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桉树油通过下调IgE-FCεRI信号,减少过敏反应,抑制肥大细胞脱颗粒

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发表时间:2020-12-02 12:02作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

桉树油自古以来就因其杀菌、抗炎、镇痛和镇静作用而被广泛使用。近年来,桉树油的作用已被科学证实,有报道称桉树油抑制嗜碱性细胞、肺泡巨噬细胞和单核细胞中趋化因子、细胞因子和脂质介质的产生。根据这些信息,我们旨在验证桉树油是否可以用于过敏性皮炎,其发病率在人类皮肤病中一直呈上升趋势。用小鼠IgE介导的局部过敏模型证实了这一作用。总之,局部应用桉油可抑制IgE介导的皮肤过敏所致的水肿和血管通透性增强。此外,我们还验证了肥大细胞的脱颗粒作用,并考察了桉树油的主要成分1,8-桉叶是否直接或间接地抑制了γ和p38的磷酸化。1,8-肌醇可抑制肥大细胞脱颗粒.

导言

桉树油已被澳大利亚当地人用作治疗伤口和炎症的药物。1,2。从桉树叶中提取的精油据说具有抗炎、镇痛、镇静和杀菌作用,可用于药物和芳香疗法。3。在英国,从蓝桉用于治疗气道炎症和各种风湿病症状。在日本,通过水蒸气蒸馏法提取的挥发油。蓝桉或其他密切相关的植物(桃金娘科)被用来作为一种抗炎和镇痛。临床研究证实了桉树油对哮喘患者的抗炎作用,如减轻鼻窦炎症状、预防慢性阻塞性肺疾病恶化等。4,5,6,7。一篇关于嗜碱植物油的综合报道报道了桉树油对IgE介导的嗜碱性细胞活化的抑制作用。8。提示桉树油通过直接作用于巨噬细胞和单核细胞等免疫细胞来抑制炎症反应。9,得到了几项研究的支持。具体来说,桉树油可以抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞产生一氧化氮。10改善小鼠急性肺损伤模型肺的急性炎症反应11抑制慢性阻塞性肺疾病患者肺泡巨噬细胞的活性氧释放12。此外,桉树油的主要成分1,8-cineole还阻断了哮喘患者外周血单核细胞中花生四烯酸的代谢。13并抑制LPS诱导人单核细胞产生IL-1β。14。近年来,也有报道称桉树醇对小鼠具有抗炎作用,其作用机制是通过对trm 8通道的影响。15.

桉树油在福尔马林和角叉菜胶足肿胀试验中有镇痛作用,尽管局部使用。16,17。据报道,作为沐浴剂,特应性皮炎患者的皮肤症状得到改善。18.

因此,基于这些信息,我们旨在验证桉树油是否可以用于过敏性皮炎,其发病率在人类皮肤病中一直呈上升趋势。

在本研究中,我们首先评估了桉树油是否抑制了由肥大细胞活化引起的炎症性变应性疾病--IgE介导的局部过敏模型中的炎症反应。19,20,21。根据肥大细胞缺陷小鼠的研究结果,我们证实了桉树油对野生型小鼠的抗炎作用是由于抑制了肥大细胞的活化所致。由于桉树油抑制肥大细胞脱颗粒,利用体外细胞分析系统和骨髓源性肥大细胞(BMMCs)对其作用机制进行了研究,发现桉树油及其主要成分1,8-桉叶油抑制肥大细胞脱颗粒,减轻变应性皮炎,支持了其作为缓解过敏性皮炎的生药的潜力。

结果

桉树油抑制IgE介导的小鼠局部变应性炎症

为了确定桉树油是否能抑制肥大细胞脱颗粒,我们用被动皮肤过敏反应(PCA)测试了其在小鼠体内的作用。PCa是过敏原暴露后高通透性和血浆外渗引起的局部皮肤过敏反应,已被用作IgE介导的过敏反应的动物模型。22,23。我们通过评估伊文思蓝染料的渗漏,评价桉树油是否能抑制血管高通透性和局部耳水肿引起的IgE介导的过敏反应。1).

图1
figure1figure1

桉树油(Eu)抑制小鼠被动皮肤过敏反应(PCA)。(a)PCA和耳肿胀反应试验的治疗时间表和实验程序。(b在应用DNFB前24小时静脉注射抗DNP-IgE。在DNFB应用前1小时,将桉树油或车辆(3:1丙酮/橄榄油)涂在所有动物的耳内。DNFB应用于耳外,然后立即注射伊文思蓝染料。30分钟后,摘除耳朵,测量染料的吸光度。数据为平均±SEM(N=8/组)。差异的统计学意义用Dunnett检验(**)来评估。P < 0.01 versus vehicle-DNFB). (c)观察耳廓水肿的时间过程。用测厚仪测量耳厚。数据为平均±SEM(N=8/组)。(d应用DNFB后6h耳部组织中的苏木精和伊红染色。(e,f应用DNFB后1、6h甲苯胺蓝染色。(e组织切片为应用DNFB后6h从耳组织中提取的肥大细胞。肥大细胞在组织切片中通过其特征性颗粒状、深蓝色-紫色亚色差出现而被鉴定为蓝色正色背景组织。Nd没有脱颗粒,D去颗粒。(f左面板显示真皮/表皮(D/E)连接处皮肤肥大细胞的数量。右面显示脱颗粒肥大细胞的百分比。每条为12个视场的平均±SEM(N=6/群)。用Tukey-Kramer检验(**P<0.01对车辆)、##P<0.01(与车辆DNFB)比较差异有统计学意义(P<0.01)。

此外,在进行桉树油试验之前,用红豆酸钠对肥大细胞脱颗粒有抑制作用,并对其抑制作用进行了验证(附图)。2).

与DNFB相比,桉树油明显抑制了染料泄漏到组织中的数量。桉树油也以剂量依赖性的方式抑制染料泄漏(图一)。1b)。同时,DNFB诱导小鼠耳水肿,6h达高峰,桉树油以剂量依赖性的方式抑制这种水肿。1c)。

应用DNFB后6h对耳廓进行苏木精和伊红(H&E)染色。结果发现,应用DNFB后,皮肤组织肿胀,角质层增厚,炎症细胞浸润,这些结果被桉树油所抑制。1d)。

甲苯胺蓝染色证实桉树油对DNFB后肥大细胞脱颗粒有抑制作用。通过计数皮肤组织图像中的肥大细胞来量化脱颗粒肥大细胞的数量。24,25.

车内几乎没有肥大细胞脱颗粒的现象。载体DNFB在1h和6h分别脱颗粒50%和68%,6h后甲苯胺蓝染色证实肥大细胞数量减少。

在应用桉树油组中,DNFB作用1h后肥大细胞脱颗粒率明显降低,与DNFB施用后相比,DNFB对肥大细胞脱颗粒率有明显的抑制作用。应用DNFB后6h仍有明显的抑制作用,而DNFB作用1h后的抑制作用较DNFB后6h明显减弱(图一)。1e,f)。

这些结果表明,桉树油能抑制抗DNP-IgE抗体暴露所致的PCa。已知肥大细胞脱颗粒在静脉注射抗dnp IgE抗体及随后应用dnb所引起的反应后1 h的耳水肿早期有很强的参与,炎症细胞的迁移参与了耳廓水肿的早期。26,27。桉油对耳水肿的抑制作用在较早阶段就已观察到,3h后逐渐减弱,甲苯胺蓝染色抑制肥大细胞脱颗粒,说明桉树油对肥大细胞脱颗粒有一定的抑制作用。

然而,抗dnp-IgE抗体引起的炎症也涉及肥大细胞以外的炎症细胞,因此我们旨在阐明桉树油是如何影响肥大细胞缺乏的小鼠的。27,28.

桉树油对无肥大细胞小鼠的抑制作用

W/WV小鼠由于缺乏肥大细胞而缺乏肥大细胞,被广泛用于证实肥大细胞的生理作用。28,29,30。采用PCA反应测定耳廓厚度,分析桉树油对血管通透性增加的抑制作用。在野生型小鼠中,桉树油明显抑制染料渗漏到组织中,与载体的效果相比。在缺乏肥大细胞的W/WV小鼠中,无论是车辆还是桉树油,其组织染料渗漏量均明显低于野生型载体。此外,车辆和桉树油对染料的渗漏也没有差别(图1)。2a)。

图2
figure2

桉树油对肥大细胞缺乏小鼠被动皮肤过敏反应的抑制作用。(a)桉树油对野生型和W/WV小鼠伊文思蓝染料渗漏的影响。在DNFB应用前1小时,将桉树油或车辆(3:1丙酮/橄榄油)应用于野生型和W/WV小鼠的耳内,用抗DNP-IgE致敏。将DNFB应用于耳外,立即静脉注射伊文思蓝染料。30分钟后,摘除耳朵,测量染料的吸光度。数据为平均±SEM(N=8)。差异的统计学意义用Tukey-Kramer检验(**)来评估。P < 0.01, *P < 0.05 versus vehicle). (b)野生型和W/WV小鼠受桉树油抑制耳廓水肿的时间依赖性变化。用测厚仪测量耳厚。数据为平均±SEM(N=8)。(c应用DNFB后6h,桉树油处理野生型和W/WV小鼠耳组织的苏木精、伊红染色和甲苯胺蓝染色图像。

DNFB的应用引起野生型小鼠耳朵水肿,在车内6h达到高峰(见图)。2(B)这些效应被桉树油所抑制。用DNFB处理的W/WV小鼠的耳朵厚度随DNFB的增加而增加,在3h达到高峰,但在车辆处理的野生型小鼠中增加的幅度明显较小(见图)。2b)。

DNFB染毒后6h耳廓H&E染色和甲苯胺蓝染色显示,载体处理野生型小鼠皮肤组织肿胀,角质层增厚,炎症细胞浸润,这些作用被桉树油处理所抑制。2C,附图。3)。车辆处理W/WV小鼠的真皮组织肿胀、角质层增厚、炎症细胞浸润均较野生型小鼠少,但与桉树油处理的W/WV小鼠比较,差异无显着性(见图)。2c)。

应用DNFB后6h,甲苯胺蓝染色证实了车载野生型小鼠肥大细胞脱颗粒。桉树油处理的野生型小鼠肥大细胞较少。同时,无论是车辆或桉树油处理的W/WV小鼠均未发现肥大细胞。2c)。

可想而知,在肥大细胞缺乏的W/WV小鼠中,车辆和桉树油对PCA反应的抑制作用没有差异。然而,W/WV和野生型小鼠T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞没有差异。31,但由于缺乏皮肤色素细胞,贫血和红细胞计数较低。27。因此,今后需要进行详细的彻底检查。

摘要肥大细胞在IgE介导的过敏反应中起着重要作用,是减轻过敏症状的重要靶点。32。当肥大细胞暴露于抗原时,细胞质膜上的IgE结合高亲和力IgE受体(FCεRI)被交联,触发肥大细胞活化和脱颗粒。因此,采用BMMCs体外细胞实验研究了桉树油抑制肥大细胞脱颗粒的机制。

桉树油和1,8-cineole对BMMCs脱颗粒的抑制作用

研究了桉树油及其主要成分1,8-cineole对BMMC脱颗粒的影响.用桉油或1,8-cineole处理抗DNP-IgE抗体致敏的BMMCs,并以DNP-人血清白蛋白(HSA)作为抗原刺激。以细胞释放的β-己糖胺酶量作为酶活性指标,评价桉树油和1,8-桉叶油对肥大细胞脱颗粒的影响。β-六胺酶在肥大细胞脱颗粒过程中与组胺一起释放,释放的量通常被用作脱颗粒的指标。33,34.

首先,考察了不同浓度的桉油或1,8-桉叶油对BMMCs的存活作用.当浓度低于1g/mL时,桉油和1,8-桉叶油对细胞活力均无影响(图1)。3a)。以0.1、0.5或1g/mL浓度的桉树油或1,8-桉叶油处理BMMCs,可显著抑制β-己糖胺酶的释放。结果表明,桉油和1,8-cineole对肥大细胞脱颗粒有抑制作用。3b)。

图3
figure3

桉树油和1,8-cineole对IgE诱导的骨髓源性肥大细胞(BMMCs)脱颗粒的影响。(a桉树油和1,8-桉叶油对BMMCs活力的影响。用不同浓度的桉油或1,8-桉叶油处理细胞24h,用MTT法测定细胞活力。比较桉树油和1,8-肌醇处理的细胞与0.1%DMSO处理的细胞的相对活率。数据表示为平均±SEM(N=3)。(b用人血清白蛋白(HSA)刺激后立即将桉油或1,8-cineole应用于抗DNP-IgE敏化的BMMCs中,1h后比较0.1%DMSO和DNP-HSA处理的BMMCs中β-己糖胺酶的释放。数据表示为平均±SEM(N=4)。邓尼特检验用于评估统计学意义(**)P < 0.01versus vehicle-DNP-HSA).

桉树油和1,8-cineole抑制BMMCs产生炎性趋化因子、细胞因子和脂质介质

炎症局部激活的肥大细胞产生组胺、IL-4、IL-13等细胞因子和前列腺素、白三烯C4等脂质介质,从而促进过敏性炎症。32,35。采用BMMCs体外实验,研究了桉树油和1,8-桉叶油对组胺、IL-4、IL-13、前列腺素和白三烯C4产生的影响。当抗DNP-IgE刺激BMMCs时,上清液中检测到组胺、IL-4、IL-13、前列腺素和白三烯C4。4(a-e)在0.1、0.5或1mg/mL的浓度下,桉油或1,8-桉叶油对组胺的产生有明显的抑制作用。4IL-4和IL-13的产生也受到显著抑制(图1)。4b,c)。桉油和1,8-桉叶油在0.1g/mL时均不抑制前列腺素和白三烯C4的产生。浓度为0.5g/mL时,其产量受到抑制,但无显着性。在1μg/mL时,观察到明显的抑制作用(图1)。4d,e)。桉树油与1,8-桉叶油的抑制作用无显着性差异.在肥大细胞脱颗粒方面,桉树油的作用可归因于1,8-cineole.对前列腺素D2和白三烯C4的抑制作用弱于组胺、IL-4和IL-13。

图4
figure4

桉树油(Eu)和1,8-Cineole对骨髓源性肥大细胞(BMMCs)炎性趋化因子和细胞因子产生的影响。(a用桉油和1,8-cineole处理抗DNP-IgE致敏BMMCs后,测定组胺的释放.用ELISA法测定DNP-人血清白蛋白(HSA)刺激30 min后,上清液中组胺的释放。以0.1%DMSO和DNP-HSA刺激的细胞为对照,计算组胺的释放量。数据表示为平均±SEM(N=4)。邓尼特检验用于评估统计学意义(**)P < 0.01 versus vehicle-DNP-HSA). (b,c用桉油或1,8-桉叶油处理后,测定抗DNP-IgE敏化BMMCs产生IL-4和IL-13的情况.用DNP-HSA培养细胞3h后,用ELISA法测定IL-4和IL-13的产量,并与0.1%DMSO和DNP-HSA刺激的细胞进行比较。数据表示为平均±SEM(N=4)。邓尼特检验用于评估统计学意义(**)P < 0.01 versus vehicle-DNP-HSA). (d,e用桉油或1,8-cineole处理后,测定抗DNP-IgE敏化BMMCs产生前列腺素D2和白三烯C4的情况。用DNP-HSA培养细胞1h,计算前列腺素D2和白三烯C4的产量,并与0.1%DMSO和DNP-HSA刺激的细胞进行比较。数据表示为平均±SEM(N=4)。用Dunnett‘s试验评价车辆细胞与DNP-HSA细胞间差异的统计学意义(**P<0.01)。邓尼特检验用于评估统计学意义(*)P < 0.05, **P < 0.01 versus vehicle-DNP-HSA).

桉树油和1,8-肌醇抑制细胞内钙的增加2+BMMCs浓度

当IgE被抗原交联时,fcεRI聚集启动信号级联,导致胞内钙的增加。2+浓度是肥大细胞脱颗粒的主要信号途径之一。36。其次,我们研究了1,8-cineole对细胞内钙的影响。2+增加BMMC。

用dnp-hsa刺激钙后60s。2+测量。如图所示。5(A)DNP-HSA刺激后,荧光强度立即升高,而氟-4的荧光强度无明显变化。1,8-cineole处理的细胞经DNP-HSA刺激后,荧光强度明显降低.

图5
figure5

1,8-cineole抑制细胞内Ca升高2+集中注意力。用抗DNP IgE致敏的BMMC在含氟4-AM的培养基中孵育.以不同浓度的1,8-cineole处理BMMCs,并在启动荧光强度监测后,用DNP-HSA 60 s刺激BMMCs。(a)胞内钙的时间历程2 +BMMC的浓度数据显示为平均±SEM(N=5)。(b)DNP-HSA刺激后60s的相对荧光强度。数据显示为平均±SEM(N=5)。采用Dunnett‘s检验(**P<0.01)与Vehicle-DNP-HSA比较,有统计学意义(P<0.01)。

图形5B显示DNP-HSA刺激后60s的结果.与载体处理的DNP-HSA刺激细胞的荧光强度相比,1,8-肌醇浓度为0.1、0.5和1.0μg/mL时,细胞的荧光强度有明显的抑制作用,但无显着性差异,但呈浓度依赖性抑制。

结果发现,1,8-cineole抑制细胞内Ca~(2+)。2+DNP-HSA刺激后细胞增加。因此,我们接下来研究了1,8-cineole对除Ca外的bmc细胞内信号级联的影响。2+.

1,8-cineole不影响LYN和Syk磷酸化。

肥大细胞表面表达FcεRI,当rIgE被抗原交联时,与εRI相关的Src家族酪氨酸激酶LYN被磷酸化,随后发生一系列信号转导。然后,观察肥大细胞活化的迹象,如脱颗粒、细胞因子的产生和脂质介质的产生。29,32,37,38。因此,通过免疫印迹分析,观察了1,8-cineole对细胞内信号蛋白磷酸化状态的影响。

将抗DNP-IgE抗体致敏的BMMCs用0.5g/mL 1,8-cineole处理,以DNP-HSA为抗原,溶解免疫。结果表明,1,8-肌醇对Syk和LYN的磷酸化没有抑制作用,即使当浓度增加到2.0g/mL时也是如此(图1,8-cineole)。6a,b)。

图6
figure6

1,8-肌醇对Syk和Lyn磷酸化的影响。(a,b在DNP-人血清白蛋白刺激前24h,将桉树油或1,8-cineole作用于BMMCs,用抗DNP-IgE致敏,10 min后用SDS-PAGE分离细胞,免疫印迹法检测细胞的p-Syk、Syk、p-lyn和lyn的表达。左侧显示每种蛋白质有代表性的印迹,右侧条形图显示Syk和Lynk的磷酸化相对比率,计算磷酸化率相对于Syk和Lyn的表达(每组为1),数据作为4-6个独立实验的平均±SEM。邓尼特检验用于评估统计学意义(**)P < 0.01 versus DNP-HSA). The original blots are shown in the supplementary Fig. 5.

1,8-cineole抑制pcγ和p38磷酸化

1,8-肌醇不抑制LYN和Syk磷酸化.因此,我们研究了LYN和Syk下游的细胞内信号级联。用桉油或1,8-cineole处理抗DNP-IgE抗体致敏的BMMCs,以DNP-HSA为抗原,裂解免疫。结果表明,0.5μg/mL 1,8-肌醇可明显抑制PLCμ磷酸化。7(A),如p38磷酸化。7b)。0.5μg/mL 1,8-肌醇不能抑制磷脂酶A2(PLA 2)的磷酸化。7c)。结果表明,1,8-肌醇抑制了γ和p38的磷酸化.

图7
figure7

1,8-肌醇对γ、p38和磷脂酶A2(PLA 2)磷酸化的影响。(ac1,8-cineole作用于骨髓源性肥大细胞(BMMCs),用抗DNP-IgE致敏24h后,用DNP-人血清白蛋白(HSA)刺激细胞。10 min后,细胞溶解,进行SDS-PAGE。分离蛋白,免疫印迹法检测P-PLCγ、PLCγ、p-p38、p38、p-PLA 2和PLA 2的表达。左侧显示每种蛋白有代表性的印迹,右边的条形图显示了γ、p38和PLA 2磷酸化的相对比率。根据γ、p38和PLA 2的表达(每组为1)计算磷酸化率,并作为4-6个独立实验的平均±扫描电镜数据。邓尼特检验用于评估统计学意义(**)P < 0.01 versus DNP-HSA). The original blots are shown in the supplementary Figs. 6, 7.

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