化疗对影响治疗结果的乳腺癌动态免疫应答

为了阐明新辅助化疗(NAC)的疗效，我们对146例纵向乳腺癌患者进行了全转录组分析和组织病理学分析，其中包括在治疗前、治疗后和手术时收集的110对连续的肿瘤活检。在此，我们发现细胞毒性化疗会引起肿瘤免疫微环境的动态变化，这种变化取决于细胞的亚型和病理反应。只有一个周期的治疗诱导免疫刺激的微环境，包含更多的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和对抗PD1治疗反应的炎症特征的上调预测，而残余肿瘤在治疗结束时免疫抑制与基线相比。TIL和CD8+T细胞比例的增加与病理完全反应有关。此外，治疗中的免疫反应比配对基线样本中的免疫特征更能预测治疗结果，尽管它们之间有很强的相关性。

尽管靶向和免疫肿瘤学(IO)疗法取得了巨大进展，细胞毒性化疗仍然是治疗疾病不同阶段的许多癌症的支柱。1。化疗一直被认为是由于剂量限制的骨髓抑制而产生的免疫抑制，然而，越来越多的证据表明，化疗的疗效不仅涉及细胞固有的细胞毒性作用，而且还依赖于激活抗肿瘤免疫反应。2。目前正在努力将化学疗法和IO疗法结合起来，根据化疗提供广泛的免疫刺激来对抗癌症的假设来利用协同效应。3,4,5。新疗法的设计和最佳的组合策略需要详细了解化疗对肿瘤细胞、内在生物学以及肿瘤微环境的影响。目前，在小鼠模型中主要研究肿瘤相关免疫调节作用及化疗治疗的机制。2。在临床上，对化疗对肿瘤免疫环境的影响缺乏全面、系统的表征，特别是在治疗或治疗后。对药物治疗反应的临床前观察可能与临床结果不一致。一项研究报告了环磷酰胺对荷瘤小鼠的免疫刺激作用，并通过基因和蛋白质表达谱分析，提出了联合IO治疗的最佳时机为初始化疗后1天左右。6。然而，在I-间谍1试验中，接受新辅助化疗(Nac)患者乳腺肿瘤的连续表达分析提供了自相矛盾的证据，揭示了化疗后1-4天免疫基因的下调。7.

获得治疗后临床样本的挑战是缺乏可用于研究肿瘤对化疗等标准治疗的反应的分子特征数据的主要原因。8,9。新辅助治疗患者在手术切除肿瘤之前接受系统治疗，是评估药物对靶点、肿瘤生物学和临床疗效的分子标记物的一种有吸引力的方法。10,11,12。在乳腺癌(Bc)，尤其是ER阴性亚型中，新辅助化疗是治疗局部晚期癌症的首选方法，病理完全反应(Pcr)是改善预后的主要终点。13,14,15,16。HER 2+亚型的蒽环类和紫杉烷类化合物的联合应用，多年来一直是BC佐剂和新佐剂环境下的主干方案。17,18,19。尽管IO疗法在治疗许多癌症方面取得了成功，包括转移的TNBC20对于利用IO治疗的BC患者来说，寻找有益的治疗方案仍然是一个挑战。针对程序性细胞死亡蛋白1(PD1)和PD1配体1(PDL 1)的检查点抑制剂被临床验证。21并且形成了IO组合策略的基础，在这些策略中，设计是以pdl 1表达和免疫途径特异性mrna谱等标记为指导的。22。对25例BC患者治疗前后肿瘤标本的组织学分析显示，新辅助紫杉醇化疗后肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的发生与临床疗效相关。23。有几项研究报告了免疫组织化学和基因表达谱在NAC环境下评估治疗前和治疗后标本后基线TIL计数和PDL 1阳性的临床意义。24,25,26。然而，这些研究主要集中在NAC治疗前后的肿瘤活检，但没有充分描述治疗期间肿瘤组织发生的变化。最近对50名接受nac治疗的乳腺癌患者的97份序列样本进行了一项表达谱分析研究，结果表明，在治疗中的生物标记物可以提高对nac反应的预测，但没有发现任何免疫基因表达的变化。27.

我们假设在新辅助治疗前后对连续的肿瘤活检进行综合分析，可以描述NAC对免疫微环境的影响，可以指导IO疗法的选择和合理的组合设计。22。在本研究中，我们对146例接受新辅助化疗的乳腺癌患者的三个时间点的连续样本进行了全转录组分析和组织病理学分析。然后，我们进行系统的分析，以确定NAC引起的基因表达谱和免疫微环境的变化，以及检查分子属性与临床结果之间的关系。在这里，我们报告说，新辅助化疗的第一个周期在肿瘤中诱导免疫刺激反应，它独立地与病理完全反应相关，比基线免疫特征更能预测治疗结果。我们的发现表明，在治疗的早期阶段结合免疫调节疗法可以提高新辅助化疗的疗效，同时在治疗期间评估肿瘤相关免疫反应可以帮助确定可能受益于IO联合治疗的患者。

研究设计与数据综述

在2.5年的时间里，我们收集了210例诊断为浸润性乳腺癌的患者，他们使用标准的新辅助化疗(NAC)方案治疗HER 2+疾病，其中4个周期为蒽环类药物和环磷酰胺，4个周期为多西他赛(T)或多西紫杉醇+特拉斯特祖马(Trastuzumab)。在治疗前(T1)、NAC第一周期(T2)后3周和手术时(T3)三个时间点，对未达到PCR的患者进行肿瘤活检(T3)。1A)。我们成功地对146例281例肿瘤标本进行了全转录组测序(WTS)和组织病理学分析，其中110例为纵向对。1和补充数据1)。其中55例(38%)获得PCR，91例(62%)伴有残留病(RD)。对136例患者的227例肿瘤标本进行RNA-Seq检测，其中17对(T1-T2-T3)和57对(T1-T2，T1-T3或T2-T3)，对所有配对标本进行覆盖(图1)。1B)。112例患者检测T1基线标本，其中PCR 42例(37.5%)，70例(62.5%)。对68例患者进行了T1和T2配对标本的分析，其中21例为PCR，47例为RD。对146例271例肿瘤标本进行了苏木精和伊红(H&E)染色。根据ER、PR和HER 2标记的免疫组织化学分析，我们将所有的RNA-Seq标本分为4种亚型：ER+/HER 2−、ER+/HER 2+、HER 2+/ER−和三阴性(TN)。根据预处理样本的亚型分类，22%(30/136)的队列为ER+/HER 2−，20%(27/136)为ER+/HER 2+，20%(27/136)为HER 2+/ER−，38%(52/136)为TN(补充表)。1).

a学习设计图阿霉素(阿霉素)+环磷酰胺、紫杉醇(紫杉醇)、H Herceptin(Trastuzumab)、NAC新辅助化疗、PCR病理完全应答。(b)用于病人注册、样本收集和数据生成的Con排序图。9例不同意的患者未收集组织。*55例患者因组织收集失败(33例)、随访失败(7例)、放弃同意(6例)、非乳腺癌病理(4例)、远处进展和排除手术(3例)、NAC终止(1例)和过期(1例)而被排除在NGS数据生成之外。两例非PCR患者配对T1、T3样本。WTS全转录组序列分析。

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NAC过程中癌症标志通路的差异调控

全球差异表达(DE)分析确定了三个共有的1987年DE基因簇，形成对比DE模式的治疗时间和丰富的细胞周期(C1)，上皮间充质转换(EMT)，细胞外基质(ECM)(C2)和免疫(C3)途径，这是主要的癌症标志(补充图)。1A和补充数据2)。使用GSVA算法28为了计算基因表达特征评分，我们证实了在DE基因和簇中显著富集的路径以及这些路径中的代表性基因也随着时间的推移表现出一致的表达模式(图一)。2A，b和补充数据3)。我们进一步研究了在不同乳腺癌亚型中定位到DE簇的关键基因和通路的差异表达模式(补充图)。1, 2)。在所有亚型中，NAC处理的第一个周期诱导细胞周期基因的下调，例如与细胞生长和增殖有关的通路，例如Hallmark E2F靶向性信号。然而，手术时残余肿瘤细胞周期相关基因的表达水平回升到较高水平，HER 2+和TNBC的表达增加最为明显(见图)。2)。另一方面，NAC的第一个周期诱导所有亚型的免疫和EMT/ECM相关通路的上调。在HER 2+和TN亚型治疗结束时，这些途径的表达降低到基线水平以下(见图)。2)。这些上调和下调的动态模式似乎是由肿瘤细胞的变化所驱动的，这反映了临床观察，化疗最初导致肿瘤缩小，但大多数患者在治疗后仍然难以治疗。

代表性通路的表达模式(a)和基因(b)定位于三个DE基因簇。GSVA评分a中心并缩放到z-每个通路基因的评分。用线性混合效应回归分析(LMER)确定DE的统计学意义，并显示为符号*−log 10(p-基于t-统计。源数据作为源数据文件提供。

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三种癌症标志中富集的差异表达模式似乎在不同的亚型之间是一致的，但在HER 2+和TN亚型中表现得比ER+亚型更为明显(图1)。3)。我们根据DE事件的统计意义的相关性，对不同乳腺癌亚型的DE模式进行了深入的比较，并在基因和通路水平上观察了一致的趋势(补充图)。3)。在比较ER+与HER 2+、ER+vs TN和HER 2+对TN时，早期DE事件(T1与T2)在通路水平上与Spearman相关系数分别为0.633、0.744和0.633(补充图)。3A)。尤其是与细胞周期相关的DE模式比EMT/ECM和免疫途径的相关性更强。另一方面，晚期DE通路(T2对T3)在亚型间的相关性较弱，ER+与HER 2+、ER+与TN、HER 2+与TN(补充图)的比较显示Spearman相关系数分别为0.114、0.080和0.404。3B)。在此阶段，ER+亚型中的DE模式与HER 2+和TN亚型中的DE模式不同。例如，ER+亚型的DE事件在基因(rho=−0.09)和通路水平(rho=−0.047)与TN呈负相关(补充图)。3B，e)。值得注意的是，ER+肿瘤与HER 2+和TN肿瘤(ER+vs HER 2+：RHO=−0.479，ER+vs TN：RHO=−0.179)与基线与残留比较(T1 Vs T3)的DE事件呈负相关。3C，f)。事实上，ER+亚型残基肿瘤细胞周期相关通路下调，HER 2+和TN亚型细胞周期相关通路上调，说明NAC对不同亚型的生长和增殖有不同程度的影响。因此，化疗诱导的分子反应在治疗的早期阶段基本相似，但在治疗结束时，不同的乳腺癌亚型之间的差异更大。

a三个DE基因簇在总体队列和亚型中的聚合表达模式。灰色线代表单个基因表达，红线代表每个聚类的总得分(GSVA)。由于缺乏T3样本，ER+/HER 2+亚型被排除在外。ER+组合包括ER+和ER+/HER 2+亚型。“HER 2+组合”包括ER+/HER 2+和HER 2+亚型。错误条表示每个时间点的缩放log2TPM值的标准差。分析中使用的样本大小如下。所有：n=112(T1)，n=88(T2)，n=27(T3)；ER+：n=26(T1)，n=18(T2)，n=7(T3)；ER+合并：n=49(T1)，n=36(T2)，n=8(T3)；HER 2+：n=19(T1)，n=17(T2)，n=5(T3)；HER 2+合并：n=42(T1)，n=35(T2)，n=6(T3)；TN：n=44(T1)，n=35(T2)，n=14(T3)。源数据作为源数据文件提供。b在总体队列和亚型中映射到三个DE集群的路径的聚合表达模式。灰色线代表个体基因特征(GSVA评分)，红线代表每个样本组的平均值。误差条表示每个时间点的缩放GSVA分数的标准差。用于导出统计数据的样本大小与图中的相同。2A。源数据作为源数据文件提供。

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NAC诱导肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的动态变化

免疫基因表达的动态变化提示NAC治疗对肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)有重要影响，在调节免疫调节治疗效果中起重要作用。为了进一步研究NAC对肿瘤相关免疫的影响，我们通过对H&E幻灯片进行数字图像分析，量化TIL的密度，并分析其随时间的变化(图)。4和补充数据4，补充表2)。大多数肿瘤在NAC第一个周期后3周出现TIL密度增加，手术时TIL密度降至基线水平以下，其变化模式因亚型和PCR状态而异(图1)。4A)。TIL密度从T1到T2在所有亚型中均有增加，其中TN占80%(12/15)，非TN亚型占64%(14/21)。4B，c和补充表3)。而残馀疾病患者中，治疗后TIL浓度增加85%(15/18)，而非TN患者TIL浓度下降62%(27/44)。病理学家目视检查TN病例的H&E图像，根据国际标准得出间质TIL评分。29，并证实了TIL在TN三个时间点上的变化规律(图1)。4D和补充图。4A)。使用TIL标记对一组病例的多重IF分析也表明，在初始NAC治疗后，T细胞在TNBC中扩展，而在非TNBC病例之间收缩(如图所示)。4E，f).

比较了PCR肿瘤和RD患者3个时间点的TIL密度分布。a)、TN(b)和非TN亚型(c). dTN肿瘤间质TIL评分随时间的分布分为PCR组和RD组。星号以线性混合效应回归(LMER)为基础，以肿瘤纯度和亚型为协变量进行调整，显示出统计学意义。*0.01<p < 0.05; **0.001 < p < 0.01; ***p < 0.001. See Supplementary Table 2确切地说p-价值观。对于所有的盒子和胡须情节，盒子是以第一和第三四分位数为界的，中间有一条水平线，晶须延伸到最大值和最小值。源数据作为源数据文件提供。e, f多重免疫荧光(IF)，H&E和PD-L1 IHC图像显示相同区域的肿瘤在T1和T2从TNBC患者-BR 294。e)和一个HER 2+病人-BR 308(f)。标记物包括CD45RO、CD3、CD4、CD8、PD-L1和Pan-CK.经优化后，对肿瘤活检标本只进行一次染色IHC和多重检测。显微照片左下角的缩放条显示200μm.

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据报道，基因表达信号可以预测对抗PD1抑制剂的反应，包括T细胞相关的炎症信号和由包含多种免疫调节功能的单个成分组成的扩展免疫信号。30。有残留疾病的TN患者总生存期和复发后生存期明显短于非TN患者。16,31。我们发现NAC在治疗中显著增加了TN残馀疾病患者的IO预测特征，指出了NAC和检查点抑制剂结合解决这一未满足的医疗需求的有前途的方法(补充图)。4B，c).

NAC对免疫景观的深刻影响

为了深入了解nac对不同TIL亚群体的诱导作用，我们对大体积肿瘤基因的表达进行了反褶积分析。32推断各肿瘤浸润性白细胞中10种免疫细胞的相对比例。与CYT评分有很强的正相关关系，CYT评分是衡量细胞溶细胞活性的一种标准，定义为GZMA和PRF 1表达33对CD8+T细胞、CD4+记忆T细胞和M1巨噬细胞的免疫刺激作用。相反，与CYT评分呈负相关，提示M2巨噬细胞和肥大细胞具有免疫抑制作用(附图)。5A)。CD4+记忆T细胞的相对分数显著增加(p=3.18e−06)和CD8+T细胞(p=0.0072)后的第一个周期(补充图)。5B和补充表4其次是CD4+记忆T细胞和M1巨噬细胞在治疗和手术之间的比例下降。另一方面，与治疗前相比，残留肿瘤中肥大细胞和M2巨噬细胞的细胞比例增加(附图)。5C)。因此，NAC治疗的第一个周期似乎在肿瘤中诱导了刺激性的免疫微环境，而残余肿瘤则比基线肿瘤含有更多的免疫抑制微环境。

免疫表达特征和免疫细胞组分的非监督综合聚类将所有样本分为三种不同的免疫状态：冷(C)、温(W)和热(H)(图一)。5A和补充数据4)。与其他两种状态相比，H状态标志着免疫刺激的微环境中CD4+、CD8+T细胞和M1巨噬细胞的比例增加，TIL丰度升高。C状态标志着免疫抑制的微环境，M0，M2巨噬细胞和肥大细胞的比例高于其他免疫状态，而W状态似乎是H和C状态之间的中间(补充图)。6a，b)。免疫状态与亚型(p=1.7e−03)，治疗时间(p=9.4e−06)及治疗反应(p=8.5E−04)(补充图4。6C-E和补充表5)。在治疗过程中，我们观察到肿瘤相关免疫状态的频繁变化，77%(20/26)的基线肿瘤在T2期转变为H，91%(10/11)的H肿瘤在T2时切换到T_3或C(T_3)。5B)。免疫状态转换模式与乳腺癌亚型(p=7.98e−4)(补充表6)。在基线时，ER+/HER 2−肿瘤(56%，9/16)大部分为免疫寒冷，78%(7/9)患者在治疗后仍保持免疫寒冷状态。另一方面，所有TN肿瘤在治疗中均转为免疫刺激状态(71%，17/24)，或在两个阶段保持免疫热(29%，7/24)。免疫状态的转变也与病理反应有关(p=0.097)。10例在T1和T2期仍保持免疫冷状态的肿瘤患者中，有11例(45.8%)在治疗后出现免疫刺激状态，但没有一例获得PCR。

a免疫特征和最丰富的免疫细胞组分的集成聚类。b免疫状态的Sankey图从T1到T2，从T2到T3。文本表示每种免疫状态下的样本数和从一种免疫状态切换到另一种免疫状态的样本百分比。源数据作为源数据文件提供。

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尽管随着时间的变化，免疫特征在配对治疗和基线样本之间似乎有很强的相关性，而T1和T2之间的免疫状态有显著的关联(p=7.79e−06)(图1)。6A和补充图。6f)。CYT评分在配对治疗与基线样本之间也有显著的相关性(rho=0.59，p=2.8E−07)(图1)。6B)。此外，不同亚型的T1、T2样本CYT评分与HER 2+呈显著正相关(Rho=0.69，P<0.01)。p=0.012)和TN(Rho=0.52，p=0.012)(图1。6C)。一致地，T1和T2样本的TIL密度在整体和亚型之间也呈显著正相关(图1)。6d，e)。因此，肿瘤在NAC治疗期间启动强大免疫反应的能力似乎是由基线免疫特征预先确定的。

a配对T2和T1样本的免疫标记和免疫细胞组分综合图谱。免疫状态分类以T2样本为基础。b, c显示整体队列中配对T1和T2样本CYT分数的散点图(b)和不同的子类型(c)。源数据作为源数据文件提供。d, e在配对T1和T2样本中显示TIL密度的散射图(d)和不同的子类型(e)。用Spearman法测定相关性的统计学意义。回归线周围的阴影误差带表示95%的置信区间。源数据作为源数据文件提供。

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虚拟显微解剖分析分化组织区

我们观察到较低的肿瘤纯度，一种测量肿瘤体积比例的方法，与其他状态相比，在免疫热状态下，在治疗过程中与基线相比(补充图)。7)。为了解决肿瘤细胞在治疗前和治疗后分析中可能出现的混淆问题，我们将肿瘤纯度作为协变量纳入我们的差异表达分析模型(见“方法”一节)。此外，为了研究观察到的免疫反应动力学是否仅仅是NAC治疗引起的肿瘤组分改变的乘客效应，我们进行了虚拟显微解剖分析，将体积肿瘤的表达谱解压缩成多个类似于肿瘤不同组织结构的表达特征的因素(见“方法”部分)。除了一种复合肿瘤内在因子外，我们还通过路径富集分析和比较因子在不同乳腺癌和正常组织队列中的分布，确定了三个代表肿瘤外区(TME)的因素：肿瘤浸润性白细胞因子(TIL)F13、基质因子F12和复合正常组织因子(F12)(补充资料)。5)。肿瘤纯度与肿瘤固有因子呈正相关，与TME因子在总体队列中或在特定亚型中呈负相关(补充图)。8A)。此外，tme因子的分配是由肿瘤、基质、正常组织和免疫细胞的相关模式和已发表的表达特征所支持的。34(补充图。8B)。TIL因子与CYT评分及各种免疫标志密切相关。另一方面，正常组织因子与血管或正常组织的非免疫信号密切相关。基质因子与Hallmark EMT和TGFβ信号密切相关(补充图)。8B，c).

TIL因子在免疫热状态下比正常因素更显着地富集(Kruskal-Wallis检验：p < 2e−16 vs. p表明免疫状态的分类是由TIL室的变化驱动的(补充图)。9A)。三种TME因子从T1增加到T2，然后从T2下降到T3，提示NAC治疗最初诱导了治疗结束时所有肿瘤外成分的相对增加(补充图)。9B)。然而，TIL因子的差异分布比正常或基质因子更显着(Kruskal-Wallis：p=9.6e−07；p=0.02和p=1.5e−4)。最重要的是，只有TIL因子在基线时与PCR显著相关(Wilcoxon：p=0.0024)和接受治疗(Wilcoxon：p=0.00061)在所有亚型中具有一致的关联模式(补充图)。10)。因此，治疗诱导的免疫反应可能会产生功能性影响。

免疫反应预测临床结果

我们检查了在基线或治疗早期进行的肿瘤活检的免疫特征是否能预测治疗结束时的病理反应。TIL的总体强度和TIL的δ密度，TIL密度的差异T1和T2与NAC反应相关(附图)。11A，b)。这些关联在不同的亚型中是一致的，更多的免疫原亚型如TN和HER 2+表现出比ER+亚型更强的关联。在TN亚型中，NAC响应与TIL密度显著相关(p=0.038)以及TIL在两种T1的水平(p=0.0071)和T2(p=0.024)(附图。11C-E)。基线和治疗中免疫抑制细胞类型比例较高的患者，如肥大细胞和M2巨噬细胞，更有可能存在残留疾病。相反，基线肿瘤和正在治疗的肿瘤患者携带较高比例的免疫刺激细胞类型，如CD8+T细胞和M1巨噬细胞，则更有可能获得病理完全反应(图一)。7A)。这种关联模式在不同的亚型中是一致的(补充图)。12A-d)，并通过CD8+IHC对样本进行分析(附图)。12E，f).

a森林图显示不同免疫细胞组分与NAC反应结合T1和T2样本的相关性。这个x-轴显示PCR中细胞分数%与RD的对数比数比。星号表示基于多元回归的统计意义，并将亚型调整为协变量：*p = 0.038, **p = 0.008, ***p = 0.0008. b与PCR相关的临床因素(列)和分子特征(行)之间的独立关联。每个单元格中的值表示-log 10(p根据自举分析确定的%变量使用率对特征进行排序，按弹性网络模型选择变量预测PCR状态的运行百分比进行排序。源数据作为源数据文件提供。c基于引导分析的T1和T2免疫特征变量重要性估计的比较。用双侧Wilcoxon秩和检验确定统计学意义。盒子以第一和第三四分位数为界，中间有一条水平线，晶须延伸到最大值和最小值。源数据作为源数据文件提供。dTIL水平在T1和T2样本之间和PCR与RD队列中的分布。星号表示用单边x-平方检验计算的统计显着性：*p=4.06E−5。e来自同一TNBC患者(OB-16-0006)的肿瘤活检切片的H&E图像显示，在T1基线和T2治疗之间，上皮内TIL的丰度增加。子面板II显示在子面板I中标注的肿瘤区域，以更高的比例放大，上皮内淋巴细胞以绿色突出显示。H&E染色仅在肿瘤活检标本上进行一次。

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多因素分析进一步显示，在调整亚型和其他临床特征(包括肿瘤分期、淋巴结分期和肿瘤纯度)后，基线和治疗中的许多免疫特征与PCR状态独立相关。7b和补充数据6)。此外，弹性网络引导分析表明，T2免疫特征比T1免疫特征更能预测PCR状态。7C)。例如，T2 TIL密度通过弹性网络引导分析被列为最具预测性的免疫特征，而TIL密度在T1则排在第11位(如图1所示)。7b和补充数据7)。已经证明，上皮内TIL定位于肿瘤实质，只有在被肿瘤抗原激活时才会产生细胞毒性反应。35。通过病理学家的评估，我们量化了位于肿瘤内间质区的间质TIL和位于肿瘤巢内的上皮内TILs(IE)。与PCR状态无关，间质TILs从T1增加到T2，IE TILs仅在PCR组增加，提示TILs的瘤内定位与NAC反应有一定的联系(P<0.05)。p=4.06e−05)(如图所示)。7D，e)。综上所述，我们的数据表明，NAC治疗引起了较强的免疫应答，增加了TIL在乳腺癌中的浸润，促进了抗肿瘤的杀伤和良好的临床结果。

通过对146例乳腺癌患者NAC前后281例肿瘤活检的多维表征，我们发现NAC引起肿瘤免疫微环境的动态变化，这些变化与乳腺癌的亚型和PCR状态有关。来自PCR队列或免疫原性较强的TN亚型的肿瘤仅在一个周期的化疗后就会出现TIL丰度激增，然后在整个疗程后下降到基线以下的水平。在不同的乳腺癌亚型中，TN最易受到免疫刺激，而ER+/HER 2−的免疫原性最低。NAC诱导的免疫刺激状态下，CD4+和CD8+T细胞的丰度增加，而已知的调节T细胞炎症的信号可以预测对检查点抑制剂的反应，这表明NAC通过启动肿瘤对IO治疗的反应而创造了一个机会之窗。在此期间，免疫刺激更多的肿瘤患者比免疫抑制性肿瘤患者获得更好的结果。基因表达和组织病理学特征表明，与治疗前或基础肿瘤相比，NAC后残留肿瘤倾向于免疫抑制，TIL丰度降低，免疫刺激细胞类型减少，免疫抑制性巨噬细胞比例增加。因此，经化疗预处理的肿瘤在其抗肿瘤细胞毒活性方面往往受到免疫抑制和损害，这与有报道称，一线治疗对免疫检查点抑制剂的反应率要好于后续治疗，而在转移的情况下，事先的化疗治疗与较低的CD8+TIL有关。36.

最近，两项第三阶段的临床试验表明，化疗联合检查点抑制剂显着地提高了三重阴性乳腺癌患者的PCR率和无进展生存期。20,37。然而，对于临床益处的分子基础以及这种益处是否会扩展到其他组合，人们的了解仍然有限。此外，如何最好地结合化疗和免疫治疗的时机和顺序仍然是一个悬而未决的问题。我们的研究提供了临床上证明化疗是免疫增强的证据，并强调了TIL作为联合用药所赋予的临床效益的效应者和标记者的作用。我们的发现表明，如果在化疗的早期，例如在第二个周期之前，而不是在治疗结束后，联合免疫调节疗法是更有效的。此外，IO联合可能只对一组肿瘤一开始就具有免疫原性的患者改善预后。因此，开发治疗方法在未来变得越来越重要，以恢复对免疫静止或免疫被抑制的癌症的免疫监测在治疗后的环境。

大多数研究集中在肿瘤治疗的定性，以确定肿瘤免疫原性的决定因素，并预测对IO治疗的反应。38,39。有证据表明，人们可以通过描述治疗过程中的免疫反应来获得有价值的信息。据报道，CD8+TIL的比值高于FOXP 3+T。雷格以蒽环类药物为基础的化疗后细胞对乳腺癌病理完全反应和存活的预测作用40,41。另一项研究的结论是，治疗中的TILs，而不是基线TIL，与HER 2+乳腺癌无化疗抗HER 2治疗后的病理反应独立相关。42。在我们的研究中，基准线tIL丰度与PCR状态相关联，与早期报道一致。43。更重要的是，我们发现，免疫反应定量的TIL丰度-治疗是一个更好的预测治疗结果比基线TIL丰度。此外，仅在获得PCR的患者中，上皮内TILs在早期反应中的扩张表明TILs不仅在数量上增加，而且还介导抗肿瘤活性，从而为这些患者带来了良好的临床结果。我们对乳腺癌相关免疫状态的观察表明，在新辅助化疗治疗期间，肿瘤与宿主免疫相互作用的动态性质发生了巨大变化。未经治疗的肿瘤对化疗的免疫反应似乎受到预先存在的免疫特性的强烈影响，表明肿瘤的免疫原性在很大程度上是一种固有的特性，尽管在治疗中的表型比治疗前的肿瘤更明显。因此，在化疗和其他抗癌治疗过程中监测肿瘤的免疫动态，可以比单纯的基线特性更准确地早期预测治疗反应。

病人登记和样本收集

这项研究得到韩国首尔三星医疗中心(SMC)机构审查委员会(IRB)的审查和批准(IRB No.2014-11-015)，并得到患者知情同意，用于临床和基因组数据的研究。临床研究Www.clinicaltrials.gov(NCT 02591966)。所有患者均经组织学证实为浸润性乳腺癌，并在SMC治疗。采用标准新辅助化疗[AC-D(H)]方案，采用阿霉素联合环磷酰胺(AC)联合化疗4个周期，然后采用多西紫杉醇(T)化疗4个周期。根据ASCO的指导原则，对HER 2+BC患者在AC后给予多西他赛联合曲妥珠单抗治疗。对每例患者，在治疗前前瞻性地进行肿瘤核心活检和匹配的血液检查(T1)。在AC(T2)的第一个周期后3周进行第二次核心活检，6个月后(T3)在手术中进行第三次肿瘤活检。

收集210例患者中的201例新鲜冷冻组织标本。所有活检标本均在采集后即刻或15 min内处理。手术标本(T3)取标本后，在手术台上进行大体检查。我们排除了肉眼看不见的、有非常小的、分散的肿瘤或在大体检查时含有大部分坏死或纤维瘢痕样组织的标本。根据SMC的方案，大部分保乳手术后的标本被送往乳腺X线片，以确保新辅助化疗前夹子位于肿瘤的中心区域。

肿瘤纯度估计

制备5-μm厚的H&E片，由两位病理学家(YLC，SYC)进行分析，以确定肿瘤细胞的存在和百分比。肿瘤丰富的区域在必要时被标记为手工宏观解剖，避免了大面积的坏死。肿瘤纯度以肿瘤细胞(肿瘤细胞、淋巴细胞和正常细胞)在标记肿瘤区域中所占的百分比计算。我们排除了55例下一代测序(NGS)，因为低肿瘤纯度和低DNA/RNA产量或质量(图)。1B)。我们还用小面计算出肿瘤的纯度。44(补充数据)1根据计算和病理估计，从低肿瘤纯度(<20%)的下游分析中排除了5个样本。NGS数据QC分析排除了另外四个样本，原因是读取覆盖率不足或异常数据表达模式。用小面衍生肿瘤纯度估计值作为协变量进行回归分析。

全转录组序列

用TruSeq RNA样品制备试剂盒v2(RS-122-2001和RS-122-2002，Illumina)制备了RNA-Seq测序文库.RNA文库的测序是在Illumina HiSeq 2500的100 bp配对模式下进行的，分别是TruSeq快速PE群集试剂盒和TruSeq快速SBS试剂盒。用rSEM分析rna-seq。45以hg 19为参考基因的管道。

乳腺癌亚型分类

IHC检测ER、PR、HER 2亚型，应用于临床诊断和治疗。为了确认，我们还预测了使用genefu的PAM 50亚型。46基因表达数据。用PAM 50亚型对IHC亚型进行定位：Er+(Lumina A和Lumina B)、ER+/HER 2+(Lumina B和Her2)、HER 2+(Her2)和TN(Basal)。在IHC和PAM 50不一致的情况下，我们通过检查单个标记来选择一个亚型，包括ERBB 2, ESR 1，和PGR基因表达ERBB 2拷贝号47.

差异表达及通路分析

我们应用线性混合效应模型来识别NAC治疗时间点差异表达的基因，同时调整乳腺癌亚型和肿瘤纯度的混杂效应。在不同样本组中分别对三个配对比较(T1对T2、T2对T3和T1对T3)进行De分析，包括总体队列和三种亚型ER+、HER 2+和TN。ER+/HER 2+亚型由于T3样本数量不足而被排除在外。一份重要DE基因的汇总列表是通过以下方法选择的p-所有配对比较和样本组的值<0.01，绝对倍数变化>2。基于K均值的共识聚类48对每个样本组的显着性DE基因的表达谱进行了分析，以确定每组的三个聚类。

对每一组显着性DE基因进行超几何学测试，以确定从MSigDB V5.1中提取的三组编码基因的富集与已知的与癌症相关的途径。49-标志，KEGG，和自述我们计算了MSigDB通路以及主要免疫和肿瘤相关细胞类型的基因表达特征评分。34使用GSVA算法28。在同一样本组中，FDR<20%并具有FDR<5%的差异表达特征(T1对T2，T2 vs.T3，T1 vs.T3)被定位到DE基因簇上。为了进一步解决免疫细胞的混合问题和区分密切相关的细胞类型，我们采用nu-支持向量回归(Nusvr)方法实现了一种在硅免疫细胞中的反褶积方法。32利用RNA-Seq数据推断各肿瘤中所有白细胞中13种免疫细胞亚型的相对比例。

识别随时间变化的差异分布特征

包括VOOM在内的分子特征的分布50对不同处理时间的正常基因表达、基因标记和推测的免疫细胞组分进行比较，以找出显着性差异。放任ωj表示包含随机变量观测值的数据集。yIJ特征j连同临床资料(派, si, ti, di，和ri)N样本(i)，其中的特征yIJ提供了资料，以便[[omega_{matrem{j}}，=]，=，y_{{matrm{i}}，p_{matrm{i}，s_{matrm{i}，t_{matrem{i}，d_{matrem{i}，r_{matrem{i}_{i}{i=1，\l点，N})。由于特征假设是相互独立的，并且以单变量的方式处理，因此特征指数。j为了简单起见，本节将进一步省略。临床资料包括肿瘤样本纯度(p)，它描述在给定样本中存在的肿瘤组织的百分比，协商一致的亚型(s)，其中列出了每个患者的模式肿瘤亚型、收集时间(t)，它代表每个样本获得的治疗时间，病人供体(d)每个样本的病理反应状态(r)捐献者。

NAC引起的特征随时间的变化采用线性混合效应回归模型，如

哪里β0是整体特征值(拦截)，β1肿瘤纯度对特征值的影响，β2估计由于子类型造成的特征差异，β3描述处理时间对功能值的影响，bd是一个正态分布的随机变量，其均值为零，表示与d捐献者病人(病人之间的残余物)，以及εi是一个正态分布的随机变量，均值为零，反映了病人体内的残值.给出的平方残差和的约简β3用x-平方检验进行评估，如果时间协变量的增加与模型的拟合优度(Fdr)有统计学意义，则保留特征以供进一步研究。51 < 0.05). A similar approach was applied to identify subtype specific NAC induced feature changes over time but now with the exclusion of the term β2si从埃克。(1)。这个LmertestR包52用于这些分析。

多重免疫荧光(IF)和免疫组织化学(IHC)

采用Opal 7实体肿瘤免疫学试剂盒(PerkinElmer)进行多重IF染色。根据制造商的协议，福尔马林固定的石蜡包埋组织切片用二甲苯固定，再用乙醇梯度再水化，最后用蒸馏水冲洗。用AR9(pd-L1、CD4和CD8)或AR6(CD45RO、CD3和泛细胞角蛋白)缓冲液和微波处理进行抗原提取。将第一抗体pd-L1(克隆E1L3N)孵育，再用蛋白石聚合物HRP进行二次抗体孵育。然后应用Opal-620染料对Pd-L1进行显影，微波处理去除原发抗体和次级抗体。抗体/荧光染料按以下顺序重复：CD4(克隆EP 204)/Opal-520，CD8(克隆4B11)/Opal-570，CD45RO(克隆UCHL 1)/Opal-650，CD3/Opal-540，泛细胞角蛋白(克隆AE1/AE3)/Opal-690。将DAPI应用于原子核的显示后，安装幻灯片，覆盖滑动。使用PerkinElmer Vectra Polaris定量幻灯片扫描仪对多路图像进行成像，并利用信息软件(PerkinElmer，Ver)对图像进行分析。2.4.1)。用抗CD8(SP 57)单克隆抗体免疫组织化学方法检测FFPE组织中CD8，未用Ventana基准XT稀释，通过Optiview DAB IHC检测试剂盒进行免疫组织化学检测。

基于数字H&E图像分析的TIL量化

使用CRImage53病理学家在20×放大率下将三星医学中心的273个细胞标记为淋巴细胞，189个细胞标记为H&E诊断乳腺癌的非淋巴细胞。用于分割的参数是Otsu阈值、minShape=50、FailureRegion=2000和maxShape=800。利用EBImage生成36个参数54对支持向量机分类器进行训练，对单元格进行标记，并输出每个单元的坐标和特征。支持向量机模型由e 1071 svm函数生成，参数类型为C，核=径向，概率=真。对每个独立参数使用Wilcoxon秩和检验，30/36参数有一个p淋巴细胞与非淋巴细胞之间的−05值<1e，表明单因素参数非常显着。我们用“VIPs dzSave”将20×H&E图像平铺成2050×2050像素的瓷砖。采用与训练集相同的参数对瓷砖进行分割，并采用支持向量机模型对其进行分类。通过计算瓷砖相对位置和像素大小的偏移量，对每个瓷砖的输出文件进行合并，以重建特征的全局坐标。支持向量机生成一个分数从0到1，以表示对每个类的信心。筛选标记淋巴细胞大小为60~150，最小支持向量机评分为0.97。标记为非淋巴细胞的细胞的支持向量机评分为≤0.1。大细胞定义为未标记淋巴细胞的细胞，其大小为≥，占所有细胞的第三四分位数。从H&E图像中计算出组织面积。TM(丹麦，HOERSHOLM)使用自定义算法。然后将CRImage获得的淋巴细胞计数除以每例患者的估计组织面积，计算H&E图像中的淋巴细胞密度。数据与线性模型拟合，R2用lm计算。

免疫状态分类

我们使用了i群集55将样本聚类和分类为多个数据类型的联合多变量回归，包括免疫基因表达和免疫细胞组分，并参照一组代表潜在免疫状态的公共潜在变量进行聚类和分类。基于贝叶斯信息准则确定了最优聚类数。免疫状态与免疫特征的关联(Yi)通过求解下列方程，用方差分析(ANOVA)进行计算：

哪里β0是整体特征值(拦截)，β1肿瘤纯度对特征值的影响，β2估计由于免疫状态造成的特征差异。利用统计R软件包的lm函数估计系数。

虚拟显微解剖分析

我们使用非负矩阵因式分解(Nmf)算法进行了虚拟显微解剖分析，将大量肿瘤表达分为代表不同组织间隔的因素。56。将nmf应用于rna-seq基因表达简编，其中包括tcga、ccle、gtex和smc ybc队列中的nac(Nac)和1678个样本。47。基因表达矩阵V分解的NMF算法g基因和s的两个非负矩阵的样本k因子：基因因子矩阵Wn基因权重k因子与样本因子矩阵Hm样品重量k因素。表示k部分和H分别表示k每个样本或块状肿瘤的部分57。NMF在log转化基因表达矩阵V，log上进行。2(TPM+1)，在使用R包NMF的组合队列中，使用了“brunet”算法58。我们运行了30次NMF，并选择了获得最小逼近误差的因式分解作为后续分析的依据。提取每一个样本基因k因子，每个基因的分数g是首先计算出来的，表示它是如何以熵度量为基础的。59。然后用两个标准来选择这些基因。首先，基因分数必须大于\BAR\MU+3\BAR\σ$\text{BAR}\text{MU}+3\text{BAR}\text{σ}$，在哪里(酒吧)和\(巴\西格玛)分别表示分数的中位数和绝对偏差(MAD)。第二，功能的基本组成部分的最大贡献必须大于所有贡献的中位数。利用Fisher‘s精确检验和MSigDB v5.2通路基因集对每个因子的样本基因进行路径富集分析。确定最优k，我们计算了相关系数，并选择了k=14，使系数得分最大化58。为了将NMF因子归属于不同的组织区，我们研究了样本因子权重在已知标记的样本组中的分布情况，并根据样本基因检测了样品的富集途径。我们鉴定了四个肿瘤内在因子，包括TN亚型的F14，HER 2+的F2和两个ER+因子-F1和F4。我们还鉴定了四个代表肿瘤外部区(TME)的因素-TIL因子F13、基质因子F12和两个正常组织因子F3和F7。GTEX研究发现，F3在癌旁组织中超重，而F7在健康正常组织中更丰富。将肿瘤固有和正常组织因子权重相加，形成F-肿瘤和F-正常两种复合因子。

多元分析

我们对混合变量进行了多元回归分析，以评估免疫特征与临床特征之间的关联。评价7个临床变量：病理反应状态(PCR与RD)、TN亚型(是与NO)、HER 2+亚型(是与NO)、肿瘤分期(早期与晚期)、结节期(早期与晚期)、T1、T2肿瘤纯度。评价了T1、T2期肿瘤活检的三种免疫特征：组织病理学分析(TIL密度)、免疫细胞比例(CD8+T细胞、CD4+记忆T细胞、%Mast细胞)和基因表达特征(如细胞毒性细胞、NK细胞和CD8+T细胞)。免疫特征为二元变量时采用Logistic回归，连续变量采用规则线性回归。对于多元线性回归分析，我们求解了该函数。(y=β_0+\β_1x_1+\β_2X_2+\l点+\β_{p}}x_{{p}}+\varepsilon\\varepsilon)哪里βj量化变量之间的关联j有反应。使用“stats”包中的r函数“lm”估计回归系数。β0, β1,… βp以及相应的p价值。对于Logistic回归分析，我们求解了该函数。{({1-p(X)}})=\β_0+\β_1x_1+\β_2X_2+\β_{{p}}+\\β_{p}}+\varepsilon\\β_0+β_2X_2+\\β_{p}}，在哪里\(左)(x\右)={\matrem{Pr}(Y=1 x-X)\)和Y二进制响应变量。用“stats”包中的r函数“glm”估计回归系数。β0, β1,… βp以及相应的p价值。

弹性网60是一种用于变量选择的受惩罚的回归方法，它确定了对响应变量(如PCR状态)有贡献的唯一变量的线性组合。弹性网络通过最小化正则化成本函数来进行变量选择。多变量分析的免疫特征包括24个Binda免疫特征。34并估算了13种免疫细胞类型的细胞组成。根据每个特性被选择超过10,000个引导迭代的次数对特性进行排序，使用的惩罚因子为1。