大剂量维生素D3皮下免疫治疗对花粉致哮喘小鼠模型的影响

过敏原特异性免疫疗法(Ait)具有长期预防过敏性疾病的潜力.然而，ait的疗效并不理想，而高剂量变应原的应用则存在安全性问题。佐剂的使用，如1，25(OH)2维特3(VitD 3)，可提高AIT的疗效。我们曾证明，低剂量VitD 3能增强气道炎症的抑制作用，但对草花粉(GP)皮下免疫治疗(SCIT)小鼠过敏性哮喘模型的气道高反应性无明显影响。我们的目的是确定最佳剂量和配方VitD 3的GP SCIT。GP致敏BALBc/ByJ小鼠三次注射VitD3-GP(30,100,300 ng或安慰剂)。分别在VitD3-GP-SCIT制剂(300 Nmol)和对照组中加入合成脂质Saint.随后，用鼻内GP攻击小鼠，检测气道高反应性、GP特异性IgE、-IgG 1、-IgG2a、耳肿胀反应(ESR)、支气管肺泡灌洗液和肺嗜酸性粒细胞。VitD 3剂量依赖诱导对SpIgE、炎症和高反应性的抑制作用明显增强，中和能力增强，ESR降低。VitD 3的加入进一步降低了GP-SCIT对肺组织过敏原的Th2细胞因子和先天细胞因子的应答。然而，在变应原/VitD 3混合物中添加合成脂质对VitD3-GP-SCIT没有额外的影响。我们发现VitD 3对GP-SCIT介导的过敏性炎症和气道高反应性的抑制作用具有明显的剂量依赖性。相反，在变应原/VitD 3混合物中添加合成脂，没有治疗效果。这些研究强调了VitD 3作为佐剂来提高SCIT治疗方案的临床疗效的相关性。

过敏原特异性免疫疗法(AIT)是一种治疗过敏性疾病的方法，它有可能诱导长期缓解过敏症状，并对过敏原产生免疫耐受状态。成功的ait导致药物的使用减少和生活质量的提高。1,2。AIT是一种独特的治疗方式，过敏原通过皮下注射(SCIT)或舌下应用(狭缝)进行治疗。3,4。AIT已被证明能增加调节性T细胞的数量和活性，抑制变应原特异性Th2细胞和2型先天淋巴样细胞(ILC2s)的数量和活性，同时抑制嗜酸细胞性炎症。此外，ait还会引起中和抗体反应，导致肥大细胞和嗜碱性细胞脱敏。3,5。尽管AIT能够诱导对过敏原的长期耐受性，但由于疗效不同和治疗时间长，AIT并不是过敏性哮喘的常规治疗方法。此外，使用具有IgE交联能力的粗变应原提取物也有安全性问题。6。改进ait方案的策略包括在低剂量的变应原中实现最佳抗原表达的替代给药途径。7,8，使用纯化或重组变应原或多肽9,10，或添加佐剂以增强耐受性诱导11.

在AIT中使用佐剂的目的是增加抗原提呈树突状细胞(DC)对变应原的传递和摄取，并提高其耐受性。Ait的一种候选佐剂，1，25-二羟基维生素D 3(VitD 3)，与其核激素VitD 3受体结合，并通过诱导耐受性DC提供免疫调节功能。12。VitD 3可阻止dc-成熟导致共刺激分子(CD 40、CD 80、CD 86)的下调，并促进IL-10的产生。13，促进产生适应性Treg细胞。14。我们之前已经证明，在经典的卵清蛋白诱导的过敏性气道炎症模型中，补充VitD 3在ait中的应用是成功的。15以及在小草花粉(Gp)ait的SCIT和狭缝模型中的应用11。此外，在一项临床研究中，用室内尘螨(Hdm)提取物补充VitD 3对哮喘症状评分有(适度)正向影响，与对照hdm-scit治疗相比，对哮喘症状评分的影响不大。16.

虽然临床迫切需要优化疫苗配方，但迄今很少有研究探索脂质体在ait中的有益应用。17。脂质双层包被变应原形成脂质体，就像纳米粒一样，充当运载工具，形成仓库或起佐剂的作用。用脂质体包封hdm-提取物治疗过敏性哮喘患者的rdbpc试验显示，虽然本研究中没有安全性数据，但在诱导IgG应答和降低嗜酸性粒细胞数量方面显示出了良好的效果。18。本文采用小鼠hdm变态反应模型，研究了脂质体粘附的主要过敏原在鼻内的应用。[医]棘螨)der p1和der p2，发现在降低Th2反应方面同样有效，但与单用粗提物相比，证明在增加Treg细胞因子(如IL-10和TGF-β)方面优于单用粗提物。19.

由于VitD 3的亲脂性，同时在AIT混合物中同时使用水溶性差的VitD 3和冻干的高水溶性GP-提取物并不是最佳的选择。尽管如此，同时给予VitD 3和变应原提取物在一次注射是可取的，以便耐受DC呈现过敏原，而不影响宿主的免疫反应。优化亲水性变应原提取物与脂溶性维生素D 3混合物的配方，可提高疗效。Saint-18(1-methyl-4-(cis-9-dioleyl)methyl-pyridinium-chlorid，saint)是一种合成的与生物相容的脂质体，可形成脂质体结构，可在包封gp提取物的同时作为vtd 3的载体。20。因此，我们假设在GP-SCIT中使用Saint会增强GP-SCIT注射后的耐受性诱导。

在此之前，我们发现在GP-SCIT中添加VitD 3可以促进中和抗体的产生，从而增强对嗜酸性炎症的抑制和肺组织中IL-10的产生。其中，我们使用了单次低剂量的10 ng VitD 3，这并没有增加gp-scit对气道高反应性(AHR)的抑制作用，说明这种低剂量并不是最佳剂量。11。在目前的新研究中，我们的目的是在我们的GP-SCIT模型中寻找最佳VitD 3剂量，以最优地抑制过敏性气道疾病的所有参数。在这里，我们第一次证明高剂量的VitD 3实际上能够减少AHR，Th2细胞因子的产生和肺内嗜酸性粒细胞的数量。此外，我们的目的是测试在GP-SCIT提取物和VitD 3的混合物中使用合成的脂圣是否对实验性GP-SCIT小鼠模型中的过敏性炎症参数有抑制作用。在此，我们清楚地展示了VitD 3对GP-SCIT疗效的可复制的有益作用。

动物

Balb/cByJ小鼠(8~9周龄)从法国的查尔斯河(L‘Arbresle，法国)购买，在单独的通风笼中饲养，喂食低过敏原GP(4千卡/克，25%的蛋白质，11%的脂肪，47%的糖，5%的纤维；AB饮食，荷兰的沃尔登)，其理论前生产水平为2900 IU/kg的维生素D 3。由于维生素D 3对光、空气、热和湿度的高度敏感性，在制造过程中，维生素D 3的实际含量可能会发生变化。试验选用7~9周龄雌性后代(N=8).格罗宁根大学动物保护和使用机构委员会(DEC)批准了许可证号码为DEC 6209的实验，所有实验都是按照相关准则和条例进行的。类似的实验和材料描述可以在以前的实验中找到。21.

过敏性哮喘的诱导及治疗方案

实验第1天和第15天，所有小鼠均接受两次腹腔注射，单位为5000个标准质量单位(5 kSQ=8μg过敏原gp(Gp))。[医]肉豆蔻、Alk-Abelló，H rsholm，丹麦)在100升磷酸盐缓冲盐水中吸附到1.6毫克铝(美国皮尔斯，皮尔斯)。1A、b和4a，b)。

VitD 3补充GP-SCIT后免疫球蛋白反应的研究概况。(a)实验规程。(b)治疗组。(c)血清总IgE(ng/mL)：SCIT前(白色，Pre1)，挑战前(灰色，Pre2)，挑战后(黑色，POST)。(d)血清GP-SpIgE(任意单位(AU)/mL)。(e)GP-spIgG 1。(f)GP-spIgG2a。(g)中和活性以血清中GP-spIgG 1/GP-spIgE比值作图。(h)gp-spIgG2a/gp-spIgE。(i)GP-SpIgE(POST/Pre2)的折叠诱导。(C-f)平均±SEM(n=8)。(g–i)盒子和胡须(最小)。数控阴性对照；Pc阳性对照；PCDPC与VitD 3；0，30,100和300组均含有GP，分别为0，30,100和300 ng VitD 3。*与PC或PCD比较，P<0.05，**P<0.01，*P<0.001：除非另有说明。

全尺寸图像

2周后，SCIT由3例100 LS.C行SCIT。注射，含生理盐水或GP含或不含1α，25-二羟基玻璃体D3(VitD 3，Sigma-Aldrich，荷兰)。在一个单独的实验中，新制备的配方包括GP，VitD 3和或圣-18。总之，300 nmol St-18(WFI中的原料，注射用水)与300 ng VitD 3(乙醇中的原料)混合，然后在玻璃瓶中加入300 kSQ GP。在所有配方中，颗粒尺寸是用Nanotrac Flex原位分析仪(德国Microtrac)确定的，被认为适合于注射。

第45、47、49天，用25μL PBS吸入25 kSQGP微滴吸入异氟醚。2天后，测定气道反应性，并将血清标本、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺叶(−80°C)保存起来进行进一步分析。两组实验均采用不同批次的粗提草花粉([医]肉豆蔻，225；ID nr.1031225。批号：Ph1 0035和Phl 0043，仅供研究用)10,22.

早期超敏反应：EST

SCIT后行耳肿胀试验(EST)评价GP的早期反应.本实验以10μL的PBS为对照，在异氟醚/氧麻醉下右耳注射GP 1 kSQ 10μL。2 h后，用Diimatic测力仪测量0.5N(±0.15 N，日本Mitutoyo)的耳厚，并从右耳减去左耳厚度，计算GP诱发的耳肿胀(Δ，以mm为单位)。22,23.

气道反应性

通过测量气道阻力(R在CMH中)2(Os/mL)静脉注射增加剂量的甲胆碱(Sigma-Aldrich)后，评估气道反应性。其次是肺顺应性(C/mL/H)2(O)作为肺相对僵硬度的衡量标准。简单地说，麻醉小鼠被气管切开，经颈静脉插管，并附在小动物呼吸机上；挠性呼吸机(加拿大SCIREQ)和通气量(280次/min)，潮气量10 mL/kg，压力限制在300 MMH。2O.随着甲胆碱用量的增加，根据2 s伪随机压力波的压力响应计算气道阻力。在分析峰值阻力(R)和峰顺应性(C)时，排除所有一个决定系数(COD)值低于0.85的值。此外，反应性被表达为诱导3 cmh抗药性所需的甲基胆碱的有效剂量(ED)。2O_s/mL(ED)3)9,22.

BALF炎症评估

类似于以前的方法描述21在AHR测定后，直接用含5%牛血清白蛋白(BSA、Sigma Aldrich、Zwijndrecht、Zwijndrecht)和蛋白酶抑制剂(完全迷你片；德国罗氏)的PBS 1mL灌洗。然后用1mL不加PBS进行四次灌洗.离心后(500×g第1 mL无细胞培养上清液保存于BALF中(DUPLO，−80°C)。用Z2Coulter颗粒计数和粒度分析仪(贝克曼库尔特，Werden，荷兰)将第一mL的细胞加入4 mL PBS灌洗液中进行计数。BALF和肺细胞用Diff-Quick(Merz&Dade，Dudingen，瑞士)染色，并以标准形态鉴定并分化为单个核细胞(M)、中性粒细胞(N)和嗜酸性粒细胞(E)。

T细胞应答分析：肺细胞再刺激

如前所述21取肺左叶，在37°C下切取肺左叶，用含1%牛血清白蛋白(BSA)、4 mg/mL胶原酶-A(罗氏诊断，荷兰)和0.1 mg/mL DNase-I的RPMI 1640(Lonza，Breda，荷兰)在37°C下消化1.5h。然后，通过70μm细胞过滤器(Falcon，Lelystad，荷兰)，将肺细胞悬于溶解缓冲液中，再用含1%BSA的10 mL RPMI 1640进行洗涤和悬浮。用贝克曼库尔特计数器Z2建立细胞总数。肺细胞(5×10)5在添加5%胎牛血清(FCS、Lonza、Breda、荷兰)、2 NM Ultra GlutaMAX(荷兰Bleiswijk生活技术)、100 EU青霉素和100μg/mL链霉素的96孔板(德国汉诺威格林生物一号)中培养细胞/井。所有样品一式三份，共刺激120 h(CO)。2孵化器37°C，上清液保存(−80°C)。ELISA测定IL-5，IL-10和IL-13的浓度，根据制造商的指示(BD制药公司，圣迭戈，CA)。ELISAs的最低检出限为IL-5为32 pg/mL，IL-10为10 mg/mL，IL-13为15 pg/mL。

GP特异性免疫球蛋白

类似的实验和材料描述可以在以前的实验中找到。21。简单地说，我们通过眼眶穿刺(前血清)和实验后通过下腔静脉(后血清，图5)收集了微小的血清管(Greiner Bio-one，Alphen a/d Rijn，荷兰)中的血液。1A和4a)。对Gp-spIgE，Nunc MaxiSorp平底96孔板(Sigma，MO)用1μg/mL抗鼠IgE(BD制药)涂于pBS(4°C)中，洗涤5次(洗涤缓冲液；pBS 0.05%吐温-20)，用3%脱脂奶粉(elk、坎皮纳、amersfoort、荷兰)在ELISA缓冲液中封闭，血清样品(稀释1：8，pBS 1%BSA)孵育2h。用1 0 0μL 1：1 0 0生物素标记的GP在PBS 1%BSA中孵育1.5 h，洗涤5次，用链霉亲和素-辣根过氧化物酶(1：2 0 0，R&D Sytems)孵育1h。再清洗平板，加入SigmaFastOPD底物(Sigma-Aldrich)，孵育8 min。当添加75μL=1.8mH时，反应停止。2所以4。在490 nm处测量光密度(OD)值，并采用经典Logit-log变换模型进行分析。

对GP-spIgG 1和GP-spIgG2a，用10μg/mL粗提物GP包被，3%BSA在ELISA缓冲液中封闭，与血清孵育(1：300，1：100)，用生物素化抗鼠IgG 1或-IgG2a(1μg/mL，BD制药)标记。根据标准曲线(用参考血清)计算浓度，结果以任意单位(AU)/mL表示。

采用EZ-link Sulfo-nhs-lc生物素对gp提取物进行生物素化反应，并根据生产厂家的操作规程(热科学)和滑动A裂解盒(3.5 K mwco，热科学)对gp提取物进行一夜透析纯化。23.

肺组织细胞因子水平

右上肺叶测定总蛋白含量和细胞因子谱。首先，肺称重、匀浆、溶于Luminex缓冲液(重量：体积比为1：5)，采用BCA蛋白法测定总蛋白含量。采用多功能小鼠细胞因子/趋化因子磁性珠板(MILLIPLEX MapKit；德国默克米利布莱)，测定IL 1、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-33、IFN-γ、Eotaxin(CCL 11)、GM-CSF、KC和MIL 3-α(CCL 20)的浓度。采用Luminex xMAP技术，采用MAGPX 1023 4002对板进行了分析。这些方法的部分描述也可以在Hesse等人以前发表的一篇文章中找到。21.

统计分析

所有数据均以均值±扫描电镜表示。曼-惠特尼U用测试方法对结果进行了分析，p < 0.05 was considered significant. Within the ELISA data, an AU-value which was more than three times the interquartile (IQ) range higher than the upper Q or more than three times the IQ range lower than the lower Q was considered to be an extreme outlier and was removed for further analysis. Within the AHR measurements, to compare the entire curve between groups, a generalized estimated equation (GEE) analysis was used, using SPSS Statistics 20.0.0.224.

大剂量VitD 3降低SpIgE并诱导中和能力

我们曾证明，每次注射10 ng VitD 3可增强gp-scit对气道炎症的抑制作用。11,23。在此，我们旨在确定在GP-SCIT中添加VitD 3的最佳剂量，以实现对致敏小鼠气道炎症和AHR的抑制。为此，我们在我们建立的gp-scit模型中测试了vtd 3(0，30,100,300 ng)的剂量范围。23(无花果)1a，b)。为了研究VitD 3是否改变了GP-SCIT诱导的免疫球蛋白，我们测定了SCIT前(白色，Pre1)，挑战前(灰色，Pre2)和挑战后(黑色，POST，图)血清中总IgE、GP-spIgE、GP-spIgG 1和GP-spIgG2a。1(c-f)GP-SCIT诱导各实验组总IgE和GP特异性IgE水平升高，spIgG 1和sp-IgG2a水平升高。在随后的挑战之后，所有GP-SCIT组的总反应和spIgE反应与假手术对照组相比都减弱了(图1)。1c，d)。虽然在GP-SCIT中添加VitD 3并不能提高spIgG2a的水平，但补充VitD 3在所有三种剂量下都会显著提高spIgG 1的水平(图一)。1e，f)。

为评估变应原中和能力，计算GP-spIgG 1/GP-spIgE和GP-spIgG2a/GP-spIgE比值。我们发现，与对照组相比，所有SCIT组小鼠的比率都显著增加(图1)。1g，h)。此外，与未补充的GP-SCIT组相比，添加300纳克的VitD 3使中和能力有增加的趋势。最后，无论VitD 3剂量，变应原挑战引起的GP-SpIgE水平(GP-SpIgE Post/Pre2)在所有GP-SCIT组均显著降低。1i)。

补充维生素D 3能抑制耳肿胀和AHR

我们在GP-SCIT后进行了耳肿胀试验(EST)，观察VitD 3对GP-SCIT早期过敏反应的影响。与对照组相比，高剂量VitD3-GP-SCIT确实诱导了明显的肿胀抑制作用，与不含VitD 3的GP-SCIT相比，显示出抑制的趋势(图一)。2a)。

补充GP-SCIT后的临床表现。(a在SCIT后2小时行GP注射后的净耳厚(Mm)。安慰剂-SCIT治疗小鼠作为对照组(NC和PC)。(b)甲胆碱的有效剂量(ED)，当抗性达到3 cmH时。2Os/mL(非参数Spearman‘s Rho p<0.05)。(c)气道阻力(R，CMH)2(O s/mL)及d)气道符合性(C/mL/cmh)2o)。(eIL-5、IL-10、IL-13(非参数Spearman‘s Rho p<0.0 5)和IFN-γ在再刺激后的肺单细胞悬液中的净水平(P<0.0 5)。绝对值表示为平均值±SEM(n=8)。数控阴性对照，PBS挑战；Pc阳性对照，GP挑战；PCDSCIT中含有VitD 3的PC(300 Ng)、0、30、100和300组均含有300 kSQGP，分别为0、30、100和300 ng VitD 3。*与PC或PCD比较，P<0.05，**P<0.01，*P<0.001：除非另有说明。

全尺寸图像

为了测试VitD 3是否也能增强gp-scit介导的对AHR的抑制作用，我们计算了诱导3 cmh抗药性所需的甲基胆碱剂量。2O_s/mL(ED3；图1)2b)。重要的是，我们观察到VitD 3对GP-SCIT后ED3有明显的剂量依赖性作用，提示VitD 3水平升高与变应原攻击后气道收缩较轻有关(Spearman‘s Rho=P < 0.05). Moreover, high-dose VitD3 resulted in a significant increase in ED3 when compared to GP-SCIT without VitD3.

在此，气道阻力的剂量-反应曲线显示所有GP-SCIT组抑制AHR与其匹配的对照组(图1)。2c)。在GP-SCIT中使用VitD 3，与对照GP-SCIT相比，有增强抑制作用的趋势。此外，与补充VitD 3的对照组相比，VitD3-GP-SCIT组的肺顺应性增加，与未补充的GP-SCIT组相比，肺顺应性有增加的趋势(图1)。2d)。

为了检测治疗对过敏原诱导的细胞因子的影响，我们用GP萃取物测定了肺细胞悬液中细胞因子的水平。2e)。在此，我们观察到VitD3-GP-SCIT小鼠体外GP刺激后能降低IL-5的生成.此外，我们观察到花粉再刺激肺细胞悬液后，VitD 3剂量依赖性地抑制IL-13水平(Spearman‘s Rho=P < 0.05), which resulted in a trend towards reduced IL-13 levels at the highest dose of VitD3 compared to GP-SCIT in the absence of VitD3. Restimulation of lung cell suspensions was unable to alter levels of IL-10 and IFN-γ (Fig. 2e)。

VitD 3对嗜酸细胞炎症的抑制作用

为了评估气道炎症的抑制作用，我们比较了肺嗜酸性粒细胞计数和细胞因子水平。3(a-e)如我们所料，GP-SCIT后BALF和肺组织中嗜酸性粒细胞的数量减少。3c，d)。在评估VitD 3对GP-SCIT介导的嗜酸性粒细胞抑制作用时，我们只观察到与GP-SCIT相比，VitD 3剂量最高时肺组织抑制增强的趋势。为了比较GP-SCIT中VitD 3对肺嗜酸性粒细胞数量的影响，我们计算了两组GP-SCIT组的嗜酸性粒细胞数与各自对照组的比较。在此，我们观察到大剂量补充VitD 3后，GP-SCIT对BALF和肺组织嗜酸性粒细胞数量的抑制作用增强(图1)。3d，e)。

VitD3-GP-SCIT后嗜酸细胞和细胞因子的反应。(a支气管肺泡液(BALF)和肺单细胞悬液(肺)中细胞总数。(b)BALF和(c)肺。M单个核细胞，E嗜酸性粒细胞N中性粒细胞。盒子和胡须情节(最小)。(d)BALF和肺嗜酸性粒细胞，均以抑制率(绝对EO/平均PC EO；均值±SEM)作图。e肺组织中IL-4、IL-5、IL-13、Eotaxin、GM-CSF、IL-1α、IL-33和KC水平(平均±扫描电镜，n=8)。数控阴性对照，PBS挑战；Pc阳性对照，GP挑战；PCDSCIT中含有VitD 3的PC(300 Ng)、0、30、100和300组均含有300 kSQGP，分别为0、30、100和300 ng VitD 3。*与PC或PCD比较，P<0.05，**P<0.01，*P<0.001：除非另有说明。

全尺寸图像

接着，我们分析了肺组织匀浆中细胞因子的水平，发现在缺乏VitD 3的情况下，GP-SCIT不能抑制肺组织中IL-4、IL-5和IL-13的水平。相反，VitD3-GP-SCIT能抑制IL-4、IL-5和IL-13水平，与假手术组和GP-SCIT组比较均有显着性差异(图一)。3f)。为了测试VitD3-GP-SCIT是否也影响对过敏原的先天反应，我们评估了肺结构细胞在GP挑战下释放的促炎趋化因子和alarmins的水平。有趣的是，与GP-SCIT相比，GP-SCIT中的VitD 3降低了Eotaxin(CCL 11)、GM-CSF、IL-33和KC的水平。虽然没有显着性，但在IL-1α水平上也发现了类似的结果.IL-10、MIP 3α(CCL 20)、IFN-γ、IL-17水平无明显影响。1).

Saint与VitD3-GP-SCIT复合物后免疫球蛋白的变化

其次，我们分析了在GP-SCIT配方中使用合成脂Saint作为脂溶性VitD 3载体是否能进一步提高GP-SCIT的疗效和VitD 3的佐剂作用(图1)。4a，b)。和以前的实验一样，我们观察到GP-SCIT后，GP-SpIgE和SpIgG 1和SpIgG2a明显增加(Pre2，图2)。4C-f)，而GP-SpIgE反应在所有SCIT组与其对照组相比在挑战后减弱(POST，图1)。4d)。然而，Saint-VitD3-GP-SCIT组(GP100DS和GP300DS)的spIgE水平与GP-SCIT组相比没有差异。

VitD 3补充GP-SCIT后免疫球蛋白反应的研究概况。(a)实验规程。(b)治疗组。(c)血清总IgE(ng/mL)在SCIT前(白条，Pre1)，SCIT后(灰色条，Pre2)和挑战后(黑棒，POST)。(d)gp-spIgE(任意单位(AU)/mL，Pre1-2，POST).(e)GP-spIgG 1(AU/mL，Pre1-2，POST).(f)GP-spIgG2a(AU/mL，Pre1-2，POST).(g)中和活性以血清中GP-spIgG 1/GP-spIgE比值作图。(h)GP-SpIgG2a/GP-SpIgE的中和活性。(i)攻击后(血清后/前2-血清)Gp-spIgE的双重诱导。(c–f)平均±SEM(n=8)。(g–i)盒子和胡须情节(最小)。数控阴性对照，PBS挑战；Pc阳性对照，GP挑战；个人电脑PC与300 nmol圣；PCDSCIT中含有300 ng VitD 3的PC；GPSCIT中300 kSQ GP；全球定位系统300 kSQ+300 nmol圣；GPD300 kSQ+300 ng VitD 3；GP100DS300 kSQ+100 ng VitD 3+300 nmol Saint；GP300DS300 kSQ+300 ng VitD 3+300 nmol Saint。*P<0.001.0 5，**P<0.0 1，*P<0.001.0 1，除非另有说明。

全尺寸图像

接下来，在GP-SCIT中添加VitD 3，与未补充的GP-SCIT相比，SPIgG 1和spIgG2a确实有增加的趋势(图1)。4e，f)。虽然所有GP-SCIT组的中和抗体水平都有明显的升高，但与VitD3-GP-SCIT相比，Sainas载体并没有导致较高的spIgG 1或spIgG2a水平。

作为测定GP-SCIT后中和能力的指标，计算了GP-SCIT后GP-spIgG 1/GP-spIgE和GP-spIgG2a/GP-spIgE的比值。在这些分析中未观察到VitD 3的作用，无论是否使用Saint作为载体，尽管在所有SCIT组GP挑战后，SpIgG 1的中和能力都有很强的诱导作用(图一)。4g，h)。此外，我们观察到所有GP-SCIT组因过敏原挑战而引起的GP-spIgE水平显着降低，而VitD 3补充GP-SCIT治疗组与单独使用GP-SCIT相比显著降低(图1)。4i)。

Saind混合VitD3-gp-scit对AHR或耳肿胀的抑制作用不明显。

接下来，我们评估了Saint与VitD3-GP-SCIT的混合作用是否改善了皮肤内GP注射的早期反应。与对照组相比，GP-SCIT组耳肿胀减轻，且与以前相似；在GP-SCIT中添加VitD 3，与GP-SCIT相比有抑制的趋势(图一)。5a)。在混合液中添加Saint并不能进一步改善VitD3-GP-SCIT动物的肿胀反应。

补充GP-SCIT后的临床表现。(a)SCIT术后2h行耳净厚度(Mm)测定。安慰剂-SCIT治疗小鼠作为对照组(NC和PC)。(b当气道阻力达到3cmH时，甲胆碱的有效剂量(ED)2O_s/mL。(c气道多动症(AHR)被绘制为阻力(在CMH中为R)。2(O s/mL)及d)遵从性(C在mL/CMH中)2o)。(e)再刺激肺细胞悬液中IL-5、IL-10、IL-13和IFN-γ的净水平.平均±扫描电镜(n=8)。数控阴性对照，PBS挑战；Pc积极对照，GP挑战；个人电脑PC与300 nmol圣；PCDSCIT中含有300 ng VitD 3的PC；GPSCIT中300 kSQ GP；全球定位系统300 kSQ+300 nmol圣；GPD300 kSQ+300 ng VitD 3；GP100DS300 kSQ+100 ng VitD 3+300 nmol Saint；GP300DS300 kSQ+300 ng VitD 3+300 nmol Saint。*P<0.001.0 5，**P<0.0 1，*P<0.001.0 1，除非另有说明。

全尺寸图像

为了检测saint和VitD3-gp-scit对AHR的抑制作用，我们测定了气道阻力(R)和顺应性(C)，并计算了ED。3值(R=3 CMH)2O_s/mL)(图1.5(b-d)除大剂量VitD3-GP-SCIT组外，所有实验组ED3值均显著高于对照组，但未发现补充VitD 3的净效应(图一)。5b)。此外，在分析气道阻力的剂量-反应曲线时，我们观察到与对照组相比，所有GP-SCIT组的剂量反应曲线均有明显下降，VitD3-GP-SCIT组与GP-SCIT小鼠相比，有抑制作用的趋势(图一)。5c)。尽管如此，圣徒的加入并没有导致对AHR的进一步压制。在肺顺应性方面，只有补充VitD 3的GP-SCIT与假治疗阳性对照(PCD)相比有明显改善，但未检测到使用Saint的效果(图一)。5d)。

用变应原提取物体外刺激肺细胞悬液以检测过敏原诱导的细胞因子，显示所有SCIT小鼠体内IL-5和IL-13的产生受到明显抑制(图1)。5e)。在GP-SCIT中添加VitD 3，与未补充的GP-SCIT小鼠相比，IL-5呈抑制趋势。此外，我们观察到在所有GP-SCIT治疗组中，这些过敏原回忆培养物中的IL-10水平升高，但由于各组间差异很大，这仅对未补充和VitD3-GP-SCIT组与其配对对照组相比具有显着性意义。添加VitD 3确实导致IL-10水平的上升趋势，与GP-SCIT治疗的动物相比(见图)。5e)。虽然Saint不能单独改善Th2的炎症状态，但补充VitD 3可增强体内外对Th2细胞因子的抑制作用。

圣徒对嗜酸性粒细胞炎症及细胞因子反应的抑制作用

为了评估VitD3-GP-SCIT中的Saint对炎症的影响，我们比较了GP-SCIT后嗜酸性粒细胞的细胞计数和肺组织中细胞因子的水平。6(a-c)我们观察到GP-SCIT后BAL液和肺组织中嗜酸性粒细胞数量明显减少，而不考虑使用VitD 3和Saint(图1)。6b，c)。然而，在这些惊人的结果中，我们无法检测到Saint介导的对GP-SCIT的影响，当数据显示为GP-SCIT治疗组的嗜酸性粒细胞相对于其匹配的对照组的倍减少时，这一点也很明显(图1)。6d，e)。

VitD3-GP-SCIT后嗜酸细胞和细胞因子的反应。(aBALF和肺组织细胞总数。(b)BALF和(c)肺。M单个核细胞，E嗜酸性粒细胞N中性粒细胞。(b, c)盒子和胡须情节(最小)。(d)BALF和(e)肺嗜酸性粒细胞，均以抑制率(绝对EO/平均PC EO；平均±SEM)作图。(f)BALF中IL-5、IL-10、IL-13水平，平均±SEM(n=8)。数控阴性对照，PBS挑战；Pc积极对照，GP挑战；个人电脑PC与300 nmol圣；PCDSCIT中含有300 ng VitD 3的PC；GPSCIT中300 kSQ GP；全球定位系统300 kSQ+300 nmol圣；GPD300 kSQ+300 ng VitD 3；GP100DS，300 kSQ+100 ng VitD 3+300 nmol Saint；GP300DS300 kSQ+300 ng VitD 3+300 nmol Saint。*P<0.001.0 5，**P<0.0 1，*P<0.001.0 1，除非另有说明。

全尺寸图像

最后，我们还分析了BAL液中的细胞因子水平，观察到IL-5和IL-13水平受到GP-SCIT的显著影响，但我们未能检测到VitD 3对SAN是否有额外的抑制作用(图1)。6f)。然而，我们能够显示在VitD3-GP-SCIT组中IL-10的显著增加，与匹配的阳性对照相比，无论是在Saint的存在下还是在缺乏Saint的情况下。