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多种蛋白酶参与癌细胞间皮素脱落

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发表时间:2020-12-04 09:01作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

间皮素(Mesothelin,MSLN)是一种受谱系限制的细胞表面蛋白,约有30%的人肿瘤组织中有表达,而MSLN的高表达与多种癌症患者的生存率差有关。MSLN在正常组织中的限制表达及其在肿瘤中的频繁表达,使MSLN成为抗体治疗的理想靶点。许多针对MSLN的药物的临床试验已经进行,但是到目前为止,这些药物都没有产生足够的反应来获得FDA的批准。MSLN脱落是导致这些治疗失败的一个重要因素,因为SHEMSLN起诱饵受体的作用,并允许释放与细胞表面msLN结合的抗体。我们对脱落的机制进行了研究,发现ADAM、MMP和BACE家族的成员都参与了脱落,多个蛋白酶可以在同一细胞中产生脱落,抑制脱落极大地增强了以MSLN为靶标的免疫毒素对细胞的杀伤作用。我们的数据表明,控制MSLN的脱落可以大大提高针对MSLN的治疗的活性。

导言

间皮素(mesothelin,msLN)是一种gpi锚定膜蛋白,是一种70 kDa的前体蛋白,被蛋白质分解,产生30 kDa多肽,即从细胞中释放的巨核细胞增强因子和40-45 kDa糖蛋白(Msln)。1,2,3,4,5,6通过磷脂酰肌醇连接到细胞表面。7,8。MSLN与MUC 16结合,在细胞粘附中起作用。9,10和肿瘤进展11。MSLN从细胞表面脱落,在胸腔积液、腹水和血液中产生大量的游离抗原。血清msln被用作癌症患者的筛选生物标志物和监测疗效。12,13。不幸的是,脱落是基于抗体的治疗的障碍,因为它在肿瘤内部提供了一个水槽,降低了它们的效率,也促进了它们在杀死细胞之前从细胞表面释放出来。6.

Sheddases是一种蛋白酶,它将靠近细胞膜或细胞膜内的膜结合蛋白底物切割,并从细胞中释放外显子结构域。其中最著名的是亚当家族的成员。14,15,16。ADAMS的底物包括生长因子、细胞因子、趋化因子和粘附分子。ADAM 17,也被称为TACE,在A 431细胞中介导MSLN脱落。6。而TACE基因敲除仅能降低MSLN的脱落50%,说明其他脱落有一定的作用。为了更深入地了解MSLN的脱落情况,我们测定了MSLN在不同的癌细胞株中脱落时所产生的切割位点。利用RNAseq数据测定脱落酶的表达,敲除编码各种脱落酶的RNA,找出对脱落有重要意义的RNA。结果表明,MSLN在细胞膜附近多处被切割,ADAM 10、ADAM 17、BACE 2、BACE 1和MMP 15均参与MSLN的脱落,多个脱落酶可催化MSLN在同一细胞系中的释放。

结果和讨论

为了确定MSLN被切割的部位,我们研究了5种不同的癌细胞株:KLM 1(胰腺)、KB 31(宫颈)、OVCAR 8(卵巢)、A 431/H9细胞(转染MSLN的表皮样癌)和RH 16(原发性间皮瘤细胞系)。用培养基免疫沉淀MSLN,免疫印迹法和考马斯兰染色法鉴定MSLN的氨基酸末端抗体。图形1A显示一种SDS凝胶,其中MSLN呈40-45 kDa宽带,典型的糖基化蛋白。A 431细胞不表达MSLN。由于检测到一条分子量接近全长MSLN的单带,我们得出的结论是,主要的切割位点在细胞膜附近。图形1B列出经质谱鉴定的最C端msln肽(该肽的全长序列见补充表)。1)。此前有报道称,人腹水、胸腔积液或A 431/H9细胞株的MSLN在C端附近的两个位置被切断。6,17。一个卵裂在Y和L之间的残基586处,另一个在L和S之间的残馀591处(如图所示)。1B,切点3和6)。我们现在已经确定了其他几个切割点(图)。1B)。所有切割点都位于靠近质膜的位置。这些结果表明,靠近细胞膜的区域是脱落酶切割的主要部位。位点的多样性增加了不同酶在不同细胞中脱落的可能性。

图1:MSLN C端序列的识别.

a用小鼠单克隆抗体MN从细胞培养液中免疫沉淀MSLN。对标记为MSLN的区域进行LC-MS分析。A 431细胞不表达MSLN。KB 31为KB,KLM为KLM 1,RH为RH 16,OVCAR 8为OV,A 431/H9为H9,MSLN稳定转染。IgG H,重链。b不同细胞系MSLN的C末端序列。A 431/H9序列来自已发表的数据6。箭头表示切割点。

亚当家族

为了鉴定导致脱落的蛋白酶,我们分析了几个RNAseq数据库,以确定哪种脱落酶在我们的细胞系中表达。Https://depmap.org/portal/ccle)。在KLM 1、KB 31和OVCAR 8细胞中,ADAM 9、10、15和17(补充表)表达了ADAM 9、10、15和17。2)。ADAM 17在A 431/H9细胞中对MSLN的脱落具有重要作用。6。图形2A,b(完整图像补充图。1ADAM 17表达降低对KB 31细胞MSLN分泌无明显影响,但使KLM 1细胞脱落率降低45%。这些数据表明ADAM 17是KLM 1的脱落酶,并表明其他蛋白酶必须参与脱落。ADAM 9、10和15也具有蛋白酶活性。14并在这些细胞系中表达(补充表)2)。图形2C,d结果表明,ADAM 10基因敲除后,KLM 1和OVCAR 8细胞脱落减少,而ADAM 17和ADAM 10基因敲除后脱落率下降幅度均大于单片图。2E,f。然而,ADAM 9和ADAM 15的敲除并不降低MSLN的脱落(补充图)。24)。ADAM 9、10和15的敲除并不能减少KB 31细胞脱落(附图)。2).

图2:ADAM 10和ADAM 17的基因敲除可减少KLM 1和OVCAR 8细胞的MSLN脱落,而在KB 31细胞中无明显影响。

a转染siRNAs后,用抗ADAM 17抗体进行westernblot分析。肌动蛋白是一个负荷控制(完整的印迹显示在补充图。1). b细胞培养48-72ha (P=0.018和0.022,n=3)。c, d将ADAM 10 siRNA或对照组转染KLM 1和OVCAR 8细胞。ADAM 10 RNA在48h后进行实时PCR分析。c转染48~72h后,检测msLN的表达。dKLM 1,P=0.034;OVCAR 8,P=0.0006,n=3)。e, f位于KLM 1的MASH MSLN(e P=0.0146、0.00037和0.00007,n=3)或OVCAR 8(f P=0.0014,0.00013,0.00006,n(3)对照组、ADAM 10、ADAM 17和双重敲除siRNAs转染48~72h后进行培养分析。通过WST-8细胞生长试验,将细胞生长过程中的MSLN水平归一化。统计学意义按星号表示(*)P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001).

MMPs

Mt-mmp(膜型基质金属蛋白酶)是MMP家族的一个亚组,也可以作为典型的脱落酶。16。MMP 14、15、17、24和25都是MT-MMPs.我们发现MMP 14在KLM 1细胞中高表达,MMP 15在KB 31、KLM 1和OVCAR 8细胞中高表达(补充表)。2)。我们观察到MMP 15的敲除降低了KB 31细胞中MSLN的表达(图1)。3A,b)。MMP 14或MMP 15的敲除并不能减少KLM 1细胞中MSLN的脱落(图1)。3C,d)或OVCAR 8细胞(补充图1)5),但稍微增加了脱落。

图3:MMP 15基因敲除可降低KB 31细胞的MSLN脱落,但对KLM 1细胞无明显影响。

a用siRNA MMP 15转染KB 31细胞。48h后进行实时PCR分析。b在KB 31(**)中转染siRNA siMP 15_1后72h,检测SHED MSLN。P=0.009,n=4)。对,siRNA siMP 15_2(*)后48 h测得Sd MSLN。P=0.043,n=5)。c, d将siMP 14和siMMP 15的siRNA转染KLM 1细胞。n=5)。相对RNA水平(c)和棚(d)进行了类似的分析,如ab.

BACE 1和BACE 2

BACE 1和BACE 2能切割淀粉样前体蛋白(APP),在阿尔茨海默病中得到了广泛的研究。18。他们也参与了其他蛋白质的加工。16,19,20。我们发现BACE 2和BACE 1 RNA在许多细胞系中都有表达(补充表)。2)。为了确定BACE 2蛋白是否也表达,我们做了Western印迹,观察了BACE 2在KB 31、MS 751、T3M4和AsPC 1细胞中的表达(补充图)。6)。为了确定BACE 2是否参与脱落,将两种靶向人BACE 2的siRNA转染到KB 31细胞中。Westernblots显示,当BACE 2蛋白被敲掉时(如图所示)。4A,全图像补充图。7),总细胞相关的MSLN显著增加(如图所示)。4B流式细胞仪检测细胞表面MSLN含量增加。4C),而大棚MSLN则大幅度减少(如图所示)。4D)。这些数据表明,在KB 31细胞中,BACE 2的敲除通过减少MSLN的脱落而增加细胞相关的MSLN。

图4:BACE的击倒降低KB 31细胞的MLSN脱落。

a将靶向BACE 2的两种不同siRNA寡核苷酸转染KB 31细胞,72h后,用抗BACE 2抗体进行Westernblotting分析。b细胞被处理为a用抗MSLN抗体涂抹。抗肌动蛋白是一个负荷控制(完整的印迹显示在补充图.7). c转染BACE 2 siRNA,72h后用抗MSLN-Alexa 647标记,流式细胞仪分析。d培养48~72h收集BACE 2 siRNA,检测msln。n=3,*P=0.03)。e转染siBACE 1和siBACE 2 48h后RNA水平的实时PCR分析。f转染BACE 1和BACE 2后48~72h测定sdMSLN水平(n=6,*P < 0.00001).

由于BACE 1 RNA也在KB 31细胞中表达,尽管其表达水平低于BACE 2(补充表)2),我们击倒了他们。4E),并发现BACE 1或BACE 2的基因敲除可使大鼠的MSLN水平降低到同样的程度(图1)。4F)。但两者均未进一步降低MSLN的脱落率。

因为BACE 2在我们的细胞系面板中的表达比BACE 1更多(补充表)2),我们检测了BACE 2在宫颈癌细胞系MS 751和两个胰腺癌细胞系AsPC 1和T3M4中的作用。图形5A表明用于BACE 2的siRNAs降低了BACE 2蛋白水平(完整的图像补充图)。8)。图形5B表明在这三个品系的培养基中,MSLN明显降低。MS 751下降60%,T3M4下降55%,AsPC 1下降23%。在KLM 1和BACE 1以及OVCAR 8中,我们也降低了BACE 1,但MSLN脱落没有减少(补充图)。9)。总之,这些数据表明BACE 2(但可能不是BACE 1)起着MSLN脱落的主要作用。

图5:BACE 2在MS 751、T3M4和AsPC 1细胞中的敲除可减少MSLN的脱落。

a将BACE 2 siRNA转染MS 751、T3M4和AsPC 1 72小时后,用免疫印迹法检测细胞裂解物。8). bBACE 2 siRNA后48~72h采集大棚MSLN。MS 751(n=3,P < 0.00001), T3M4 (n=3,P=0.0031),AsPC 1(n=3,P=0.01)。与负性对照siRNA比较的统计学意义由星号(*)显示。P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001).

BACEs、ADAMS和MMPs的小分子抑制剂可减少msln脱落。

Lanabecestat(LY 3314814)和LY 2886721是BACE 1和BACE 2的有效抑制剂,已用于临床试验。16,21,22。我们在MSLN脱落受到BACE 2基因敲除影响的细胞系上测试了抑制剂。两种药物均能抑制MSLN在KB 31细胞中脱落50%以上,在MS 751、T3M4和AsPC 1细胞中分别抑制30~40%(如图1所示)。6A)。两种药物均不抑制KLM 1和OVCAR 8细胞MSLN的脱落(图1)。6A),其BACE 2非常低(补充表)2)。然后我们测定了亚当抑制剂TMI-1和MMP抑制剂Marimastat对几个细胞株的活性。图形6B结果表明,TMI-1能显著降低KLM 1中MSLN的脱落量,并影响OVCAR 8和T3M4。Marimastat可抑制KB 31、KM1、T3M4和OVCAR 8细胞脱落。Marimastat是所有主要基质金属蛋白酶的一种有效的广谱抑制剂。23。我们只敲掉了膜结合的基质金属蛋白酶,其他的基质金属蛋白酶可能在MSLN脱落中起作用。

图6:BACE,ADAM,MMP的抑制剂。

a将LY 2886721或Lanabecestat细胞与KB 31、MS 751、T3M4、AsPC 1或KLM 1细胞在96孔板中孵育48h,测定培养基中的msLN(均为KB 31)。P < 0.0001; KLM1, P=0.77和0.38;T3M4,P=0.0006和0.031;OVCAR 8,P=0.118和0.987;MS 751,P < 0.0001 and 0.009; AsPC1, both P < 0.0001, n=3)。b共培养10株mTMI-1或10 MMarimastat细胞,测定细胞脱落MSLN(TMI-1,TMI-1,P=0.084,<0.0001,0.002,0.00014;Marimastat:P=0.0002,0.0003,<0.0001,<0.0001,n=3)。C-fKB 31细胞c, d)分别用10 MLanabecestat或10 MMarimastat或同时使用OVCAR 8(e, f)用TMI-1或Marimastat治疗,或两者兼用。棚屋MSLN水平显示(c P=0.0005,<0.0001,<0.0001;e P=0.002,0.0023,0.0027,n=3)。KB 31(d)或OVCAR 8(f)与抑制剂共同孵育20h,加入指示浓度的SS1P 72 h,用WST-8法测定细胞活力。Lana Lanabecestat,Mari Marimastat(ns不显着,*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001).

由于我们的基因敲除研究表明MMP 15和BACE都能抑制KB 31细胞的脱落,所以我们测试了这些酶的抑制剂。图形6C结果表明,拉纳必泰对脱落的抑制率为30%,马司他司他的抑制率为50%,组合的抑制率为80%。结果表明,在同一细胞株中,两种酶均能介导脱落。此外,我们怀疑还涉及一个额外的脱落酶,因为脱落并没有被完全抑制。为了确定这种抑制是否会增强免疫毒素的作用,我们用这些抑制剂处理细胞20小时,然后加入SS1P,一种杀死msln表达细胞的免疫毒素。1。我们发现IC50从无抑制剂的4.6ng/ml增至1.1ng/ml的Marimastat、1.3ng/ml的Lanabecestat和0.29ng/ml的两者(图二)。6d)。在OVCAR 8细胞中也检测了这些抑制剂。如图所示。6E,他们刺激SS1P的杀戮;IC50TMI-1为7.8~1.3 ng/ml,Marimastat为2.8 ng/ml,两者均为0.94 ng/ml。这些数据表明,在单个细胞系中,多个蛋白酶参与了MSLN的脱落和抑制,使细胞对靶向MSLN的药物敏感。

BACEs是否参与其他蛋白质的脱落?

BACEs在MSLN脱落中起着重要作用,这一意外发现增加了它们影响其他蛋白质释放/脱落的可能性。为此,我们用20μM Lanabecestat处理5个细胞系20h,并测定了培养液中几种蛋白质和细胞因子的含量(补充表)。3)。如预期一样,所有品系的MSLN水平均有所下降,但KLM 1的下降幅度较小,且无显着性差异。

对HER1(EGFR)的脱落有较小的抑制作用,在一个细胞系(MS 751)中对CA 125有较小的抑制作用。对叶酸受体无明显影响,如msn是PI连接的,也不影响转化生长因子-β1和加连蛋白3的表达。我们认为,BACEs对MSLN脱落的作用是相对特异的。

MBTPS 1和MEPRIN

MBTPS 1也被发现在蛋白质加工中起着重要的作用。16。我们击倒了KB 31和KLM 1细胞中的MBTPS 1,发现MSLN脱落没有变化(补充图)。10)。由于在发生切割的MSLN地区没有R残留物,而MBTPS 1的切割要求在P4处有R残留量,这是预期的结果。我们还考虑了MEP1A和MEP1B RNA参与脱落的可能性,但CCLE显示MEP1A和MEP1B RNA水平在我们的细胞系中非常低。

结语

我们在这里表明,MSLN的脱落是一个出乎意料的复杂过程,它涉及许多不同的酶,在靠近细胞膜的几个部位切割MSLN。我们使用了几种抑制剂,可大大减少MSLN脱落,并大大增强针对MSLN的免疫毒素对细胞的杀伤作用。BACE基因敲除抑制KB 31细胞脱落,而BACE抑制剂Lanabecestat对KLM 1细胞MSLN脱落无抑制作用(图4)。6A),OVAR 8(图1)。6A)和RH 16(附图)。11)。由于ADAM 17是在ADAM 17基因敲除敏感的细胞系中发现的,并且受到ADAM 17抑制剂TMI-1的抑制,所以第3位点的切割可能是由ADAM 17引起的。KB 31细胞不具有切割位点3,对TMI-1不敏感.我们预计,这些抑制剂还将提高抗体药物结合物、嵌合抗原受体(CARS)和其他正在开发的针对表达msLN的癌症的抗体基础疗法的活性。选择性MSLN脱落抑制剂可使接受针对MSLN表达肿瘤的抗体治疗的患者受益。

方法

材料

抑制剂LY 2886721、Lanabecestat和Marimastat分别来自Selleck化学品公司和TMI-1公司。抗ADAM 17和抗ADAM 9分别来自细胞信号技术(Cat:3976 S和4151 S,1:000稀释度),抗BACE 2抗体来自圣克鲁斯生物技术(sc-271212,1:1000稀释度),抗-MSLN抗体(小鼠单克隆MN,1μg/ml)来自本实验室。针对人ADAM 17:S 13719(SiADAM 17_1)和si13720(SiADAM 17_2)的siRNA和针对ADAM 10:S 1004的siRNA分别来自热Fisher科学。所有其他靶加siRNA和阴性对照siRNA荧光素酶GL2均来自Dharmacon。

细胞培养

KB 31、KLM1、AsPC 1和A 431/H9细胞以前曾被描述过。24,25,T3M4来自何氏分枝杆菌(M.Ho(NCI))。OVCAR 8和MS 751细胞购自ATCC。KB 31、KLM1、T3M4和AsPC 1在RPMI-1640培养基中培养。MS 751细胞在Emem培养基中培养。所有培养基均添加10%的FBS和1%的念珠菌.细胞保持在5%CO237°C时,所有细胞均定期检测支原体污染情况。

击倒实验

所有细胞均用脂质体RNA iMAX试剂转染,按厂家规定在6孔或96井内转染。在6孔板的每口井中镀5×10e5细胞,在96孔板的每口井中镀5000个细胞。在平板上24h后,以60 nm的终浓度分别以2ml或100 mL-1的浓度转染siRNAs。SiRNA寡核苷酸序列列在补充表中4.

可溶性MSLN法

经siRNA转染或抑制剂处理后,收集细胞培养液。培养培养基于3000 r.pm离心。台式离心机10分钟,稀释5-10倍,稀释#100,并使用R-PLEX人MSLN抗体集,按制造商的指示(中尺度发现,罗克维尔,MD)。在Meso QuickPlex SQ仪器上进行了电化学发光测量。细胞密度与生长条件密切相关。在这些研究中,六孔板格式的细胞与培养基的比例较高,在不同的实验条件下,MSLN的含量在5~50 ng/ml之间变化。MSLN水平通常采用WST-8法进行归一化,以纠正细胞生长的差异。

实时PCR

用三唑试剂(Invitrogen)制备RNA。反转录和cDNA合成按照制造商的指示使用Quantitect反转录试剂盒。引物列在补充表中4。采用定量快速SYBR绿色PCR主试剂盒进行PCR反应。

WESTERNBLOTTING

在含有50 mM Tris HCl、150 mm NaCl、5 mm EDTA、1%NP 40和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中制备细胞球团。在还原条件下,用相同量的蛋白质在4%-12%的双三醇凝胶上运行SDS-PAGE。将蛋白转移到PVDF膜上,用适当的抗体进行westernblot分析。补充图中显示了完整的污迹。1, 7, 8, 1112.

流式细胞术检测表面MSLN的表达

将BACE 2 siRNA转染KB 31细胞48 h,将MN抗体与AlexaFluor-647结合染色,用FACSCantoⅡ流式细胞仪进行分析。用FlowJov10.4.2软件对数据进行分析。数据一次收集,实验重复三次。结果用一个实验的平均±SD表示。

细胞毒性试验

在96孔板中共播种了10,000个细胞,并在指示浓度下加入了各种抑制剂.处理20h后,加入SS1P系列稀释剂一式三份。在进行WST-8细胞活力分析之前,细胞再孵育72小时(Dojindo分子技术)。用GraphPad棱镜v7.05对DMSO对照样品进行细胞死亡计算。可行性表示为OD读数的百分比。450与对照组相比,SS1P组无SS1P处理。

肿瘤细胞株的基因表达分析

在寻找MSLN表达的候选酶时,从MSLN高表达的细胞系中提取ADAMS、BACEs和MMPs mRNA水平。OVCAR 8、T3M4、AsPC 1和MS 751的表达数据是从广谱研究所肿瘤细胞株百科全书(CCLE)上下载的,基因在KB 31和KLM 1细胞中的表达情况由本小组先前的RNAseq实验确定。

凝胶胰蛋白酶消化

用50%ACN/25 mm NH对Coomassie染色的凝胶带进行切割和脱色。4HCO3,pH 8.4。去除有机溶剂后,凝胶片真空干燥45 min。干燥的凝胶片用50μl的胰蛋白酶(20 ng/μl)再悬浮在25 mm NH中再水化。4HCO3在冰上孵育30分钟。去除多余的胰蛋白酶,代之以25 mm NH的30μl。4HCO3,pH 8.4。样品在37℃下孵育一夜。用70%(v/v)ACN/0.1%TFA从凝胶带中提取多肽。提取液经冻干后,用C18柱(热学)脱盐,再用0.1%TFA进行重组。

质谱采集与数据分析

将样品注射到简易NLC 1000高效液相色谱(Thermo Science)上,并与轨道饶舌聚变质谱仪(Thermo Science)耦合。采用PEPMAP 10 0 C18 2 cm捕集柱和2 5cm分析柱(热学)配置简易NLC,样品在2 5 0nL/min梯度下运行90 min。前兆扫描在轨道上进行,分辨率为60,000,质量范围为375-1500。m/z在离子阱中以7500的分辨率进行MS/MS分析。归一化的Collison能量为29,排除了电荷态1和未分配的电荷态。利用蛋白质组Discoverer 2.2(Thermo Science,CA)中的SEQUEST算法,在人UniProt蛋白数据库或间皮林(UniProt Number Q 13421 iso#1)上检索获得的MS/MS谱。酶为胰蛋白酶(半酶),前体离子耐受性为10 ppm,碎片离子耐受性为0.6Da,其中蛋氨酸氧化为动态修饰。肽验证由Percolator或Target Decoy PSM Validator进行,FDR设置为0.1%。


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