为旨在研究早期瘤胃微生物群的建立和发展的更大研究的一部分而进行的。这个动物模型的全部细节最近已经出版了。59。简单地说，商业购买的18个月的发情同步性的阿伯丁安格斯小母牛(n=21)被人工受精与冷冻解冻的精液从一个阿伯丁安格斯陛下提供70头小牛。小牛被随机分配到六个年龄组中的一个。本研究采用0(n=11)，7(n=8)，14(n=9)，21(n=9)，28(n=9)，96日龄(n=9)的安乐死后的小牛。小牛出生于四个复制期：2014年12月(n=13)、2015年1月(n=27)、2015年5月(n=14)、2015年7月(n=11)，并尽可能均匀地分配给所有复制牛。怀孕的小母牛被关在一起，直到产犊前，用2毫升前列腺素F2诱导产犊。α模拟(发情期，默克)，以方便交错的产犊时间表。未被分配到D0处理的小牛被允许在出生后48小时内哺乳他们的大坝，在此点上，他们被逐个移除并被关起来。然后用5L/d的牛奶替代物人工饲养小牛，作为两种等量饲料提供，并提供来自7 DOA的浓缩物。96头安乐死犊牛在第8周断奶，连续3天每天消耗1公斤浓缩物。随后，向他们提供每天2公斤的浓缩物，并向他们提供水和干草。

安乐死后，取出胃肠道，用无菌和无核糖核酸酶(Rnase)仪器采集回肠内容物，并立即冷冻在液氮中。回肠横截面积用PBS冲洗，冷冻在液氮中。这些标本随后保存在−80°C，回肠的横截面固定在10%中性缓冲福尔马林中。在安乐死后20 min内采集组织和含量样本。

DNA提取与微生物群落分析

在取样开始之前，房间被清理过，每只小牛之间的区域再次被清洁。每头小牛用无菌手术刀分离取样。所有的表面和取样设备都经过沸水、乙醇和RNase抑制剂处理，然后再对每只小牛的样品进行处理。所有标本均用无菌容器保存。第0天小牛出生后立即取样，不与奶牛或外界环境进一步接触。

从37只动物回肠内容物中提取DNA，分别在6个时间点：0(n=8)、7(n=5)、14(n=5)、21(n=6)、28(n=10)和96(n=3)DOA。60。用纳米滴分光光度计(热学，沃尔塔姆，MA)测定DNA浓度和纯度，所有样品的260/280值>1.8,260/230值>2。纯化后的DNA保存在−20°C。

利用Kozich等人所描述的方法，在Illumina MiSeq平台(Illumina，San Diego，CA)上用扩增序列测定细菌群落结构。(2013年)。简单地说，将纯化的dna的1μL加入到96孔PCR板上，其中包含17μL的Accupripfx超级混合物(Invitrogen，ThermoFisher Science，都柏林，爱尔兰)，以及针对16 SrRNA基因V4区的引物集的2μL。61。PCR条件为：95°C热启动2 min，95°C变性20 s，55°C退火15 s，72°C延伸5 min(30次)，72°C延伸10 min。PCR产物在1.2%(w/v)琼脂糖凝胶(瑞士巴塞尔罗氏诊断)上显示，然后根据制造商的指示，用SequalPrep归一化板试剂盒(Invitrogen)将PCR产物纯化，用5μL PCR产物建立扩增池。然后使用Qubit荧光计和dsDNA试剂盒(Thermo Fisher Science)确定池的浓度，以确保至少有100纳克的DNA。然后，放大器池被送到利物浦大学基因组研究中心(利物浦，英国)，在IlluminaMiSeq平台上进行测序。在扩增序列的文库制备中包括阴性对照。PCR后，与所有其他样品一样，阴性对照物也进行了凝胶电泳鉴定，结果表明，在此之前，试剂和材料都没有被引入污染物。

MiSeq测序数据最初是使用mothur程序v.1.32.1处理的。62。Illumina适配器序列被裁剪ver.2.1.1使用选项-O3。63。镰刀口径1.264对数据进行进一步修整，质量评分为≥20，去除修剪后的读数<10 bp。然后，每一次读取被削减到最大275 bp，并且模糊的碱基被删除。含有8个碱基的均聚体序列被丢弃。修剪后，将相同序列分组为唯一序列。用UCHIME算法识别嵌合序列65然后被移走。使用聚类命令和平均邻域算法将序列分配给OTU。随后所有基于OTU的分析都是使用0.03的截止值进行的。通过将处理后的数据与有关细菌和古菌的silva 128数据库进行比较，对所有剩余的对齐序列进行分类(arb-Silva.de/Silva-License-Information)。66).

组织学

福尔马林固定后，回肠组织随着乙醇浓度的增加而脱水(50-100%)，使用自动处理器(组织-TEK、VIP、Sakura、Finetek)和石蜡包埋。4m切片用微电脑(Leitz RM 2255)切割，安装在玻璃玻片上，用Leica自动染色仪(Leica ST 5020)染色苏木精和伊红(H&E)，用光学显微镜(Leica DM 3000)进行组织学检查。

免疫组织化学(IHC)

为鉴定免疫细胞，采用免疫组织化学(IHC)技术，采用免疫组织化学(IHC)技术，采用免疫组织化学方法，采用ImmPRESS HRP抗山羊IgG(Iba 1)、抗兔IgG(CD3)或抗小鼠IgG(Pax5)(过氧化物酶)聚合物检测试剂盒(载体实验室，英国彼得堡)检测免疫细胞。特异性抗巨噬细胞标记Iba 1(AIFI/Iba 1山羊抗人多克隆(内)(未结合)抗体(寿命生物科学，Nottingham，UK)，无抗原回收，稀释1/500)，T细胞标记CD3(CD3多克隆兔抗人抗体)，柠檬酸缓冲液在pH6热处理20 min(稀释1/300)，B细胞标记物Pax5(BD生物科学，牛津，英国)，单克隆抗体，用柠檬酸缓冲液在pH 6热处理20 min(稀释1/40)。

所有切片，不论是否有抗原提取，均用H冲洗。2O与内源性酶块3%(v/v)过氧化氢孵育30 min。在马血清(试剂盒)中用PBS冲洗30 min，然后用一次抗体孵育。切片用PBS冲洗，用ImmPRESS山羊、兔或小鼠血清孵育30 min，再用底物显色剂3，3‘-二氨基联苯胺(民建联)冲洗。民建联在大约40年代后被洗掉，切片被苏木精反染，冲洗后脱水，然后盖子滑倒。

绒毛测量和细胞计数

在40×1cm的回肠切片上测量绒毛的长度和宽度，每段测量10个良好的绒毛长度和宽度，并对10个视野进行频率评估。绒毛高度测量从绒毛的顶端到隐窝-绒毛的交界处。在绒毛长度中点，从外上皮边缘测量绒毛宽度。以裂片核和亮红色大胞浆颗粒、巨噬细胞和淋巴细胞(经IHC鉴定)，对固有层粘膜进行400×放大镜下的嗜酸性粒细胞检测。在每例病例中，每种细胞类型的细胞被计数为5个具有代表性的全长绒毛。在所有病例中均选择同样大小的绒毛，以便在不同年龄组之间进行比较。此外，粘膜上皮衬里有T细胞计数。分别评估穹顶区细胞的组成。

RNA提取与cDNA合成

冷冻回肠组织样本在TRIzol(生命技术，英国佩斯利)中使用Pro科学匀浆模型PRO2 0(Pro Science Inc.，Oxford，CT，USA)进行匀浆，3s脉冲重复10次。然后，用RNeasePlus微型试剂盒提取和清洗RNA(英国曼彻斯特奇根有限公司)。

用纳米荧光分光光度计ND-100测定260 nm处的RNA质量和量，所有样品的吸光度均在1.8以上。在Agilent生物分析仪2100(爱尔兰都柏林Agilent Technologies爱尔兰有限公司)上使用RNA 6000 Nano实验室芯片试剂盒进一步评估RNA质量，所有样品的RIN值在8~10之间。根据制造商的指示，用高容量cDNA反转录试剂盒(应用生物系统，福斯特市，美国)合成cDNA。2g总RNA经多重Scribe逆转录酶反转录成cDNA。用纳米滴分光光度计在260 nm处测定转化cDNA的量，并将其保存在-20°C。

定量PCR

参与免疫反应的基因，特别是参与招募和促进免疫细胞的细胞因子的基因被靶向，并列在补充表中。5。用引物3设计了定量PCR(QPCR)引物，并通过BLAST对引物进行分析，验证其特异性及与牛序列的同源性。商业上合成了参考基因和目标基因的引物(Sigma-Aldrich，爱尔兰，都柏林，爱尔兰)。在回肠组织中检测到5个基因，它们都促进了T细胞或巨噬细胞中细胞因子的表达。用qPCR方法检测基因表达水平，用GeNORM计算的M值评价表达稳定性。67.

采用ABI 7500快速实时PCR系统，采用SYBR绿色主混合物(应用生物系统，英国Warrington)进行实时PCR.在PCR管中进行了反应，总体积为20μl，cDNA为2lcDNA，10 l SYBR绿色主混合物，7l核酸酶不含H。2O和1l正、反向底漆混合。各检测方法的热循环条件不变，初始变性步骤95°C 15 min，95°C变性5 s，60°C退火40 s，每周期结束时检测到SYBR绿色荧光，跟踪PCR产物的数量。通过从cDNA的两倍系列稀释液中建立一条标准曲线，计算每个基因的qPCR反应效率。对每个基因，利用Genex 5.2.1.3(瑞典哥德堡多重D分析AB)对原始CT值进行效率校正，对参考基因进行归一化处理，计算CT值相对于最大CT值的数量，并对CT值进行log变换。

统计分析

在R软件环境下进行方差分析(ANOVA)，并在R软件环境下进行方差分析(ANOVA)，分析牛回肠从出生到96天绒毛长度、宽度、频率和免疫细胞数量的差异。取小牛回肠固有层免疫细胞(嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和T细胞)计数，并进行年龄组间的比较。用单因素方差分析(V7.02)检测小牛回肠中基因表达水平的显着性差异(v7.02)。对于细菌数量和免疫细胞随时间的变化，使用相同的软件进行了双向方差分析。

计算了各年龄组的细菌门、科、属丰富度、均匀度和多样性(Shannon-Wiener指数和Simpson指数)。Anova和Posthoc，Tukey HSD测试是在R软件环境中进行的，使用“lsmeans”软件包来分析不同方法之间的差异。多变量分析采用引物E v.7软件，采用基于距离的置换多元方差分析(PERMANOVA)。68。根据标准化的、第四次根变换的丰度数据，利用Bray-Curtis相似点构造样本相似性矩阵.然后进行PERMANOVA检验无效假设，即在9999种可能的排列基础上，微生物群落结构在α=0.0 5的显着水平上没有差异。构造了非度量多维尺度(NMDS)图来可视化数据。用Bray-Curtis相似性法计算相似性百分比(SIMPER)，以评价各门、科、属对群落结构差异的贡献程度。当P≤0.0 5时，疗效和差异均有显着性意义。

通过皮尔逊相关系数(R)分析，确定不同年龄点小牛的绒毛免疫细胞群水平与回肠上皮内层之间是否存在显著的相关性，以及导致各日龄小牛细菌群落结构差异的最丰富的细菌门和属。该方法还可用于确定小牛回肠绒毛的免疫细胞群分布与不同年龄点细胞因子的基因表达水平之间是否存在显著的相关性。