桉树油抑制IgE介导的小鼠局部变应性炎症 为了确定桉树油是否能抑制肥大细胞脱颗粒，我们用被动皮肤过敏反应(PCA)测试了其在小鼠体内的作用。PCa是过敏原暴露后高通透性和血浆外渗引起的局部皮肤过敏反应，已被用作IgE介导的过敏反应的动物模型。 22 ,23 。我们通过评估伊文思蓝染料的渗漏，评价桉树油是否能抑制血管高通透性和局部耳水肿引起的IgE介导的过敏反应。 1 ).
图1 桉树油(Eu)抑制小鼠被动皮肤过敏反应(PCA)。( a )PCA和耳肿胀反应试验的治疗时间表和实验程序。( b 在应用DNFB前24小时静脉注射抗DNP-IgE。在DNFB应用前1小时，将桉树油或车辆(3：1丙酮/橄榄油)涂在所有动物的耳内。DNFB应用于耳外，然后立即注射伊文思蓝染料。30分钟后，摘除耳朵，测量染料的吸光度。数据为平均±SEM(N=8/组)。差异的统计学意义用Dunnett检验(**)来评估。 P < 0.01 versus vehicle-DNFB). (c )观察耳廓水肿的时间过程。用测厚仪测量耳厚。数据为平均±SEM(N=8/组)。( d 应用DNFB后6h耳部组织中的苏木精和伊红染色。( e ,f 应用DNFB后1、6h甲苯胺蓝染色。( e 组织切片为应用DNFB后6h从耳组织中提取的肥大细胞。肥大细胞在组织切片中通过其特征性颗粒状、深蓝色-紫色亚色差出现而被鉴定为蓝色正色背景组织。 Nd 没有脱颗粒， D 去颗粒。( f 左面板显示真皮/表皮(D/E)连接处皮肤肥大细胞的数量。右面显示脱颗粒肥大细胞的百分比。每条为12个视场的平均±SEM(N=6/群)。用Tukey-Kramer检验(**P<0.01对车辆)、##P<0.01(与车辆DNFB)比较差异有统计学意义(P<0.01)。
此外，在进行桉树油试验之前，用红豆酸钠对肥大细胞脱颗粒有抑制作用，并对其抑制作用进行了验证(附图)。 2 ).
与DNFB相比，桉树油明显抑制了染料泄漏到组织中的数量。桉树油也以剂量依赖性的方式抑制染料泄漏(图一)。 1 b)。同时，DNFB诱导小鼠耳水肿，6h达高峰，桉树油以剂量依赖性的方式抑制这种水肿。 1 c)。
应用DNFB后6h对耳廓进行苏木精和伊红(H&E)染色。结果发现，应用DNFB后，皮肤组织肿胀，角质层增厚，炎症细胞浸润，这些结果被桉树油所抑制。 1 d)。
甲苯胺蓝染色证实桉树油对DNFB后肥大细胞脱颗粒有抑制作用。通过计数皮肤组织图像中的肥大细胞来量化脱颗粒肥大细胞的数量。 24 ,25
车内几乎没有肥大细胞脱颗粒的现象。载体DNFB在1h和6h分别脱颗粒50%和68%，6h后甲苯胺蓝染色证实肥大细胞数量减少。
在应用桉树油组中，DNFB作用1h后肥大细胞脱颗粒率明显降低，与DNFB施用后相比，DNFB对肥大细胞脱颗粒率有明显的抑制作用。应用DNFB后6h仍有明显的抑制作用，而DNFB作用1h后的抑制作用较DNFB后6h明显减弱(图一)。 1 e，f)。
这些结果表明，桉树油能抑制抗DNP-IgE抗体暴露所致的PCa。已知肥大细胞脱颗粒在静脉注射抗dnp IgE抗体及随后应用dnb所引起的反应后1 h的耳水肿早期有很强的参与，炎症细胞的迁移参与了耳廓水肿的早期。 26 ,27 。桉油对耳水肿的抑制作用在较早阶段就已观察到，3h后逐渐减弱，甲苯胺蓝染色抑制肥大细胞脱颗粒，说明桉树油对肥大细胞脱颗粒有一定的抑制作用。
然而，抗dnp-IgE抗体引起的炎症也涉及肥大细胞以外的炎症细胞，因此我们旨在阐明桉树油是如何影响肥大细胞缺乏的小鼠的。 27 ,28
桉树油对无肥大细胞小鼠的抑制作用 W/WV小鼠由于缺乏肥大细胞而缺乏肥大细胞，被广泛用于证实肥大细胞的生理作用。 28 ,29 ,30 。采用PCA反应测定耳廓厚度，分析桉树油对血管通透性增加的抑制作用。在野生型小鼠中，桉树油明显抑制染料渗漏到组织中，与载体的效果相比。在缺乏肥大细胞的W/WV小鼠中，无论是车辆还是桉树油，其组织染料渗漏量均明显低于野生型载体。此外，车辆和桉树油对染料的渗漏也没有差别(图1)。 2 a)。
图2 桉树油对肥大细胞缺乏小鼠被动皮肤过敏反应的抑制作用。( a )桉树油对野生型和W/WV小鼠伊文思蓝染料渗漏的影响。在DNFB应用前1小时，将桉树油或车辆(3：1丙酮/橄榄油)应用于野生型和W/WV小鼠的耳内，用抗DNP-IgE致敏。将DNFB应用于耳外，立即静脉注射伊文思蓝染料。30分钟后，摘除耳朵，测量染料的吸光度。数据为平均±SEM(N=8)。差异的统计学意义用Tukey-Kramer检验(**)来评估。 P < 0.01, *P < 0.05 versus vehicle). (b )野生型和W/WV小鼠受桉树油抑制耳廓水肿的时间依赖性变化。用测厚仪测量耳厚。数据为平均±SEM(N=8)。( c 应用DNFB后6h，桉树油处理野生型和W/WV小鼠耳组织的苏木精、伊红染色和甲苯胺蓝染色图像。
DNFB的应用引起野生型小鼠耳朵水肿，在车内6h达到高峰(见图)。 2 (B)这些效应被桉树油所抑制。用DNFB处理的W/WV小鼠的耳朵厚度随DNFB的增加而增加，在3h达到高峰，但在车辆处理的野生型小鼠中增加的幅度明显较小(见图)。 2 b)。
DNFB染毒后6h耳廓H&E染色和甲苯胺蓝染色显示，载体处理野生型小鼠皮肤组织肿胀，角质层增厚，炎症细胞浸润，这些作用被桉树油处理所抑制。 2 C，附图。 3 )。车辆处理W/WV小鼠的真皮组织肿胀、角质层增厚、炎症细胞浸润均较野生型小鼠少，但与桉树油处理的W/WV小鼠比较，差异无显着性(见图)。 2 c)。
应用DNFB后6h，甲苯胺蓝染色证实了车载野生型小鼠肥大细胞脱颗粒。桉树油处理的野生型小鼠肥大细胞较少。同时，无论是车辆或桉树油处理的W/WV小鼠均未发现肥大细胞。 2 c)。
可想而知，在肥大细胞缺乏的W/WV小鼠中，车辆和桉树油对PCA反应的抑制作用没有差异。然而，W/WV和野生型小鼠T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞没有差异。 31 ，但由于缺乏皮肤色素细胞，贫血和红细胞计数较低。 27 。因此，今后需要进行详细的彻底检查。
摘要肥大细胞在IgE介导的过敏反应中起着重要作用，是减轻过敏症状的重要靶点。 32 。当肥大细胞暴露于抗原时，细胞质膜上的IgE结合高亲和力IgE受体(FCεRI)被交联，触发肥大细胞活化和脱颗粒。因此，采用BMMCs体外细胞实验研究了桉树油抑制肥大细胞脱颗粒的机制。
桉树油和1，8-cineole对BMMCs脱颗粒的抑制作用 研究了桉树油及其主要成分1，8-cineole对BMMC脱颗粒的影响.用桉油或1，8-cineole处理抗DNP-IgE抗体致敏的BMMCs，并以DNP-人血清白蛋白(HSA)作为抗原刺激。以细胞释放的β-己糖胺酶量作为酶活性指标，评价桉树油和1，8-桉叶油对肥大细胞脱颗粒的影响。β-六胺酶在肥大细胞脱颗粒过程中与组胺一起释放，释放的量通常被用作脱颗粒的指标。 33 ,34
首先，考察了不同浓度的桉油或1，8-桉叶油对BMMCs的存活作用.当浓度低于1g/mL时，桉油和1，8-桉叶油对细胞活力均无影响(图1)。 3 a)。以0.1、0.5或1g/mL浓度的桉树油或1，8-桉叶油处理BMMCs，可显著抑制β-己糖胺酶的释放。结果表明，桉油和1，8-cineole对肥大细胞脱颗粒有抑制作用。 3 b)。
图3 桉树油和1，8-cineole对IgE诱导的骨髓源性肥大细胞(BMMCs)脱颗粒的影响。( a 桉树油和1，8-桉叶油对BMMCs活力的影响。用不同浓度的桉油或1，8-桉叶油处理细胞24h，用MTT法测定细胞活力。比较桉树油和1，8-肌醇处理的细胞与0.1%DMSO处理的细胞的相对活率。数据表示为平均±SEM(N=3)。( b 用人血清白蛋白(HSA)刺激后立即将桉油或1，8-cineole应用于抗DNP-IgE敏化的BMMCs中，1h后比较0.1%DMSO和DNP-HSA处理的BMMCs中β-己糖胺酶的释放。数据表示为平均±SEM(N=4)。邓尼特检验用于评估统计学意义(**) P < 0.01versus vehicle-DNP-HSA).
桉树油和1，8-cineole抑制BMMCs产生炎性趋化因子、细胞因子和脂质介质 炎症局部激活的肥大细胞产生组胺、IL-4、IL-13等细胞因子和前列腺素、白三烯C4等脂质介质，从而促进过敏性炎症。 32 ,35 。采用BMMCs体外实验，研究了桉树油和1，8-桉叶油对组胺、IL-4、IL-13、前列腺素和白三烯C4产生的影响。当抗DNP-IgE刺激BMMCs时，上清液中检测到组胺、IL-4、IL-13、前列腺素和白三烯C4。 4 (a-e)在0.1、0.5或1mg/mL的浓度下，桉油或1，8-桉叶油对组胺的产生有明显的抑制作用。 4 IL-4和IL-13的产生也受到显著抑制(图1)。 4 b，c)。桉油和1，8-桉叶油在0.1g/mL时均不抑制前列腺素和白三烯C4的产生。浓度为0.5g/mL时，其产量受到抑制，但无显着性。在1μg/mL时，观察到明显的抑制作用(图1)。 4 d，e)。桉树油与1，8-桉叶油的抑制作用无显着性差异.在肥大细胞脱颗粒方面，桉树油的作用可归因于1，8-cineole.对前列腺素D2和白三烯C4的抑制作用弱于组胺、IL-4和IL-13。
图4 桉树油(Eu)和1，8-Cineole对骨髓源性肥大细胞(BMMCs)炎性趋化因子和细胞因子产生的影响。( a 用桉油和1，8-cineole处理抗DNP-IgE致敏BMMCs后，测定组胺的释放.用ELISA法测定DNP-人血清白蛋白(HSA)刺激30 min后，上清液中组胺的释放。以0.1%DMSO和DNP-HSA刺激的细胞为对照，计算组胺的释放量。数据表示为平均±SEM(N=4)。邓尼特检验用于评估统计学意义(**) P < 0.01 versus vehicle-DNP-HSA). (b ,c 用桉油或1，8-桉叶油处理后，测定抗DNP-IgE敏化BMMCs产生IL-4和IL-13的情况.用DNP-HSA培养细胞3h后，用ELISA法测定IL-4和IL-13的产量，并与0.1%DMSO和DNP-HSA刺激的细胞进行比较。数据表示为平均±SEM(N=4)。邓尼特检验用于评估统计学意义(**) P < 0.01 versus vehicle-DNP-HSA). (d ,e 用桉油或1，8-cineole处理后，测定抗DNP-IgE敏化BMMCs产生前列腺素D2和白三烯C4的情况。用DNP-HSA培养细胞1h，计算前列腺素D2和白三烯C4的产量，并与0.1%DMSO和DNP-HSA刺激的细胞进行比较。数据表示为平均±SEM(N=4)。用Dunnett‘s试验评价车辆细胞与DNP-HSA细胞间差异的统计学意义(**P<0.01)。邓尼特检验用于评估统计学意义(*) P < 0.05, **P < 0.01 versus vehicle-DNP-HSA).
桉树油和1，8-肌醇抑制细胞内钙的增加 2+ BMMCs浓度 当IgE被抗原交联时，fcεRI聚集启动信号级联，导致胞内钙的增加。 2+ 浓度是肥大细胞脱颗粒的主要信号途径之一。 36 。其次，我们研究了1，8-cineole对细胞内钙的影响。 2+ 增加BMMC。
用dnp-hsa刺激钙后60s。 2+ 测量。如图所示。 5 (A)DNP-HSA刺激后，荧光强度立即升高，而氟-4的荧光强度无明显变化。1，8-cineole处理的细胞经DNP-HSA刺激后，荧光强度明显降低.
图5 1，8-cineole抑制细胞内Ca升高 2+ 集中注意力。用抗DNP IgE致敏的BMMC在含氟4-AM的培养基中孵育.以不同浓度的1，8-cineole处理BMMCs，并在启动荧光强度监测后，用DNP-HSA 60 s刺激BMMCs。( a )胞内钙的时间历程 2 + BMMC的浓度数据显示为平均±SEM(N=5)。( b )DNP-HSA刺激后60s的相对荧光强度。数据显示为平均±SEM(N=5)。采用Dunnett‘s检验(**P<0.01)与Vehicle-DNP-HSA比较，有统计学意义(P<0.01)。
图形 5 B显示DNP-HSA刺激后60s的结果.与载体处理的DNP-HSA刺激细胞的荧光强度相比，1，8-肌醇浓度为0.1、0.5和1.0μg/mL时，细胞的荧光强度有明显的抑制作用，但无显着性差异，但呈浓度依赖性抑制。
结果发现，1，8-cineole抑制细胞内Ca~(2+)。 2+ DNP-HSA刺激后细胞增加。因此，我们接下来研究了1，8-cineole对除Ca外的bmc细胞内信号级联的影响。 2+ .
1，8-cineole不影响LYN和Syk磷酸化。 肥大细胞表面表达FcεRI，当rIgE被抗原交联时，与εRI相关的Src家族酪氨酸激酶LYN被磷酸化，随后发生一系列信号转导。然后，观察肥大细胞活化的迹象，如脱颗粒、细胞因子的产生和脂质介质的产生。 29 ,32 ,37 ,38 。因此，通过免疫印迹分析，观察了1，8-cineole对细胞内信号蛋白磷酸化状态的影响。
将抗DNP-IgE抗体致敏的BMMCs用0.5g/mL 1，8-cineole处理，以DNP-HSA为抗原，溶解免疫。结果表明，1，8-肌醇对Syk和LYN的磷酸化没有抑制作用，即使当浓度增加到2.0g/mL时也是如此(图1，8-cineole)。 6 a，b)。
图6 1，8-肌醇对Syk和Lyn磷酸化的影响。( a ,b 在DNP-人血清白蛋白刺激前24h，将桉树油或1，8-cineole作用于BMMCs，用抗DNP-IgE致敏，10 min后用SDS-PAGE分离细胞，免疫印迹法检测细胞的p-Syk、Syk、p-lyn和lyn的表达。左侧显示每种蛋白质有代表性的印迹，右侧条形图显示Syk和Lynk的磷酸化相对比率，计算磷酸化率相对于Syk和Lyn的表达(每组为1)，数据作为4-6个独立实验的平均±SEM。邓尼特检验用于评估统计学意义(**) P < 0.01 versus DNP-HSA). The original blots are shown in the supplementary Fig. 5 .
1，8-cineole抑制pcγ和p38磷酸化 1，8-肌醇不抑制LYN和Syk磷酸化.因此，我们研究了LYN和Syk下游的细胞内信号级联。用桉油或1，8-cineole处理抗DNP-IgE抗体致敏的BMMCs，以DNP-HSA为抗原，裂解免疫。结果表明，0.5μg/mL 1，8-肌醇可明显抑制PLCμ磷酸化。 7 (A)，如p38磷酸化。 7 b)。0.5μg/mL 1，8-肌醇不能抑制磷脂酶A2(PLA 2)的磷酸化。 7 c)。结果表明，1，8-肌醇抑制了γ和p38的磷酸化.
图7 1，8-肌醇对γ、p38和磷脂酶A2(PLA 2)磷酸化的影响。( a –c 1，8-cineole作用于骨髓源性肥大细胞(BMMCs)，用抗DNP-IgE致敏24h后，用DNP-人血清白蛋白(HSA)刺激细胞。10 min后，细胞溶解，进行SDS-PAGE。分离蛋白，免疫印迹法检测P-PLCγ、PLCγ、p-p38、p38、p-PLA 2和PLA 2的表达。左侧显示每种蛋白有代表性的印迹，右边的条形图显示了γ、p38和PLA 2磷酸化的相对比率。根据γ、p38和PLA 2的表达(每组为1)计算磷酸化率，并作为4-6个独立实验的平均±扫描电镜数据。邓尼特检验用于评估统计学意义(**) P < 0.01 versus DNP-HSA). The original blots are shown in the supplementary Figs. 6 , 7 .
