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CD 103+CDC 1与内源性CD8+T细胞是提高cd40L高表达car T细胞抗肿瘤功能所必需的

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发表时间:2020-12-04 10:08作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

在特定环境下,过继嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗癌症需要进一步的改进和优化。我们先前的结果表明,CD40L过表达的CAR T细胞动员内源性免疫效应因子,从而提高抗肿瘤免疫能力。然而,这种保护作用所需的细胞数量仍有待确定。在这里,我们通过分析Batf 3−/−缺乏CD 103的小鼠+传统的树突状细胞1型(CDC 1)亚群体对抗原交叉表达很重要,CD40L过表达的CAR T细胞在没有cDC1s的情况下引起抗肿瘤反应受损。我们进一步发现cd40L高表达的car T细胞刺激肿瘤驻留的cd11b。CD 103双阴性CDCs在野生型小鼠中增殖分化为cDC1s。最后,再挑战实验显示内源性CD8。+在这种情况下,T细胞是保护抗肿瘤记忆所必需的。我们的研究结果证明了CD40L过表达的CAR T细胞对天然免疫细胞和适应性免疫细胞的刺激作用,并为利用CD40L过表达的CAR T细胞改善免疫治疗反应提供了理论依据。

导言

嵌合抗原受体(Car)是与细胞外抗原识别域和胞内T细胞刺激域合成的融合蛋白,它允许T细胞介导的表面分子靶向肿瘤细胞,而不依赖于肽-主要组织相容性复合物(Pmhc)的表达。1。以CD 19为靶标的CAR T细胞在复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者中表现出显著的疗效,导致抗CD 19 CAR T细胞治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤和小儿B-急性淋巴细胞白血病的批准。2,3。抗CD 19 car T细胞输注后,有很大一部分患者可获得完全缓解,但有相当一部分复发的CD 19阴性患者和其他患者则完全没有反应。2,4。这一观察证明,改进的T细胞免疫疗法可以靶向和消除恶性肿瘤细胞.

大多数T细胞免疫疗法的重点是直接增加肿瘤靶向T细胞的数量,方法是过继地将T细胞转移到患者体内,去除对内源性多克隆T细胞群起作用的免疫抑制检查点,通过双特异性抗体将内源性T细胞群重新定向到肿瘤,和/或通过允许超生理抗肿瘤T细胞反应的CARS基因工程T细胞。5。所有这些策略在T细胞水平上直接操纵和重定向免疫反应。我们已经证明cd40L过表达的car T细胞在体内具有增强的抗肿瘤作用,许可抗原提呈细胞(Asc),激活内源性T细胞,并保护小鼠免受car抗原阴性的肿瘤攻击。6。这是一个例子,调动免疫效应,除了过继转移的CAR T细胞,以消除肿瘤细胞。然而,是否有必要将CD40L过表达的CAR T细胞的信息传递给内源性T细胞,以及保护小鼠免受CAR抗原阴性肿瘤生长的影响,还有待于进一步研究。

传统的dcs(Cdcs)与浆细胞样dc不同,是最有潜力的adc,可进一步细分为cdc 1和cdc 2。7。CDCs在人和小鼠中都表达高水平的MHC-Ⅱ和CD11c。转录因子BATF 3、IRF 8和ID2对cdc 1的发育至关重要,而cdc 2则依赖于转录因子RELB、IRF 4和zeb 2。8。Cdc 2主要参与启动CD4。+T细胞对线虫和病毒感染的反应9,10。到目前为止,人们对cdc 2在免疫抗肿瘤反应中的作用的认识还很有限,但是最近的一项研究已经证实了cdc 2在小鼠和人类中的作用及其参与cd4。+T细胞活化11.

CDC1s在淋巴组织和非淋巴组织中分别表达表面CD8α和CD 103(整合素αE)。淋巴组织cdc 1和非淋巴组织cdc 1具有非常相似的转录谱,在交叉提呈抗原对细胞毒性CD8的适应性免疫应答中起着核心作用。+T细胞在抗病毒和抗肿瘤反应中的作用7,12,13。在人类中,cDC1s是通过CD 141/BDCA 3的表面表达来识别的。14与匹配的健康组织相比,肿瘤组织似乎被排除在外15。他们在肿瘤排斥反应中的作用进一步得到以下发现的支持:高水平的肿瘤内BDCA 3+Cdc 1s与黑色素瘤患者抗pd-1免疫治疗反应的相关性16。因此,一些临床前的肿瘤移植研究旨在增加肿瘤内cdc 1s的积累,并注意到NK细胞来源的fms类似酪氨酸激酶3配体(Flt3l)和其他cdc 1趋化剂可刺激cdc 1向肿瘤募集,并控制肿瘤的进一步生长。16,17。重要的是,肿瘤内cdc 1s的积累改善了CD8。+T细胞增殖与抗PD-L1治疗的反应18.

T细胞介导的抗肿瘤反应有很好的特征,并且可以基于对非突变的肿瘤相关抗原或从突变蛋白中提取的新抗原的识别。19,20。抗原是由CD4的TCR识别的。+或CD8+T细胞分别出现在MHC-Ⅱ或MHC-Ⅰ上.CD8的重要性+通过pmhc-i:tcr相互作用,tcr介导的肿瘤控制被观察到肿瘤细胞mhc-i或β2 m缺失,两者都导致肿瘤细胞表面没有抗原提呈,导致肿瘤免疫消退和随后的肿瘤外生。21,22。尽管如此,在接受T细胞动员免疫疗法治疗的转移性疾病患者中,已经描述了长达10年的长期存活情况。23。在长期随访中,用抗CD 19 CAR T细胞治疗的B-所有患者也有类似的结果。4.

然而,许多患者在较晚的时间点仍会出现CAR抗原阴性的疾病复发.因此,本研究基于CAR T细胞的高细胞毒性效应功能,以及细胞毒性非CAR T细胞识别肿瘤细胞特异性抗原的招募,探索了一种持续的抗肿瘤反应。我们证明,m1928z-CD40LCAR T细胞能诱导长寿命免疫细胞的抗肿瘤记忆,从而在临床前环境下提供保护,防止CAR抗原阴性肿瘤的生长。

结果

M1928z-CD40L car T细胞上调肿瘤所在CDCs上的CCR 7,使肿瘤内DC群向CD11b方向倾斜CD 103DN和CD11bCD 103+Cdc 1表型

我们以前描述过在体内通过cd40L过高表达car T细胞在淋巴组织中获得许可,但在肿瘤组织中则没有,这在过继细胞转移后7天最为明显。6。这促使我们对ACT后的早期时间点进行分析,量化肿瘤和脾脏的DC募集(图一)。1A)。M1928z-cd40L的car T细胞治疗并没有增加大量mhc-ii的招募。+CD11c+随着时间的推移,DCS转移到肿瘤组织上(见图)。1B)。与m1928z car T细胞处理相比,CD40L过表达的car T细胞诱导脾MHC-Ⅱ的积累。+CD11c+DCS后第7天ACT(图)。1C)。除脾脏外,次级淋巴器官也由淋巴结组成,免疫细胞在固有免疫系统和适应性免疫系统成员之间相互作用。MHC-IICD11cINT迁移性DC(MigDC)将抗原从周围组织转移到引流淋巴结,并将抗原呈递到循环T细胞进行活化。13,24,25。M1928z-CD40LCAR T细胞治疗增加了肿瘤引流淋巴结(TdLNs)中migDC的数量。1D)。MigDC的增加是通过CD 40/CD40L相互作用指示的,如CD 40−/−小鼠在m1928z-CD40L CAR T细胞治疗后缺乏migDC的增加(图1)。1D)。通过分析这些不同的解剖部位,我们发现m1928z-CD40LCAR T细胞治疗对DC肿瘤浸润数没有影响--无论是在早期,还是在较晚的时间点--直到ACT后一周才影响淋巴室。

图1:m1928z-CD40L CAR T细胞上调肿瘤常驻树突状细胞(DC)上的CCR 7,使肿瘤内DC向CD11b-CD 103-双阴性(DN)和CD11b-CD 103+cDC 1表型倾斜。

a实验布局b, c). b, cMHC-II绝对数+CD11c+DCS(CD 45)+GR1CD 19CD3e前门)在肿瘤中(b)和脾脏(b)A20.GL荷瘤小鼠(a)。每个点代表一个鼠标(第1,2天:n=3/组;第3天:n=6/组;第7天:n=6-7/组)。数据以平均±SD表示。p-数值是从一个未配对的双尾学生那里得到的。t测试一下。d载瘤野生型(WT)或CD 40−/−小鼠3×106CAR T细胞静脉注射(i.v.)。MHC-II的百分比CD11cINT第7天对肿瘤引流淋巴结(TdLNs)中的迁移DC(MigDC)进行分析。将数据绘制为平均值±SD,并从两个独立的实验(WT:n=6/组;CD 40−/−: n=4/组)。p-值采用双向方差分析。eA20.GL荷瘤小鼠3×106CAR T细胞I.V.并在CD11b上分析CCR 7在第7天的表面表达。CD 103双阴性(DN)(橙色),CD11bCD 103+Cdc 1(绿色)和CD11b+CD 103+Cdc 2(蓝)在肿瘤中的分布。灰度直方图,流减一。fA20.GL荷瘤小鼠3×106CAR T细胞I.V.和CD11b的百分比CD 103DN(橙色),CD11bCD 103+Cdc 1(绿色)和CD11b+CD 103+第7天分析肿瘤中的cDC 2(蓝)群。gA20.GL荷瘤小鼠3×106CAR T细胞I.V.和CD11b的百分比CD8αDN(橙色),CD11bCD8α+Cdc 1(绿色)和CD11b+CD8α第7天对脾脏中的cDC 2(蓝)群进行分析。hA20.GL荷瘤荷瘤小鼠的cDC 1/cDC 2比值在荷瘤小鼠的肿瘤和脾脏中绘制。f, g). iA20.GL荷瘤细胞中cDC 1/cDC 2比值的研究CD 40−/−小鼠在接受3×10后的第7天被绘制成图。6汽车T细胞。数据(ei)绘制为均值±SD,由两个独立的实验汇总而成。每个点代表一个鼠标(eh, n=7/组;i, n=4/组)。p-数值是从一个未配对的双尾学生那里得到的。t测试一下。NS,无意义;静脉;再直流电,留置直流。源数据作为源数据文件提供。

传统的DC可进一步分为cDC 1和cDC 2亚型。这两个亚群都在抗肿瘤免疫反应中发挥作用,它们控制T细胞免疫。18,26。因此,我们研究了m1928z-CD40L CAR T细胞处理小鼠的DC亚群。CDC 1和cDC 2群体可以根据表面标记的表达进行免疫表型分析。通过常规dc标记mhc-ii和cd11c的高表达鉴定,cdc 1在非淋巴组织中表达整合素CD 103和cd11b。,而cdc 2是CD11b。+CD 103(补充图。1A)。在淋巴组织中,cdc 1细胞失去CD 103表达,而cdc 2细胞维持CD11b。+CD8α+状况(附图)1B)。最近,CCR 7-表达CD 103+Dcs被鉴定为肿瘤部位与tdLN之间的转运,转移肿瘤抗原,启动T细胞抗肿瘤反应。25。趋化因子受体CCR 7引导DC向LNS转运。27我们观察到ccr 7在所有三位肿瘤住院患者mhc-ii上的表达增加。+CD11c+M1928z-CD40L CAR T细胞治疗后的DC群体:CD11bCD 103DNS,CD11bCD 103+CDC1s和CD11b+CD 103Cdc2s(图1.1E)。提示m1928z-CD40LCAR T细胞可通过诱导肿瘤患者DC上CCR 7的表达上调而使DC向脾脏和tdLNs吸收。

除了上调CCR 7表面水平的表达外,我们还想研究m1928z-CD40L CAR T细胞处理是否影响肿瘤内CDC的三个亚群体的相对组成。CD40L-CAR T细胞治疗增加了DN的数量,维持了cDC 1的数量,使cDC 2的比例相对降低(图1)。1F和补充图。1C)。这些变化在脾和tdLN疾病控制中心人群中不明显(见图)。1g和补充图。1D-F)。这些发现记录了m1928z-CD40L CAR T细胞治疗后肿瘤组织树突状细胞室的变化,其中m1928z-CD40L CAR T细胞使肿瘤内cDC 1/cDC 2比值偏向于cDC 1群体(图1)。和补充图。1C)。缺乏cdc 1/cdc 2比率CD 40−/−小鼠体内显示m1928z-CD40L CAR T细胞通过CD 40/CD40L相互作用介导这一作用。1I)。这些观察突出了m1928z-CD40LCAR T细胞对肿瘤内DC亚群的影响,并提出了其与抗肿瘤反应的相关性问题。

M1928z-CD40L CAR T细胞抗肿瘤反应的改善需要有Batf 3-表达的cdc 1

其次,我们要防止cDC 1在肿瘤中的积聚,从而评估其在m1928z-CD40LCAR T细胞介导的抗肿瘤反应中的必要性。转录因子batf 3在cdc 1s的发育中起着重要的作用,因为小鼠缺乏cdc 1。Batf 3CD8α缺乏表达+DCS与肿瘤驻留CD 103+使他们更容易感染CD8+T细胞控制的病毒感染与肿瘤生长12,26。我们挑战了野生型和Batf 3−/−GFP小鼠+荧光素酶-表达的A20淋巴瘤细胞(A20.GL),如预期的,没有CD11b。CD 103+肿瘤中存在cdc 1细胞Batf 3−/−老鼠(图1.2A)。正如我们之前所报告的6,m1928z-CD40L CAR T细胞可增加20只荷瘤野生型小鼠的存活,而不需要事先进行淋巴滤过(图1)。2B)。随后与CAR T细胞的治疗显示m1928z-CD40L CAR T细胞在Batf 3−/−小鼠能提高荷瘤小鼠的存活率(图一)。2B),证明cDC 1群体并不是体内m1928z-CD40L CAR T细胞功能的唯一负责者。然而,它们在野生型小鼠中的存在显着地改善了小鼠的存活率,并允许40%的小鼠通过m1928z-CD40LCAR T细胞完全清除肿瘤(图一)。2B)。结合在一起,m1928z-CD40L CAR T细胞要充分发挥其抗肿瘤作用,就需要有cDC1s。

图2:m1928z-CD40L CAR T细胞抗肿瘤反应的改善需要有Batf 3-表达的cDC 1。

aMHC-Ⅱ的流式细胞术轮廓图+CD11c+肿瘤中DC的分布Batf 3−/−小鼠静脉注射A20.GL后第14天。盖茨突出CD11b+CD 103Cdc 2(蓝色)和CD11bCD 103+CDC 1(绿色)细胞。占CD11b的百分比CD 103+在WT和Batf 3−/−老鼠被画在右边。数据以平均±SD表示。每个点代表一个鼠标(WT:n=4;Batf 3−/−, n=3)。p-值是使用未配对的双尾学生的t测试一下。bBALB/c WT或Batf 3−/−1×10小鼠6A20.GL细胞经3×10处理6第7天有T细胞。p-数值由双尾对数秩(mantel-Cox)检验确定.给出了两个独立实验的总结。源数据作为源数据文件提供。

Cdc 2s的特殊耗竭仍然具有挑战性,因为到目前为止还没有发现cdc 2s完全表达的标记。28。利用cd11c驱动的cre重组酶表达来有条件地删除cdc 2转录因子并不限于dc室,因为cd11c也在巨噬细胞和淋巴细胞中表达。29,30。这就需要进一步开发专门消耗cdc 2的新型小鼠模型,以便更好地了解它们在我们的系统和其他免疫环境中的作用。

M1928z-CD40L car T细胞刺激肿瘤驻留CD11bCD 103DN CDCs增殖,上调IRF 8,分化为cDC1s

接下来,我们想研究不同的CAR T细胞治疗对CDC亚群的影响,如图所示。1。CDC1s在所有分析的组织(脾脏、肿瘤、tdLN)中一致表达最高水平的共刺激分子CD 86。2)。M1928z-CD40L CAR T细胞处理后,cDC1s表面CD 86水平升高,而脾DN和cDC 2细胞CD 86表达升高(补充Fig)。2B)。脾CDCs的这一许可与图中所示的脾DC数目的增加相匹配。1C,而肿瘤居住的CDCs则保持不变(图1)。1B和补充图。2C),暗示CDCs对m1928z-CD40LCAR T细胞的治疗有不同的反应,这取决于它们的组织部位。

接下来,我们将重点放在外周分化的CDC人群中,评估IRF 8转录因子在肿瘤源性CDC人群中的蛋白表达(如图所示)。3A)。在外围,IRF 8控制着终末分化的cdc 1s的存活和功能。31,32。此外,IRF 8在CD11b中的表达增加CD 103DN细胞可促进其分化为成熟的CD 103细胞。+CDC1s18。因此,我们假设CD40L-CAR T细胞处理通过刺激DN细胞增殖、上调IRF 8并分化为cDC1s,使cDC 1/cDC 2比值向cDC 1群体倾斜。我们特别注意到在CD40L-CAR T细胞处理的小鼠DN细胞中,IRF 8(DNd-cDC 1分化读出)和Ki-67(增殖读出)被上调(如图所示)。3B)。肿瘤源性DN细胞中Ki-67表达增加也与CD40L-CAR T细胞治疗小鼠肿瘤中DN细胞数量的增加有关(图一)。1F),表明CD40L-CAR T细胞治疗后DN细胞收到增殖信号.有趣的是,来自tdLNs的脾DN细胞和DN细胞没有上调Ki-67或IRF 8。3C,d)。总的来说,tdLN CDCs没有表现出刺激的表型,这是CD 86或Ki-67上调的结果(补充图)。2D-G)。提示CDDN在m1928z-CD40L治疗后具有一定的肿瘤特异性作用。

图3:m1928z-CD40L CAR T细胞刺激肿瘤细胞CD11b-CD 103-DN CDCs增殖,上调IRF 8,分化为cDC1s。

aIRF 8在CD11b中的表达CD 103双阴性(DN)(橙色),CD11bCD 103+Cdc 1(绿色)和CD11b+CD 103+Cdc 2(蓝)在A20.GL荷瘤小鼠肿瘤中的作用。FMO,流量减1。bdKi-67和IRF 8在CD11b中的表达呈流式细胞术轮廓图CD 103DNCDCs在肿瘤中的表达(b)、脾脏(c)和肿瘤引流淋巴结(TdLN)(d)A20.GL荷瘤小鼠在CAR T细胞治疗后第7天。占KI-67的百分比+IRF 8+DNCDCS是从两个独立的实验中总结出来的。n=7/组)。eCD45.2+A20.GL荷瘤小鼠3×106CAR T细胞I.V.和CD 45.2+CD11bCD 103流式细胞术(FACS)于第3天从肿瘤组织中分离出DNCDCs。分类CD 45.2+DN细胞在CD 45.1上的体外培养+骨髓基质层3天及CD11c百分比+CD 103+CD45.2中的cDC1s+细胞分析。显示的是具有代表性的等高线图和CD11c百分比的量化。+CD 103+Cdc 1每个点代表一个体外培养。数据收集自两个独立的实验(m1928z,n=5;m1928z-CD40L,n=6)。f, gKi-67在cd11b中以等高线表示。CD 103+CDC1s(f)和CD11b+CD 103Cdc2s(gA20.GL荷瘤小鼠治疗CAR T细胞后第7天。占KI-67的百分比+细胞是通过两个独立的实验总结出来的。n=7/组)。数据(bg)作图为均值±SD。p-数值是从一个未配对的双尾学生那里得到的。t测试一下。NS,没有意义。源数据作为源数据文件提供。

接下来,我们要评估IRF 8在DN人群中的上调是否导致DN到cDC 1的分化。为解决这一问题,我们从m1928z和m1928z-CD40LCAR T细胞瘤中分离出DN细胞,体外培养3d,评价其分化为cDC1s的潜能。M1928z和m1928z-CD40L小鼠的DN细胞体外分化为cDC1s,而m1928z-CD40L的Car T细胞处理小鼠的DN细胞分化为cDC1s的速率明显高于m1928z的CAR T细胞处理小鼠(如图所示)。3E)。重要的是,cdc 1和cdc 2细胞维持其CD 103。+和CD 103表型,分别,不论先前的刺激(补充图。3A,B)。这意味着CD40L-car T细胞通过刺激CD11b而影响肿瘤内cdc 1/cdc 2比值。CD 103肿瘤组织中DN细胞的增殖、cDC 1介导的IRF 8转录因子的上调以及DN CDCs向cDC1s的分化。

如Ki-67染色所示,m1928z-CD40L CAR T细胞处理除能促进DC1s和cDC2s的增殖外,还能促进cDC1s和cDC2s的增殖。3F,g)。奇怪的是,CD40L-CAR T细胞治疗后,所有肿瘤居民CDC亚群的增殖增加并没有导致绝对CDC数量的增加(如图所示)。1B),这意味着增殖的肿瘤常驻CDCs从组织迁移到淋巴组织结构,在那里它们存在较高的数目(如图所示)。1C,e).

CD8+T细胞是m1928z-cd40L car T细胞介导的抗抗原阴性肿瘤生长的必需细胞。

随着肿瘤浸润性CAR的启动增加+和汽车T细胞6M1928z-CD40L CAR T细胞抗肿瘤反应减弱Batf 3−/−老鼠(图1.二维空间),我们假设m1928z-CD40LCAR T细胞通过cDC 1细胞发挥肿瘤浸润T细胞的作用。由于cdc 1细胞交叉提呈抗原对CD8的已知功能+T细胞,我们重点分析了CD8。+T细胞室如预期,在A20.GL肿瘤挑战和CAR T细胞治疗后,CAR内格CD8+M1928z-CD40LCAR T细胞处理小鼠体外佛波酯13-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)/离子霉素刺激(附图)后产生更多的干扰素γ。4A,B)。然而,在没有cdc 1细胞的情况下,cdc 1细胞的γ生成增加是持续的。Batf 3−/−小鼠(附图)4A,B)。这表明m1928z-cd40L car T细胞在体内提供了一个允许内源性CD8的环境。+T细胞独立于cDC 1细胞独立产生干扰素γ。

评估cDC 1细胞的缺失是否对过继转移的T细胞有任何影响,这可能是其抗肿瘤反应受损的原因之一。Batf 3−/−小鼠CD3分泌干扰素γ+小汽车+评估T细胞。同样,m1928z-cd40L car T细胞较m1928z car T细胞检测到更多的干扰素γ,这种差异不受cdc 1细胞基因缺失的影响。Batf 3−/−小鼠(附图)4C,D)。这表明cdc 1细胞对两种CAR细胞中的效应细胞因子的产生均无影响。内格和汽车+M1928z-CD40L CAR T细胞处理小鼠T细胞。

用非特异性活化T细胞后,用二酰甘油类似物PMA和钙离子载体离子霉素进行细胞外细胞因子染色,评价细胞因子的产生。这些刺激物共同导致T细胞蛋白激酶C激活(通过PMA)和钙释放(通过离子霉素),并激活TCR诱导激活下游的T细胞。因此,对pma/ionomycin刺激的细胞群的分析提供了一般细胞激活电位的读数,而不是功能细胞特异性肿瘤识别的读数。

最后,我们要确定治愈的小鼠体内的细胞群体,这些细胞可以介导抗CAR抗原阴性肿瘤生长的保护作用。探讨内源性CD4的可能性+T细胞是改善m1928z-cd40L car T细胞治疗的抗肿瘤反应所必需的,我们利用了CD8的发现。+只有CAR T细胞,而不是CD4+CAR T细胞,可治疗A20.GL荷瘤小鼠(附图)。5A,B)。这就允许了抗体介导的CD4的缺失。+CD8背景下的T细胞+M1928z-cd40L car T细胞治疗,评价无卡CD4的作用+T细胞在抗肿瘤反应中的作用。CD4+抗CD4抗体克隆GK1.5对A20.GL荷瘤小鼠CD8前后T细胞的杀伤作用+M1928z-CD40L CAR T细胞治疗(图1.4A)。CD4+用流式细胞仪检测不同抗CD4抗体克隆(rm4-5)的gk1.5小鼠在ACT第7天和后一时间点(第21天)的T细胞耗竭情况。+T细胞可能在最初的抗肿瘤CAR T细胞反应中起辅助作用(补充图)。5C)。CD4耗竭小鼠的存活证明了CD4+通过m1928z-CD40LCAR T细胞治疗,T细胞不是改善抗肿瘤反应所必需的(如图所示)。4A).

图4:CD8+T细胞是m1928z-CD40L CAR T细胞介导的抗抗原阴性肿瘤生长的必需细胞。

a1×10注射幼稚BALB/c小鼠存活的实验研究6A20.GL细胞静脉注射(i.v.)要么不治疗要么用3×106CD8+M1928z-CD40L CAR T细胞。第七天(黑箭头)。CD4+T细胞耗竭,两组小鼠腹腔注射μg抗CD4耗竭抗体(GK1.5)。每周注射2次,每次3至4周(红色箭头)。给出了两个有代表性的实验之一。b实验方案c, d). c荧光素酶表达CD 19小鼠的肿瘤负担内格应用生物发光成像技术对A20.CD19-KO细胞进行监测。每只动物的平均照度被绘制为IgG处理的小鼠(n=9)和CD8+T细胞耗竭小鼠(n=10)。d小鼠存活b, c)。以年龄匹配的BALB/c小鼠为对照。全p-图中的数值由二尾对数秩(mantel-Cox)检验确定.NS,没有意义。源数据作为源数据文件提供。

关注CD8+T细胞室,抗体介导的CD8缺失+T细胞在ACT前和/或ACT后也会导致CD8的耗竭。+T细胞在CAR T细胞产品中,由于半衰期长、抗体耗竭及其系统持久性。这样就不可能将观察到的结果归因于内源性CD8。+T细胞群或过继转移的CAR T细胞。为了避免这个问题,我们决定调查CD8的贡献。+T细胞对记忆反应对CAR抗原阴性肿瘤细胞的挑战。长期存活小鼠,最初通过m1928z-CD40LCAR T细胞从A20.GL肿瘤攻击中治愈,然后注入CAR抗原阴性的A20.CD19-KO细胞,通过持久化的CAR T细胞排除任何CAR T细胞介导的抗肿瘤反应(图1)。4B)。19只小鼠在第50天通过生物发光成像无肿瘤。+首次表达荧光素酶的A20.GL肿瘤攻击和m1928z-CD40L CAR T细胞治疗后,从三个不同的实验中收集,并分成两个队列(补充图)。5D、E、F)。19只小鼠中有10只为CD8。+腹腔注射抗CD8抗体克隆2.43的T细胞。4B)。其余9只小鼠接受IgG控制抗体。完全CD8+T细胞耗竭证实(附图)。5G)和荧光素酶表达的A20.CD19-KO肿瘤细胞的生长随时间的变化(图)。4C)。小鼠经A20.GL原发肿瘤治疗后CD8缺失+T细胞不能控制A20.CD19-KO肿瘤的生长,与IgG对照小鼠不同(见图)。4C)。这导致由于疾病进展而缺乏生存(图一)。4D)。所有复发小鼠均因CD 19的生长而死亡。肿瘤细胞,表明CD8+T细胞的耗竭并没有导致CD 19的重新出现。+肿瘤细胞从第一次肿瘤挑战(补充图。5H,i).

讨论

本研究描述肿瘤特异性内源性CD8的生成。+M1928z-CD40L CAR T细胞处理后的T细胞。它们的动员依赖于交叉提呈的cDC1s的存在,而它们通过抗CD8抗体介导的细胞耗竭而被清除,使小鼠对cDC1s抗原阴性的肿瘤细胞生长敏感。这些发现强调了m1928z-CD40LCAR T细胞对宿主的持续抗肿瘤作用。

这种作用可能是通过肿瘤相关抗原(Taas)在mhc-i上由癌细胞对细胞毒性CD8的识别而介导的。+T细胞,如小鼠和人类癌症患者所描述的33,34。宿主T细胞对这些TAA的识别在ACT后肿瘤异质性和car抗原阴性肿瘤细胞的生长方面尤为重要,如临床所见。4。这个早期的CD8+T细胞通过CD40L过表达的CAR T细胞启动,似乎会产生一种长寿命的记忆反应,保护小鼠免受CAR抗原阴性肿瘤的生长。需要更仔细地分析a20肿瘤细胞的TAA表现,以评估CD8对免疫显性表位的识别程度。+T细胞群肿瘤细胞外显子序列测定与抗原表位的预测相结合,可以确定肿瘤细胞的免疫显性表位和潜在的CD8。+T细胞克隆识别它们35。这将告知CD8的范围。+T细胞肿瘤识别,并允许区分优势克隆反应和可能的寡克隆T细胞抗肿瘤反应。

由于A20肿瘤细胞来源于转化的B细胞,它们表达高水平的MHC-Ⅱ,使其易受CD4感染。+T细胞介导的识别。然而,CD4+T细胞特异性的抗肿瘤反应似乎与cd4之前的耗竭无关。+T细胞对m1928z-CD40L CAR T细胞介导的抗肿瘤反应无明显影响。CD4+T细胞在帮助启动细胞毒性CD8中起着重要作用。+T细胞表面CD40L表达对CD 40信号转导的影响36。CD40L在CAR T细胞上的过度表达+和CD8+CAR T细胞-消除CD4的需要+T细胞的帮助,类似于早期的研究表明有效率的CD8。+与CD4无关的抗CD 40抗体激活T细胞的实验研究+T细胞帮助37,38。因此,CD4+T细胞在增强有效的抗肿瘤反应方面是可有可无的,只要CD 40信号在APC上由另一种来源提供,例如CD40L-过表达的CAR T细胞。

内源性CD8细胞因子的产生+T细胞明显Batf 3−/−小鼠,尽管没有交叉呈现cdc 1。本文报道了CD8 T细胞独立于Batf 3表达的cDC1s交叉启动的研究。CD 169+巨噬细胞被认为可能是刺激lns中CD8 T细胞的抗原交叉表达体。39,40。在我们的系统中,我们曾经报道过巨噬细胞和dc的激活。6,值得进一步研究以建立巨噬细胞在CAR T细胞治疗小鼠中的潜在刺激作用。然而,我们发现缺乏Batf 3表达的cDC1s会削弱m1928z-CD40L CAR T细胞的抗肿瘤反应,而其他交叉递呈细胞的鉴定和缺失可能完全减弱抗肿瘤反应,并提供其他非cDC1s参与的证据。

为什么cdc 1/cdc 2比值在m1928z-CD40LCAR T细胞处理的小鼠体内增加尚不清楚,值得进一步研究。Cdc 1在肿瘤组织中的积累是由多种NK细胞衍生的细胞因子引起的,如ccl 5、flt3l和xcl 1。16,17。外周组织中的常规dc的半衰期约为3-6天,由来自骨髓和从骨髓流出的组织驻留前cdc维持。41,42。这一过程可以在小鼠流感模型中观察到,当cdcs前向受感染的肺组织输送并局部增加cdc的数量时。43。我们发现CD40L-CAR T细胞治疗后CDCs的增殖只在肿瘤中,而不是在淋巴组织中。更重要的是,CD40L-car T细胞治疗通过促进祖细胞IRF 8的分化,使cdc 1/cdc 2比值偏向cdc 1。+DN祖细胞转cDC1s。这与已发表的研究结果相似,即通过从骨髓中动员祖细胞来维持外周组织中cdcs的生成。18,43。内源和外源应用FLT3L在介导这一效应方面都具有指导意义。18,41,42,44,提示CD40L-CAR T细胞治疗后有可能被激活的途径。目前尚不清楚在不同组织中发现的CDCs是否对分化信号有不同的反应,因此需要进一步分析存在于不同组织中的祖细胞DC。

CD8启动+Cdc 1s的t细胞在CD 103后出现在tdln中。+Cdc1s携带肿瘤抗原,上调淋巴结表面的ccr 7,然后将cdc 7与cdr 7交叉表达到cdr 7上,使cdc 7与cdc 7交叉表达。+T细胞25。我们注意到脾CD8的有效启动。+T细胞,表示更系统,而不是局部的CD8。+M1928z-CD40L CAR T细胞处理激活T细胞。这可能是由脾脏中的CAR T细胞聚集所致,该部位具有较高的抗CD 19 CAR抗原浓度。在那里,他们诱使装甲运兵车获得许可证。6并为T细胞启动提供了一个宽松的环境。我们所使用的播散性淋巴瘤模型与真正的实体瘤模型相比有明显的特点,在间质浸润和免疫抑制性肿瘤微环境方面有差异。45,46。使用不同的肿瘤模型,而不是针对B细胞上普遍存在的抗原(如CD 19),可以帮助描述CD40L修饰的CAR T细胞是否能分泌CD8。+T细胞通过APC许可在地方一级。然而,m1928z-cd40L car T细胞治疗确实导致了肿瘤居民CD 103的增加。+Cdc 1群体,而淋巴样CD8α+CDC1s未升高。这意味着CD8的启动。+肿瘤微环境中的T细胞,这是可能的,以前的一项研究已经对TILs进行了描述。47。肿瘤浸润与tdLN驻留CD8的更详细分析+经m1928z-cd40L car T细胞处理后的T细胞可帮助阐明cdc 1-CD8的后勤功能。+T细胞相互作用此外,它还可以告诉我们在什么样的组织环境中启动发生。这将有助于设计更多的战略来改进这一启动过程,这对于建立一种持续的、内源性的抗肿瘤反应至关重要。

方法

动物模型

所有小鼠都是在SPF条件下在斯隆凯特林癌症纪念中心的动物设施中繁殖和共同饲养的。所有实验都是按照MSKCC机构动物护理和使用委员会(MSKCC协议#00-05-065)的道德标准进行的。野生型BALB/c小鼠购自Charles River。Balb/c CD45.1(CByJ.SJL(B6))-Ptprca/J)是从杰克逊实验室购买的。Balb/cCD 40−/−(CNCr.129P2-CD 40Tm1Kik/j)由Anna Valujskikh博士提供,并在家中饲养。Balb/cBatf 3−/−(C.129S-Batf 3Tm1Kmm/J)由Barney Graham博士提供并在家中培育。所有实验均采用8-12周龄雌性小鼠,除非有不同的指示。以萤火虫荧光素酶表达瘤小鼠为实验对象,在治疗前1天通过生物发光法确定肿瘤负荷大小,并随机分为不同治疗组。小鼠经CO安乐死2吸入时,肿瘤生长导致体重增加20%,原因是腹部扩张,或当小鼠患上后肢麻痹。调查人员在评估结果时被蒙蔽了眼睛。

细胞株

A20单元(目录号TIB-208)和菲尼克斯-生态包装单元(目录号CRL-3214)是从ATCC购买的。在RPMI-1640中添加10%热灭活FBS、非必需氨基酸、1mm丙酮酸钠、10 mm HEPES、2mm L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、11 mm葡萄糖和2μM2-巯基乙醇。对细胞株进行常规检测,以确定是否存在潜在的支原体污染。

逆转录病毒结构物的产生

Sfgγ逆转录病毒载体中编码car结构的质粒48根据生产厂家的指示,用ProFection哺乳类转染系统转染gpg 29成纤维细胞(H29),制备囊泡性口炎病毒G-糖蛋白型逆转录病毒上清液。用这些逆转录病毒上清液构建稳定的Moloney小鼠白血病病毒假型逆转录病毒颗粒产生的菲尼克斯-生态细胞系。Sfg-m1928z-cd40L载体是用前面描述的抗小鼠cd19 scFv的cDNA,由分步吉布森组装(新英格兰生物实验室)构建的。49、Myc标记序列(EQKLISEEDL)、小鼠CD 28跨膜和胞内结构域、无终止密码子的小鼠CD3ζ胞内结构域、P2A自裂解肽和小鼠CD40L蛋白。

小鼠T细胞分离与逆转录病毒转导

如前面所述,处理了小鼠T细胞6。简单地说,用EasySep小鼠T细胞分离试剂盒(Stemcell)从安乐死小鼠脾脏中分离出小鼠T细胞。细胞经10%热灭活FBS、非必需氨基酸、1mm丙酮酸钠、10 mm HEPES、2mm L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、11 mm葡萄糖、2μM2-巯基乙醇、100 IU重组人IL-2(Prometheus治疗与诊断学)刺激后,以抗CD3/28 Dynabeads(生命技术)刺激。经珠刺激24、48h后,将T细胞刺入逆转录菌素包被板上,取凤凰-生态细胞培养的病毒上清液。第二次刺刺后,细胞休息一天,然后在随后的实验中使用。

CAR T细胞过继转移

在肿瘤研究中,小鼠接种疫苗。第0天用1×106只萤火虫荧光素酶表达肿瘤细胞。第6天,用XenogenIVIS成像系统(XenogenIVIS)和LiveImage软件(Xenogen)进行生物发光成像,获取成像数据集,以保证治疗时小鼠的肿瘤负担相等。然后将小鼠随机分为不同的治疗组,第7天用1-3×10进行治疗。6小汽车+T细胞静脉注射。生物发光成像监测肿瘤随时间推移的负担,并以光子/秒/厘米对整个动物体内的肿瘤负担进行量化。2/斯特拉迪安(p/s/cm)2(高级专员)。

Car抗原阴性肿瘤细胞对肿瘤的挑战

长期存活BALB/c小鼠(CD 19初次肿瘤攻击后50+)+肿瘤细胞)接种。1×105A20.CD19-KO细胞(BALB/c)。幼稚的年龄相配的老鼠作为对照。随着时间的推移,生存受到监控。

CD4耗竭+或CD8+细胞群体

耗尽CD4+荷瘤小鼠T细胞注射200μg抗CD4耗竭抗体(GK1.5)或IgG控制抗体(LTF-2)。Car T细胞治疗前1周开始,每周2次,共4周。耗尽CD8+T细胞在CD 19阴性肿瘤细胞的再刺激实验中,注射200μg的抗CD8耗竭抗体(2.43)或IgG控制抗体(LTF-2)。在−3、0、7、14和21天与肿瘤细胞攻击有关。CD4耗竭+和CD8+采用流式细胞术(CD4为RM4-5,CD8为53~6.7),流式细胞仪检测小鼠外周血T细胞。

用于后续分析的细胞隔离

脾脏和肿瘤组织处理如前所述。6。小鼠在摘除器官前经CO2吸入安乐死。采集的脾脏被切碎,过滤,用PBS洗涤,红细胞被溶解。肝脏肿瘤组织机械破坏,过滤,Percoll密度离心分离,红细胞溶解。剩余的细胞在PBS中清洗,计数,并用于随后的分析。

流式细胞术与FACS分类

流式细胞术分析采用贝克曼库尔特加利奥斯或热费舍尔阿图恩NXT流式细胞仪。数据分析采用FUROJO(TreeStar)。所有实验均采用DAPI(0.5mg/ml,Sigma-Aldrich)或活/死紫死细胞染色试剂盒(Thermo Fisher)排除死细胞,用抗CD 16/CD 32抗体(93)阻断非特异性抗体通过FC受体的结合。用以下抗小鼠抗体进行流式细胞术:Trustain FCX(抗小鼠CD 16/32)BioLegend Cat#101319,RRID:AB_1574973,5 g/ml;抗小鼠CCR 7(克隆4B12)PE BioLegend,120105,2g/ml;抗小鼠CD3(克隆17A2)BrilliantViolet510 BioLegend 100233,RRID:AB_2561387,1 g/ml;抗小鼠CD3ε(克隆145-2C11)PE-eBioscience 61-0031,RRID:AB_2574514,1g/ml;抗小鼠CD4(GK1.5)AlexaFluor 700 eBioscience 56-0041,RRID:AB_493999,0.1g/ml;抗小鼠CD8α(53-6.7)APC-eFluor 780 eBioscience 47-0081,RRID:AB_1272185,0.1eBioscience:AB_1272185,0.1g/ml;抗鼠/人CD11b(M1/70)AlexaFluor 700 eBioscience 56-0112,RRID:AB_657585,0.1g/ml;抗小鼠CD11c(N 418)APC 780 eBioscience 47-0114,RRID:AB_1548663,0.2g/ml;抗小鼠CD 19(EBio1D3)APC-eFluor 780 eBioscience 47-0193,RRID:AB_10853189,0.1g/ml;抗小鼠CD 19(EBio1D3)PE eBioscience 12-0193,RRID:AB_657661,0.1g/ml;抗小鼠CD 19(EBio1D3)PE-eFluor 610 eBioscience 61-0193,RRID:AB_2574536,0.5g/ml;抗小鼠CD 40(1C10)PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0401,RRID:AB_2573677,1g/ml;抗小鼠CD40L(MR1)PE eBioscience 12-1541,RRID:AB_465887,0.2g/ml;抗小鼠CD 45(30-F11)BV 605生物图谱103139,RRID:AB_2562341,0.5g/ml;抗小鼠CD 45(30-F11)PE-Cy7 eBioscience 25-0451,RRID:AB_469625,0.5g/ml;抗小鼠CD 45.1(A20)PE-eFluoreBioscience 61-0453,RRID:AB_2574560,0.2g/ml;抗小鼠CD 45.2(104)PE-Cy7 eBioscience 25-0454,rRID:AB_2573350,0.1g/ml;抗小鼠CD 103(2E7)BV 711 BioLegend 121435,RRID:AB_2686970,1g/ml;抗小鼠IFNγ(Xmg1)2)PE-Cy7 eBioscience 25-7311,RRID:AB_1257211,0.4g/ml;抗鼠IRF 8(V3GYWCH)PerCP-eFluor710 eBioscience 46-9852,1.6g/ml;抗小鼠Ki-67(SolA 15)PE-eFluor610 eBioscience 61-5698,0.1g/ml;抗小鼠Ly-6G/Ly-6C(GR-1)(RB6-8C5)PE-eFluor 610 eBioscience 61-5931,RRID:AB_2574639,0.2g/ml;抗小鼠Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)(RB6-8C5)PE-Cy7 eBioscience 25-5931,RID:AB_469662,0.2g/ml;抗小鼠MHCⅡ类(MHC-Ⅱ)I/I-E(M5/114.15.2)BV 510生物联想107635,RRID:AB_2561397,0.2g/ml;抗人Myc标记(9B11)AlexaFluor 647细胞信号转导2233 S,RRID:AB_10693328,1:500。流式细胞术用123计数eBeads计数珠(ThermoFisher)对细胞总数进行定量。对干扰素γ细胞内染色,产生肿瘤或脾脏组织的单个细胞悬液,1x细胞刺激鸡尾酒(pMA、ionomycin、brefeldin A和monensin)刺激细胞5h,然后按制造商的指示用细胞固定/CytopermPlus试剂盒(BD生物科学)对细胞进行处理。细胞内IRF 8染色采用eBioscience Foxp 3/转录因子染色缓冲液集(Thermo Fisher)。所有抗体均来自Biolegend、BD生物科学、细胞信号转导、eBioscience或ThermoFisher。在无菌条件下,用BD FACSAria对组织加工后的脾细胞进行分选。通过对分类细胞样品的再分析,确定了细胞群体的纯度。

体外DC培养试验

骨髓培养采用1.2×10接种法。6/毫升CD 45.1+在完整的RPMI培养基中,BM细胞分为24孔板(500 L/孔)。细胞内分别加入100 ng/ml小鼠FLT 3配体(PeproTech)和20 ng/ml小鼠GM-CSF(PeproTech)。在培养的第2天,5-10×103分类CD 45.2+CD11bCD 103DNCDCS,CD11bCD 103+Cdc 1和CD11b+CD 103+将CAR T细胞处理小鼠的cDC 2细胞分别加入培养物中.共培养3d后,DN cdcs、cdc 1和cdc 2s在所有CD45.2中所占的百分比。+流式细胞仪检测细胞。

量化与统计分析

所有统计分析均采用GraphPad棱镜软件(GraphPad)进行。数据点代表生物复制,并显示为平均数±SEM或平均数±SD,如图中所示。统计学意义是用一个未配对的双尾学生来确定的。t-测试,除非另有说明。采用对数秩(Mantel&Cox)检验,确定小鼠生存实验中总体生存的统计学意义。意义被假定为*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001.


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