多种蛋白酶参与癌细胞间皮素脱落

间皮素(Mesothelin，MSLN)是一种受谱系限制的细胞表面蛋白，约有30%的人肿瘤组织中有表达，而MSLN的高表达与多种癌症患者的生存率差有关。MSLN在正常组织中的限制表达及其在肿瘤中的频繁表达，使MSLN成为抗体治疗的理想靶点。许多针对MSLN的药物的临床试验已经进行，但是到目前为止，这些药物都没有产生足够的反应来获得FDA的批准。MSLN脱落是导致这些治疗失败的一个重要因素，因为SHEMSLN起诱饵受体的作用，并允许释放与细胞表面msLN结合的抗体。我们对脱落的机制进行了研究，发现ADAM、MMP和BACE家族的成员都参与了脱落，多个蛋白酶可以在同一细胞中产生脱落，抑制脱落极大地增强了以MSLN为靶标的免疫毒素对细胞的杀伤作用。我们的数据表明，控制MSLN的脱落可以大大提高针对MSLN的治疗的活性。

间皮素(mesothelin，msLN)是一种gpi锚定膜蛋白，是一种70 kDa的前体蛋白，被蛋白质分解，产生30 kDa多肽，即从细胞中释放的巨核细胞增强因子和40-45 kDa糖蛋白(Msln)。1,2,3,4,5,6通过磷脂酰肌醇连接到细胞表面。7,8。MSLN与MUC 16结合，在细胞粘附中起作用。9,10和肿瘤进展11。MSLN从细胞表面脱落，在胸腔积液、腹水和血液中产生大量的游离抗原。血清msln被用作癌症患者的筛选生物标志物和监测疗效。12,13。不幸的是，脱落是基于抗体的治疗的障碍，因为它在肿瘤内部提供了一个水槽，降低了它们的效率，也促进了它们在杀死细胞之前从细胞表面释放出来。6.

Sheddases是一种蛋白酶，它将靠近细胞膜或细胞膜内的膜结合蛋白底物切割，并从细胞中释放外显子结构域。其中最著名的是亚当家族的成员。14,15,16。ADAMS的底物包括生长因子、细胞因子、趋化因子和粘附分子。ADAM 17，也被称为TACE，在A 431细胞中介导MSLN脱落。6。而TACE基因敲除仅能降低MSLN的脱落50%，说明其他脱落有一定的作用。为了更深入地了解MSLN的脱落情况，我们测定了MSLN在不同的癌细胞株中脱落时所产生的切割位点。利用RNAseq数据测定脱落酶的表达，敲除编码各种脱落酶的RNA，找出对脱落有重要意义的RNA。结果表明，MSLN在细胞膜附近多处被切割，ADAM 10、ADAM 17、BACE 2、BACE 1和MMP 15均参与MSLN的脱落，多个脱落酶可催化MSLN在同一细胞系中的释放。

为了确定MSLN被切割的部位，我们研究了5种不同的癌细胞株：KLM 1(胰腺)、KB 31(宫颈)、OVCAR 8(卵巢)、A 431/H9细胞(转染MSLN的表皮样癌)和RH 16(原发性间皮瘤细胞系)。用培养基免疫沉淀MSLN，免疫印迹法和考马斯兰染色法鉴定MSLN的氨基酸末端抗体。图形1A显示一种SDS凝胶，其中MSLN呈40-45 kDa宽带，典型的糖基化蛋白。A 431细胞不表达MSLN。由于检测到一条分子量接近全长MSLN的单带，我们得出的结论是，主要的切割位点在细胞膜附近。图形1B列出经质谱鉴定的最C端msln肽(该肽的全长序列见补充表)。1)。此前有报道称，人腹水、胸腔积液或A 431/H9细胞株的MSLN在C端附近的两个位置被切断。6,17。一个卵裂在Y和L之间的残基586处，另一个在L和S之间的残馀591处(如图所示)。1B，切点3和6)。我们现在已经确定了其他几个切割点(图)。1B)。所有切割点都位于靠近质膜的位置。这些结果表明，靠近细胞膜的区域是脱落酶切割的主要部位。位点的多样性增加了不同酶在不同细胞中脱落的可能性。

亚当家族

为了鉴定导致脱落的蛋白酶，我们分析了几个RNAseq数据库，以确定哪种脱落酶在我们的细胞系中表达。Https://depmap.org/portal/ccle)。在KLM 1、KB 31和OVCAR 8细胞中，ADAM 9、10、15和17(补充表)表达了ADAM 9、10、15和17。2)。ADAM 17在A 431/H9细胞中对MSLN的脱落具有重要作用。6。图形2A，b(完整图像补充图。1ADAM 17表达降低对KB 31细胞MSLN分泌无明显影响，但使KLM 1细胞脱落率降低45%。这些数据表明ADAM 17是KLM 1的脱落酶，并表明其他蛋白酶必须参与脱落。ADAM 9、10和15也具有蛋白酶活性。14并在这些细胞系中表达(补充表)2)。图形2C，d结果表明，ADAM 10基因敲除后，KLM 1和OVCAR 8细胞脱落减少，而ADAM 17和ADAM 10基因敲除后脱落率下降幅度均大于单片图。2E，f。然而，ADAM 9和ADAM 15的敲除并不降低MSLN的脱落(补充图)。2–4)。ADAM 9、10和15的敲除并不能减少KB 31细胞脱落(附图)。2).

MMPs

Mt-mmp(膜型基质金属蛋白酶)是MMP家族的一个亚组，也可以作为典型的脱落酶。16。MMP 14、15、17、24和25都是MT-MMPs.我们发现MMP 14在KLM 1细胞中高表达，MMP 15在KB 31、KLM 1和OVCAR 8细胞中高表达(补充表)。2)。我们观察到MMP 15的敲除降低了KB 31细胞中MSLN的表达(图1)。3A，b)。MMP 14或MMP 15的敲除并不能减少KLM 1细胞中MSLN的脱落(图1)。3C，d)或OVCAR 8细胞(补充图1)5)，但稍微增加了脱落。

BACE 1和BACE 2

BACE 1和BACE 2能切割淀粉样前体蛋白(APP)，在阿尔茨海默病中得到了广泛的研究。18。他们也参与了其他蛋白质的加工。16,19,20。我们发现BACE 2和BACE 1 RNA在许多细胞系中都有表达(补充表)。2)。为了确定BACE 2蛋白是否也表达，我们做了Western印迹，观察了BACE 2在KB 31、MS 751、T3M4和AsPC 1细胞中的表达(补充图)。6)。为了确定BACE 2是否参与脱落，将两种靶向人BACE 2的siRNA转染到KB 31细胞中。Westernblots显示，当BACE 2蛋白被敲掉时(如图所示)。4A，全图像补充图。7)，总细胞相关的MSLN显著增加(如图所示)。4B流式细胞仪检测细胞表面MSLN含量增加。4C)，而大棚MSLN则大幅度减少(如图所示)。4D)。这些数据表明，在KB 31细胞中，BACE 2的敲除通过减少MSLN的脱落而增加细胞相关的MSLN。

由于BACE 1 RNA也在KB 31细胞中表达，尽管其表达水平低于BACE 2(补充表)2)，我们击倒了他们。4E)，并发现BACE 1或BACE 2的基因敲除可使大鼠的MSLN水平降低到同样的程度(图1)。4F)。但两者均未进一步降低MSLN的脱落率。

因为BACE 2在我们的细胞系面板中的表达比BACE 1更多(补充表)2)，我们检测了BACE 2在宫颈癌细胞系MS 751和两个胰腺癌细胞系AsPC 1和T3M4中的作用。图形5A表明用于BACE 2的siRNAs降低了BACE 2蛋白水平(完整的图像补充图)。8)。图形5B表明在这三个品系的培养基中，MSLN明显降低。MS 751下降60%，T3M4下降55%，AsPC 1下降23%。在KLM 1和BACE 1以及OVCAR 8中，我们也降低了BACE 1，但MSLN脱落没有减少(补充图)。9)。总之，这些数据表明BACE 2(但可能不是BACE 1)起着MSLN脱落的主要作用。

BACEs、ADAMS和MMPs的小分子抑制剂可减少msln脱落。

Lanabecestat(LY 3314814)和LY 2886721是BACE 1和BACE 2的有效抑制剂，已用于临床试验。16,21,22。我们在MSLN脱落受到BACE 2基因敲除影响的细胞系上测试了抑制剂。两种药物均能抑制MSLN在KB 31细胞中脱落50%以上，在MS 751、T3M4和AsPC 1细胞中分别抑制30~40%(如图1所示)。6A)。两种药物均不抑制KLM 1和OVCAR 8细胞MSLN的脱落(图1)。6A)，其BACE 2非常低(补充表)2)。然后我们测定了亚当抑制剂TMI-1和MMP抑制剂Marimastat对几个细胞株的活性。图形6B结果表明，TMI-1能显著降低KLM 1中MSLN的脱落量，并影响OVCAR 8和T3M4。Marimastat可抑制KB 31、KM1、T3M4和OVCAR 8细胞脱落。Marimastat是所有主要基质金属蛋白酶的一种有效的广谱抑制剂。23。我们只敲掉了膜结合的基质金属蛋白酶，其他的基质金属蛋白酶可能在MSLN脱落中起作用。

由于我们的基因敲除研究表明MMP 15和BACE都能抑制KB 31细胞的脱落，所以我们测试了这些酶的抑制剂。图形6C结果表明，拉纳必泰对脱落的抑制率为30%，马司他司他的抑制率为50%，组合的抑制率为80%。结果表明，在同一细胞株中，两种酶均能介导脱落。此外，我们怀疑还涉及一个额外的脱落酶，因为脱落并没有被完全抑制。为了确定这种抑制是否会增强免疫毒素的作用，我们用这些抑制剂处理细胞20小时，然后加入SS1P，一种杀死msln表达细胞的免疫毒素。1。我们发现IC50从无抑制剂的4.6ng/ml增至1.1ng/ml的Marimastat、1.3ng/ml的Lanabecestat和0.29ng/ml的两者(图二)。6d)。在OVCAR 8细胞中也检测了这些抑制剂。如图所示。6E，他们刺激SS1P的杀戮；IC50TMI-1为7.8~1.3 ng/ml，Marimastat为2.8 ng/ml，两者均为0.94 ng/ml。这些数据表明，在单个细胞系中，多个蛋白酶参与了MSLN的脱落和抑制，使细胞对靶向MSLN的药物敏感。

BACEs是否参与其他蛋白质的脱落？

BACEs在MSLN脱落中起着重要作用，这一意外发现增加了它们影响其他蛋白质释放/脱落的可能性。为此，我们用20μM Lanabecestat处理5个细胞系20h，并测定了培养液中几种蛋白质和细胞因子的含量(补充表)。3)。如预期一样，所有品系的MSLN水平均有所下降，但KLM 1的下降幅度较小，且无显着性差异。

对HER1(EGFR)的脱落有较小的抑制作用，在一个细胞系(MS 751)中对CA 125有较小的抑制作用。对叶酸受体无明显影响，如msn是PI连接的，也不影响转化生长因子-β1和加连蛋白3的表达。我们认为，BACEs对MSLN脱落的作用是相对特异的。

MBTPS 1和MEPRIN

MBTPS 1也被发现在蛋白质加工中起着重要的作用。16。我们击倒了KB 31和KLM 1细胞中的MBTPS 1，发现MSLN脱落没有变化(补充图)。10)。由于在发生切割的MSLN地区没有R残留物，而MBTPS 1的切割要求在P4处有R残留量，这是预期的结果。我们还考虑了MEP1A和MEP1B RNA参与脱落的可能性，但CCLE显示MEP1A和MEP1B RNA水平在我们的细胞系中非常低。

我们在这里表明，MSLN的脱落是一个出乎意料的复杂过程，它涉及许多不同的酶，在靠近细胞膜的几个部位切割MSLN。我们使用了几种抑制剂，可大大减少MSLN脱落，并大大增强针对MSLN的免疫毒素对细胞的杀伤作用。BACE基因敲除抑制KB 31细胞脱落，而BACE抑制剂Lanabecestat对KLM 1细胞MSLN脱落无抑制作用(图4)。6A)，OVAR 8(图1)。6A)和RH 16(附图)。11)。由于ADAM 17是在ADAM 17基因敲除敏感的细胞系中发现的，并且受到ADAM 17抑制剂TMI-1的抑制，所以第3位点的切割可能是由ADAM 17引起的。KB 31细胞不具有切割位点3，对TMI-1不敏感.我们预计，这些抑制剂还将提高抗体药物结合物、嵌合抗原受体(CARS)和其他正在开发的针对表达msLN的癌症的抗体基础疗法的活性。选择性MSLN脱落抑制剂可使接受针对MSLN表达肿瘤的抗体治疗的患者受益。

材料

抑制剂LY 2886721、Lanabecestat和Marimastat分别来自Selleck化学品公司和TMI-1公司。抗ADAM 17和抗ADAM 9分别来自细胞信号技术(Cat：3976 S和4151 S，1：000稀释度)，抗BACE 2抗体来自圣克鲁斯生物技术(sc-271212，1：1000稀释度)，抗-MSLN抗体(小鼠单克隆MN，1μg/ml)来自本实验室。针对人ADAM 17：S 13719(SiADAM 17_1)和si13720(SiADAM 17_2)的siRNA和针对ADAM 10：S 1004的siRNA分别来自热Fisher科学。所有其他靶加siRNA和阴性对照siRNA荧光素酶GL2均来自Dharmacon。

细胞培养

KB 31、KLM1、AsPC 1和A 431/H9细胞以前曾被描述过。24,25，T3M4来自何氏分枝杆菌(M.Ho(NCI))。OVCAR 8和MS 751细胞购自ATCC。KB 31、KLM1、T3M4和AsPC 1在RPMI-1640培养基中培养。MS 751细胞在Emem培养基中培养。所有培养基均添加10%的FBS和1%的念珠菌.细胞保持在5%CO237°C时，所有细胞均定期检测支原体污染情况。

击倒实验

所有细胞均用脂质体RNA iMAX试剂转染，按厂家规定在6孔或96井内转染。在6孔板的每口井中镀5×10e5细胞，在96孔板的每口井中镀5000个细胞。在平板上24h后，以60 nm的终浓度分别以2ml或100 mL-1的浓度转染siRNAs。SiRNA寡核苷酸序列列在补充表中4.

可溶性MSLN法

经siRNA转染或抑制剂处理后，收集细胞培养液。培养培养基于3000 r.pm离心。台式离心机10分钟，稀释5-10倍，稀释#100，并使用R-PLEX人MSLN抗体集，按制造商的指示(中尺度发现，罗克维尔，MD)。在Meso QuickPlex SQ仪器上进行了电化学发光测量。细胞密度与生长条件密切相关。在这些研究中，六孔板格式的细胞与培养基的比例较高，在不同的实验条件下，MSLN的含量在5~50 ng/ml之间变化。MSLN水平通常采用WST-8法进行归一化，以纠正细胞生长的差异。

实时PCR

用三唑试剂(Invitrogen)制备RNA。反转录和cDNA合成按照制造商的指示使用Quantitect反转录试剂盒。引物列在补充表中4。采用定量快速SYBR绿色PCR主试剂盒进行PCR反应。

WESTERNBLOTTING

在含有50 mM Tris HCl、150 mm NaCl、5 mm EDTA、1%NP 40和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中制备细胞球团。在还原条件下，用相同量的蛋白质在4%-12%的双三醇凝胶上运行SDS-PAGE。将蛋白转移到PVDF膜上，用适当的抗体进行westernblot分析。补充图中显示了完整的污迹。1, 7, 8, 11和12.

流式细胞术检测表面MSLN的表达

将BACE 2 siRNA转染KB 31细胞48 h，将MN抗体与AlexaFluor-647结合染色，用FACSCantoⅡ流式细胞仪进行分析。用FlowJov10.4.2软件对数据进行分析。数据一次收集，实验重复三次。结果用一个实验的平均±SD表示。

细胞毒性试验

在96孔板中共播种了10,000个细胞，并在指示浓度下加入了各种抑制剂.处理20h后，加入SS1P系列稀释剂一式三份。在进行WST-8细胞活力分析之前，细胞再孵育72小时(Dojindo分子技术)。用GraphPad棱镜v7.05对DMSO对照样品进行细胞死亡计算。可行性表示为OD读数的百分比。450与对照组相比，SS1P组无SS1P处理。

肿瘤细胞株的基因表达分析

在寻找MSLN表达的候选酶时，从MSLN高表达的细胞系中提取ADAMS、BACEs和MMPs mRNA水平。OVCAR 8、T3M4、AsPC 1和MS 751的表达数据是从广谱研究所肿瘤细胞株百科全书(CCLE)上下载的，基因在KB 31和KLM 1细胞中的表达情况由本小组先前的RNAseq实验确定。

凝胶胰蛋白酶消化

用50%ACN/25 mm NH对Coomassie染色的凝胶带进行切割和脱色。4HCO3，pH 8.4。去除有机溶剂后，凝胶片真空干燥45 min。干燥的凝胶片用50μl的胰蛋白酶(20 ng/μl)再悬浮在25 mm NH中再水化。4HCO3在冰上孵育30分钟。去除多余的胰蛋白酶，代之以25 mm NH的30μl。4HCO3，pH 8.4。样品在37℃下孵育一夜。用70%(v/v)ACN/0.1%TFA从凝胶带中提取多肽。提取液经冻干后，用C18柱(热学)脱盐，再用0.1%TFA进行重组。

质谱采集与数据分析

将样品注射到简易NLC 1000高效液相色谱(Thermo Science)上，并与轨道饶舌聚变质谱仪(Thermo Science)耦合。采用PEPMAP 10 0 C18 2 cm捕集柱和2 5cm分析柱(热学)配置简易NLC，样品在2 5 0nL/min梯度下运行90 min。前兆扫描在轨道上进行，分辨率为60,000，质量范围为375-1500。m/z在离子阱中以7500的分辨率进行MS/MS分析。归一化的Collison能量为29，排除了电荷态1和未分配的电荷态。利用蛋白质组Discoverer 2.2(Thermo Science，CA)中的SEQUEST算法，在人UniProt蛋白数据库或间皮林(UniProt Number Q 13421 iso#1)上检索获得的MS/MS谱。酶为胰蛋白酶(半酶)，前体离子耐受性为10 ppm，碎片离子耐受性为0.6Da，其中蛋氨酸氧化为动态修饰。肽验证由Percolator或Target Decoy PSM Validator进行，FDR设置为0.1%。