功能受损的类浆细胞树突状细胞和Ⅰ型干扰素的非造血来源是人类自身免疫的特征

自身免疫性结缔组织疾病是由无症状的临床前自身免疫逐步产生的。I型干扰素在自身免疫性疾病的进展中起着至关重要的作用。这些细胞因子在疾病发生过程中的细胞来源和调控尚不清楚，但浆细胞样树突状细胞被认为是导致I型干扰素过度产生的原因之一。在临床前自身免疫和建立系统性红斑狼疮时，浆细胞样树突状细胞不是效应细胞，失去了Toll样受体介导的细胞因子产生能力，不诱导T细胞活化，不依赖疾病活动和血液干扰素信号。此外，浆细胞样树突状细胞有一个转录标志，表明细胞应激和衰老伴随着端粒侵蚀的增加。在临床前自身免疫中，我们发现皮肤中的干扰素信号明显富集，而不是浸润免疫细胞，而是由角质形成细胞产生干扰素-κ。总之，非造血细胞来源，而不是类浆细胞树突状细胞，负责干扰素的产生之前，临床自身免疫。

系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性结缔组织疾病是一组异质性疾病。这些疾病的发病机制尚不完全清楚。最普遍的免疫异常是针对核抗原的自身抗体的存在。Ⅰ型干扰素(IFN)轴的失调也起着重要的作用。1,2。许多狼疮易感基因与IFN通路有关。3,4,5,6,7。然而，干扰素活性变化较大；60-80%的系统性红斑狼疮患者外周血中干扰素刺激基因(Isgs)表达增加。8,9,10,11.

自身免疫性结缔组织疾病现在被认为是从无症状的临床前自身免疫逐步出现的。自身抗体先于症状数年，比临床自身免疫性疾病更常见。12,13,14,15,16。因此，自身抗体阳性的个体构成了高危人群，其中少数人将发展临床自身免疫.从高危疾病发展到临床已建立的自身免疫性疾病的一个关键决定因素是干扰素的活性水平。12。在已建立的系统性红斑狼疮中，干扰素活性特别与皮肤受累有关。它还预测了未来的耀斑和严重程度。8,17,18,19。因此，在本研究中，我们询问在临床前和已建立的自身免疫性疾病阶段，IFN的产生是如何被控制和调节的。

大多数造血细胞和非造血细胞都能产生Ⅰ型干扰素(IFN-α，-β，-κ，-ω，-ε)，作为抵御病毒感染的第一道防线。然而，以往对IFN产生的研究主要集中在类浆细胞树突状细胞(PDC)上。来自其他健康个体的pDC在识别病毒抗原时会产生大量的Ⅰ型IFNs，这是通过TLR 7和TLR 9来识别病毒抗原的。20,21。TLR与这些配体结合后，会激活IRF 7和NF-κB通路，最终产生IFN-α和其他促炎细胞因子(TNF，IL-6)。22。除了这种分泌功能外，pDC还具有诱导免疫原性和耐受性T细胞应答的抗原呈递特性。23,24,25,26,27,28。相反，pDC的产生能力在黑色素瘤和卵巢癌中被证明是受损的；肿瘤浸润的pDC不产生α-α，但它们的存在实际上促进了肿瘤的生长。29,30,31。此外，乙型肝炎病毒通过阻断myd 88-irak 4信号通路和针对iRF 7的仙台病毒而干扰TLR 9通路，而淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒(Lcmv)则损害pDC分泌Ⅰ型干扰素的能力。32,33,34.

在自身免疫的背景下，内源性核酸与自身抗体形成免疫复合物被认为是一种刺激pdc激活的方法。35,36,37,38。因此，假设pDC是系统性红斑狼疮中干扰素-α的主要产生者是很自然的，但事实上，现有的文献是复杂和矛盾的。以前的研究报告了血中pdc的高和低数量。39,40。未分类的系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞在tLR 9刺激下产生较低水平的干扰素-α，而其他研究报告表明，pdcs增强tLR 7介导的干扰素-α的产生。41,42。目前尚不清楚PDC表型的改变是否是慢性炎症或治疗的结果，也不清楚其在人类自身免疫早期的作用机制。

为了解决这些矛盾，我们在这里评估PDC的表型、功能和转录水平，他们是治疗天真且没有组织炎症的高危个体，也是系统性红斑狼疮(SLE)和原发性Sj gren综合征(PSS)的患者。我们发现系统性红斑狼疮发病前PDC数、TLR介导的细胞因子生成和T细胞激活能力下降。这种损害与血液中的I型干扰素信号无关。相反，pDC有一个表达细胞应激和衰老的转录图谱。相比之下，我们发现皮肤中的非造血组织驻留细胞不是被动的靶点.相反，这些细胞在临床前和建立的自身免疫过程中都积极地促进了I型干扰素的异常产生。这些发现为人类自身免疫性疾病I型干扰素的来源和调控提供了独特的见解。

临床前自身免疫和系统性红斑狼疮患者的PDC数目减少

应用流式细胞术对新鲜分离的外周血单个核细胞(PBMCs)进行外周血pDC计数和免疫表型分析。我们分析了来自高危人群的样本(由ana+，≤1确定为系统性红斑狼疮的临床标准，症状持续时间<12个月和治疗朴素；n=64)，SLE患者(n=81)和PSS(n=21)以及年龄和性别匹配的健康对照者(n=37)。SLE患者的临床特点及治疗可从补充表中看出1。PDC门控为CD3。−CD 19−CD 14−CD 56−CD11c−赫拉博士+CD 123+CD 303+细胞(图1.1A)。与健康对照组相比，SLE和PSS患者PBMCs中pDC的平均百分比显著降低，这一发现也在治疗中观察到。1B)。所有分析样本外周血中pDC的百分比和绝对数是密切相关的(附图)。1A).

为了确定循环pDC的减少是否与血液ISG的表达和其他临床特征有关，我们用TaqMan在上述所有样本组中评估了PBMC中先前验证的IFN评分(IFN评分A)的表达。8。与健康对照者相比，SLE和PSS患者及高危个体的Ⅰ型干扰素活性(用IFN评分A评估)增加，但上述外周血pDC的降低与IFN积分A的高表达无关(图一)。1C-f)。虽然IFN评分A与可提取核抗原(ENA)抗体的数量增加有关，但在任何样本组中，pDC的百分比与IFN评分A或ENA抗体均无关联(补充图)。1B，c)。此外，SLE患者循环pDC的减少与疾病活动无关。1g)，用羟基氯喹治疗。氢)，其他免疫抑制剂。1I)，或强的松龙(图1.1J)。此外，危险个体、SLE患者和PSS患者循环pDC的减少与淋巴细胞总数无关，而后者在SLE患者中通常较低(补充图1)。1D-f).

来自健康对照者、高危个体和系统性红斑狼疮患者的pDC被分析多个分子的表面表达，这些分子对调节他们的免疫功能是很重要的(补充图)。2A-f)。SLE患者pDC在HLA-DR和BDCA-2(CD 303)表达上无显着性差异(P>0.05).另一方面，SLE患者的pDC中CD 123(IL-3R)和ILT 2(CD85j)较健康对照组升高(P<0.05)。P < 0.001). Interestingly, CD317 (BST2; tetherin), a molecule is known to be induced by type I IFNs also presented higher expression on pDCs of SLE patients (P < 0.05); however, its ligand ILT7 (CD85g) appeared to be downregulated on pDCs of SLE patients (P < 0.05).

TLR刺激的pDC在自身免疫过程中产生较少的细胞因子。

干扰素-α和其他促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子)的产生对TLR介导的刺激反应是正常PDC功能的标志。为了评价pDC产生细胞因子的能力，我们从高危人群中刺激了新分离的PBMC(n26)，系统性红斑狼疮患者(n=40)和PSS(n=7)与健康对照者(n14)用TLR 9(ODN 2216)或TLR 7(ORNR-2336)激动剂作用6h。我们测定了CD3产生的干扰素-α和肿瘤坏死因子。−CD 19−CD 14−CD 56−CD11c−赫拉博士+CD 123+CD 303+PDC采用细胞内染色法。在不受外界刺激的标本中，均未检测到pDC产生的干扰素-α和/或肿瘤坏死因子。健康对照组的pDC对TLR 9或TLR 7激动剂产生大量的IFN-α，而来自SLE患者的pDC则很少或根本不产生细胞因子(图1)。2A)。此外，pSS患者的pDC中TLR 9和TLR 7介导的IFN-α的产生与系统性红斑狼疮相似(见图)。2C，d)。虽然TLR 9介导的IFN-α在高危个体中同样减少，但他们的pDC似乎部分维持了部分TLR 7介导的IFN-α的产生。二维空间)。SLE和PSS患者pDC中TLR 9和TLR 7介导的TNF生成也明显低于健康对照组(图1)。2B虽然来自高危个体的pDC与IFN-α的产生趋势相同，但部分维持了一些TLR 7介导的肿瘤坏死因子的产生(如图所示)。2E，f).

其次，我们评估了pDC产生的干扰素-α与用干扰素评分A测定的I型干扰素活性之间是否有任何关联。我们发现，在系统性红斑狼疮和pSS患者以及高危个体中，TLR介导的IFN-α产生水平与IFN评分A之间没有相关性(补充图)。3A-d)。为了证实这些发现并不是由于TLR表达的差异，我们用流式细胞术检测了TLR 9和TLR 7的表达水平。来自高危人群和SLE患者的pDC表达水平与健康对照组相似(图1)。2G，h)。IFN-α的产生与TLR 9或TLR 7的细胞内表达无相关性。3E，f).

有趣的是，在培养PBMC的过程中，我们观察到单核细胞内的群体不表达HLA-DR，所有pDC都表达HLA-DR，而是CD 303(BDCA-2)的阳性表达，而CD 303(BDCA-2)以前被认为是PDC特异性的标记，用于免疫组织化学。这些细胞对TLR刺激没有反应，因为既没有检测到干扰素-α，也没有检测到肿瘤坏死因子的产生(补充图)。3G，h).

IL-3触发pDC不依赖TLR产生IL-6

已知IL-3在体外维持pdc的存活，并在tlr介导的刺激下促进干扰素-α的产生。43,44。我们证实，用IL-3扩增的IFN-α前处理24h后，TLR 9和TLR 7刺激的正常人pDC产生的pDC。n=6)。然而，在高危个体的pDC中，没有发现干扰素-α的产生有统计学上的显著提高(n=4)和SLE患者(n=7)(图1。3A，b)。此外，我们还发现了pDC的一种附加功能：IL-3在没有任何外源性TLR介导的刺激下，触发pDC自发产生IL-6。与上述系统性红斑狼疮患者和高危个体pDC中存在缺陷的tLR介导的干扰素α和肿瘤坏死因子产生不同的是，这种与tLR无关的IL-6在任何一组被测组的pDC中均未受到损害(图1)。3C，d).

PDC激活T细胞在自身免疫中的作用

虽然pDC具有抗原呈递特性，并能触发T细胞反应，但对于pDC在SLE中诱导T细胞增殖和活化的能力知之甚少。我们从活动性系统性红斑狼疮(SLE)患者、高危人群和健康对照者中，用细胞毒紫标记的同种异体CD4共培养新分离的pDC。+T细胞在低比抗CD3/CD 28微球存在下5天。4A)。虽然所有组的pDC都能诱导T细胞增殖，但SLE患者和高危个体的pDC诱导T细胞增殖的效率要低得多(图一)。4B)。PDC还可以触发FoxP 3的诱导+T细胞(T细胞活化的标志)。按照与上面相同的协议，我们发现CD 25减少了高Foxp 3+细胞来源于幼稚的CD4+与SLE患者和危险个体的pDC共培养5天后，T细胞与健康对照者进行比较(图1)。4C，d).

为了进一步证实来自高危人群和系统性红斑狼疮患者的pDC没有转换成抗原递呈表型，我们使用dq卵清蛋白测试了细胞对抗原的摄取。首先，从上述新分离的PBMC中纯化pDC，然后单独培养或与10μg/mL DQ卵清蛋白共同培养。18小时后，收集pDC，用流式细胞仪分析DQ卵清蛋白的平均荧光强度。与阴性对照相比，几乎所有健康对照组的pDC都能内化和加工DQ卵清蛋白。然而，来自危险个体和系统性红斑狼疮患者的pDC明显减少了抗原摄取，表明抗原处理和提呈功能受损(图一)。4E).

为了研究pDC激发T细胞产生细胞因子的能力，我们首先从活动期SLE患者、高危个体和同基因纯CD4的健康对照者中共培养pDC。+T细胞在低比抗CD3/CD 28微球存在5d后加入PMA/Ionomycin培养5h。与单纯T细胞相比，健康对照组的pDC分别提高了肿瘤坏死因子(34.07%比48.18%)、干扰素-γ(5.05%比6.01%)和IL-10(1.75%vs.3.42%)。4F-k)。然而，系统性红斑狼疮患者的pDC抑制了所有细胞因子的产生：肿瘤坏死因子(34.07%比27.95%)、干扰素-γ(5.05%比3.65%)和白细胞介素-10(1.75%比0.83%)。对来自高危人群的pDC也观察到了类似的结果。总之，系统性红斑狼疮患者和高危个体的pDC表现出触发T细胞增殖和激活的能力下降，同时它们也积极抑制T细胞产生细胞因子。

PDC在rna测序中的ISG表达

为了研究pDC中疾病相关的转录变化，我们从健康对照组中纯化了pDC。n=8)，处于危险中的个人(n=4)和SLE患者(n13)以CD 304(BDCA-4)的表达为基础，对细胞进行负性筛选，得到纯度>99%的细胞。我们用Smart-seq 2对从分类的pDC中提取的RNA进行了测序，以进行敏感的全长转录谱分析。

样本间变异的一个主要来源是ISG的表达。在RNA序列分析中，pDC根据ISG的表达而非临床诊断进行聚类。因此，为了控制这种变异性，我们首先根据一组核心ISGS(IFN评分)的表达特征对每个样本进行评分。用正常对照组(95%CI)pDC中IFN评分的表达水平，将每一份标本分配给IFN。低层或IFN高子群(图1.5A)。正如预期的那样，系统性红斑狼疮患者的pDC有一系列的IFN评分，但总体上显示出高于健康对照组和高危个体的pDC(图一)。5B)。与健康对照者相比，来自大多数高危人群的pDC的IFN评分更高，其中3人被分配到干扰素中。高亚组PDC RNA测序数据与用于分类的血IFN评分一致.共同ISG(MX1, XAF 1, IFI 44, RSAD 2)大多数pDC在IFN中被上调。高系统性红斑狼疮患者及高危人群低层SLE患者的表达水平与健康对照组相似(图一)。5C).

IFN亚组的pDC具有明显的转录谱。

干扰素分析低层SLE患者发现有543份转录本有显着性差异(FDR<5%)。5D)。这些特别丰富的IL-4和IL-13信号，IL-10信号，细胞迁移和病原体相互作用的途径等(补充图)。4A)。例如，在上调的基因中有与趋化因子相对应的基因，CXCL 3, CXCL 2，和CXCL 16(补充图。5A)。IFN在pDC中差异表达基因的详细表低层SLE患者可在补充表中找到2.

干扰素高在SLE患者中，我们发现674份转录本有显著差异(FDR<5%)。5D)。不出所料，这些基因被发现在干扰素反应途径中被大量富集(补充图)。4B)，但也有与DNA修复和MAPK信号有关的通路。已知有几种磷酸酶可以去磷酸化MAP激酶(DUSP 1, DUSP 2, DUSP 5，和DUSP 8)，与细胞分化相关的转录抑制子(HESX 1, ETV 3)，以及NF-κB抑制剂(NFKBIA, NFKBID)被发现在IFN中被上调。高SLE患者(附图)5B-d)。IFN在pDC中差异表达基因的详细表高SLE患者可在补充表中找到3.

在高危人群中，我们发现114份转录本与健康对照组相比有显着性差异(FDR<5%)。5D)。主要途径是调节天然免疫反应，对Ⅰ型干扰素和病毒的反应，以及对活性氧和过氧化氢的反应(补充图)。7A)。关于高危个体pDC中差异表达基因的详细表可在补充表中找到。5。在风险与干扰素之间低层SLE，有285份差异表达的转录本(补充图)。6A)。补充表中列出了这些表的顶部差异表示的详细表。6。风险与干扰素的比较高SLE，有356份差异表达的转录本(补充图)。7b)。因为有风险的pDC聚集在IFN中高亚组、IFN-反应通路也同样丰富。高危人群pDC和IFN差异表达基因的详细表高SLE患者可在补充表中找到7。与健康对照组相比，危险和系统性红斑狼疮pDC的常见丰富途径包括MAPK活性的调节、中性粒细胞的调节和趋化性(补充图1)。7b).

鉴于pDC是根据IFN状态而不是临床诊断而聚在一起的，我们分析了IFN中差异表达的转录本。高干扰素低层亚组(包括高危人群和系统性红斑狼疮患者)与健康对照者比较。我们还分析了这两个亚组共同参与的途径(图)。5E)。与IL-10信号、RAF无关的MAPK 1/3激活、MAPK通路负调控和趋化因子受体结合(补充图)有关的两个亚组共有这些通路。4C).

我们还评估了多个TLRs在所有样本pDC中的表达水平(补充图)。9)。正常对照组、高危人群和SLE患者的pDC均表达TLR 9和TLR 7，但不同组间TLR 9和TLR 7的表达无显着性差异，与TLR 9和TLR 7在蛋白水平的胞内表达相一致(图一)。2G，h)。PDC中TLR 1、TLR 6、TLR 10低表达，各组间差异无显着性(P>0.05)。TLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5和TLR 8均无表达。此外，在任何样本的pDC中均未检测到14种不同亚型IFN-α的转录本。其他Ⅰ型IFN转录本(IFN-β，IFN-kappa，IFN-omega)和Ⅲ型IFN转录本(IFN-lambda)在任何样本中均未表达(补充图)。10)。由于pDC向炎症组织迁移，我们检测了其趋化因子受体的表达。化疗因子及其受体的表达除在高危个体pDC中表达的差异外，无显着性差异(P>0.05)。低层干扰素高SLE患者(附图)11和12).

PDC在自身免疫过程中表现出免疫衰老和应激。

体外功能测定表明，SLE患者和高危个体pDC分泌和抗原递呈功能下降，与PBMC中IFN活性无关。为了研究哪些生物学途径导致这种缺陷表型，我们研究了这两种干扰素在pDC中差异表达的转录本。低层干扰素高SLE患者与健康对照者比较。IFN在pDC中差异表达基因之间的小重叠低层干扰素高系统性红斑狼疮患者被发现-有80个共有的转录本(图)。6A)。这些转录本的反应性途径富集表明，与MAPK家族信号、TLR信号、IL-10信号和趋化性相关的生物过程显著丰富(图一)。6B)。在80个共有的转录本中，有与细胞衰老和应激有关的上调基因(ATG 14, ATP 7A, DNAJB 1)，蛋白质在溶酶体中的降解(CTSL)、TLR信号负调控(IRAK 3)，MAPK信号的负调控(DUSP 1, DUSP 8)与非典型NF-κB通路的负调控(ZFP 91)，它们都能抑制I型IFNs和其他促炎细胞因子的产生(如图所示)。6C)。此外，共享的转录本包括上调的基因CXCL 2和CCL 19(补充图。5A)。对于处于危险状态的个体，大多数共享的转录本的表达与SLE pDC的表达趋势相同。与功能实验一致，当我们比较危险的pdc和IFN的转录谱时，我们没有发现80个共有转录本的转录谱有很大的差异。低层干扰素高SLE患者(附图)8)。两种干扰素在pDC中常见差异表达基因的详细表低层干扰素高SLE患者可在补充表中找到4.

由于转录数据提示了与细胞衰老相关的通路，我们进一步研究了这是否适用于SLE患者的pDC。端粒侵蚀的增加与细胞衰老有关，这一特征在系统性红斑狼疮患者的其他免疫细胞中已经发现，但以前没有在pDC中被描述过。45。我们与SLE患者一起从健康对照者中纯化pDC，然后与端粒PNA探针杂交，然后用流式细胞仪进行分析。计算pDC端粒信号与四倍体对照细胞(1301细胞)的相对端粒长度，并对G的DNA指数进行校正。0/1细胞(图1.6d)。分析证实，与年龄和性别匹配的健康对照者相比，SLE患者的pDC端粒长度更短(如图所示)。6E).

RNA测序数据还表明，与细胞应激相关的基因是80个共有的转录本之一。因此，我们下一步要研究氧化应激对TLR刺激的pDC产生Ⅰ型干扰素的影响。新鲜分离的健康献血者外周血单个核细胞暴露于高浓度的H。2O2(0~500μM)用ODN 2216刺激15 min。流式细胞术检测活细胞中IFN-α的产生.Annexin V和7-AAD细胞在高浓度H暴露后6h仍具有较高的存活率(>90%)。2O2(无花果)6f)。我们观察到氧化应激-即使在低浓度的H2O2-负调控的TLR介导的pDC反应导致其产生干扰素-α的能力逐渐丧失(如图所示)。6g).

在临床前自身免疫中，IFN活性在皮肤中富集。

由于专业的干扰素产生细胞(如pDC)在系统性红斑狼疮中功能受损，在患者中出现的异常Ⅰ型干扰素产生的来源尚未确定。我们比较了两种最常见器官表现中IFN评分A的表达水平与临床疾病活动的关系，将活动性疾病定义为BILAG-2004 A或B，非活动性疾病为BILAG-2004 C-E。我们发现IFN评分A与粘膜皮肤疾病活动有关(95%CI 1.16~4.34)，差异为2.24(95%CI 1.16~4.34)；P肌肉骨骼疾病(95%CI为0.44~2.09)，差异为0.017.97(95%CI=0.44~2.0 9)；P=0.927)。在图形表示方面，使用2对平均值和扫描电镜进行转换。−离散余弦变换因此，更高的表达被显示为一个更高的条形(如图所示)。7a，b).

接下来，我们比较了来自高危人群和SLE患者的配对血液和皮肤活检中IFN A评分的增加，并与健康对照组进行了比较(图1)。7C，d)。我们分析了114名系统性红斑狼疮患者、105名高危人群和49名健康对照者的血液样本.我们还分析了10例系统性红斑狼疮患者的皮肤活检，10名高危个体的非皮肤活检，以及6名健康对照者的皮肤活检。在高危人群中，与健康对照组相比，平均翻倍增加了2倍。−离散余弦变换血IFN评分A值为2.21(95%CI为1.37，3.53)，非皮损组为28.74(95%CI1.29,639.48)。与健康对照组相比，SLE患者血液和皮肤中ISG表达的差异增加更为严重；在一些SLE患者中，ISG在皮肤中的表达是健康对照组的5000倍以上。血液中的平均倍数为7.80(95%CI 4.75，12.80)，而皮肤中的平均倍数为479.33(95%CI 39.32,5842.78)。免疫组织化学方法进一步证实了干扰素诱导的GTP结合蛋白mxa蛋白表达的增加，进一步证实了ISGS表皮表达的增加。13)。系统性红斑狼疮患者非松弛性皮肤活检(n(3)mxa表达最高，其次为高危人群的非皮损性皮肤(n=3)与健康对照组皮肤活检比较(图3)。7E).

I型干扰素在自身免疫中的弥漫性表皮表达

鉴于与血液相比，皮肤中ISG的表达水平极高，我们进一步分析了健康对照者的皮肤活检结果(n=4)，SLE患者(n=6)，以及处于危险中的个人(n=4)。皮肤活检是从系统性红斑狼疮患者的活动性病变中获得的，而来自高危人群的皮肤活检则没有炎症的临床或组织病理学征象。我们用RNAScope技术进行原位杂交，观察I型IFN转录本的直接表达(IFNK, IFNa 2)在细胞水平上获得的所有皮肤活检。原位杂交阳性和阴性对照的典型图像可在附图中看到。14.

正如预期的那样，健康对照者在血液中IFN评分最低的皮肤活检中，两者均无表达。IFNK或IFNa 2(无花果)7F)。与此形成对照的是，高IFN评分的高危人群的表皮也表现为弥漫性表达。IFNK虽然不像SLE患者，但没有炎症的临床或组织病理学特征(图一)。7g)。IFN A评分高的SLE患者活动性皮损也有弥漫性表达。IFNK在表皮(如图所示)。7H)。关于IFNA2我们在真皮中检测到了表达，可能是由成纤维细胞作为IFNa 2信号位于致密结缔组织内。但是，值得注意的是，我们没有看到IFNK或IFNa 2白细胞浸润区(附图)。15).

为进一步评价pDC在皮肤活检中的存在情况，采用免疫荧光技术对健康对照者皮肤活检组织进行了bdca-4(CD 304)染色。n=3)，处于危险中的个人(n=3)和SLE患者(n=3)。虽然我们验证了pDC在从PBMCs分离的细胞中的阳性表达，但在我们分析的任何一例皮肤活检中均未检测到BDCA-4阳性细胞(补充图)。16).

这些结果表明，在包括临床前阶段在内的非皮损和皮损中观察到的高干扰素活性不是由浸润的造血免疫细胞介导的。相反，原位杂交表明，非造血细胞，如整个组织正常皮肤的角质形成细胞，在pDC不产生任何的情况下，对Ⅰ型干扰素的产生负责。

角质形成细胞在临床前自身免疫中表达Ⅰ型干扰素

为了检测角质形成细胞对已知的环境因素对皮肤炎症的反应，我们测定了一例临床不活跃SLE患者在体内紫外线激发前后皮肤中Ⅰ型干扰素转录本的表达。在紫外线激发前的一次活检中，发现低。IFNK在表皮中的表达。8A)。然后，我们在连续三天使用1.5×最小红斑剂量的太阳模拟器进行标准诊断性紫外线激发后，进行了第二次活检。在紫外激发后，我们观察到IFNK在表皮中采用原位杂交法(图1)。8B)，类似于在非危险个体皮肤上观察到的表达。

为了证实这一细胞来源的干扰素，我们研究了角质形成细胞在危险个体和系统性红斑狼疮患者体外产生干扰素的能力。我们从健康对照组的非松弛皮肤中分离出人角质形成细胞和真皮成纤维细胞。n=3)，处于危险中的个人(n=5)和系统性红斑狼疮患者(n=5)。从皮肤盘状红斑狼疮(CDLE)患者的皮损活检中分离出的角质形成细胞，ANA阴性，IFN评分A在血液中的最低表达，也作为疾病对照。n=3)。分别用TLR 3或Rig-I激动剂(1μg/mL)和Polyda：dt(100 ng/mL)分别培养和刺激细胞6和24 h后，分别表达3种Ⅰ型IFN(Ⅰ型IFN)(1：C)(1μg/mL)和10 0ng/mL(1 ng/mL)。IFNK，IFNa 2，和IFNB 1)以及III型干扰素(IFNL 1)用qRT-PCR法测定.

在基线时，没有外源刺激、IFNK表达于高危皮肤和SLE皮肤的角质形成细胞，而非健康对照者或CDLE。在Polyi：C或polyda：dt刺激后，IFNK通过危险因素和系统性红斑狼疮，角质形成细胞进一步增加(如图所示)。8C)。为IFNB 1，在任何样本中都没有在基线处表达。然而，在用PolyI：C刺激后，SLE和CDLE患者的角质形成细胞表达有增加的趋势，而角朊细胞的表达明显增加。IFNB 1SLE患者在多聚(da：dt)刺激后角质形成细胞中的表达也有增加，但在其他条件下无明显变化(图1)。8D)。相反，IFNL 1CDLE细胞仅在PolyI：C刺激后表达，而在其他条件下及Polyda：DT刺激后未见表达。8E)。最后，IFNa 2在任何标本或条件下均未见角质形成细胞表达。

这些供者(在所有四组患者中)的同一皮肤活检中匹配的真皮成纤维细胞均未显示出IFNK, IFNa 2, IFNL 1在基线或刺激后，保利(I：C)或保利(da：dt)。有趣的是，只有CDLE患者的真皮成纤维细胞在IFNB 1多聚(da：dt)刺激后，仅观察到危险个体和SLE患者细胞的表达趋势(补充图)。17).

Ⅰ型干扰素在系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性结缔组织疾病发病机制中的重要作用，根据基因和基因表达数据，以及干扰素阻断治疗的第三阶段临床试验，已被普遍接受。46。但IFNs是一个复杂的系统，具有多种配体和受体的重叠功能，所有的细胞类型都有可能产生和响应这些配体和受体。这种复杂性留下了许多尚未回答的问题，关于其细胞来源，失调机制，以及在疾病的发生和延续过程中所起的作用。在这项研究中，通过包括大量具有功能、转录和组织数据的高危人群，我们已经能够回答其中的一些问题。几条证据清楚地表明，即使在高危人群中，pDC也失去了其免疫原功能，与疾病的其他免疫或临床特征无关，而且在组织中也不活跃。然而，我们同时发现，在组织学上正常的皮肤角质形成细胞在没有浸润的白细胞的情况下产生Ⅰ型IFN，并且在此部位有明显的IFN反应。因此，我们的结果是在炎症发生前，在非造血组织中定位IFN的反应.

活动性系统性红斑狼疮(SLE)患者浆细胞、其他B细胞亚群和滤泡辅助T细胞增殖，升高趋化因子受体，并与疾病活动相关。47,48,49,50。相反，我们报告的循环PDC数量明显减少，甚至在临床前阶段。先前的文献推测，这可能表明pdc向发炎组织的迁移。51,52。这是基于免疫组织化学对CD 123或CD 303阳性细胞的观察。53。在假设pdc耗竭对系统性红斑狼疮有效的基础上，最近一期临床试验评估了bdca-2(CD 303)阳性细胞在系统性红斑狼疮中的缺失。54。然而，这些标记并不是特定于pDC，因为我们证明分化的单核细胞表达BDCA-2。此外，表面标记物并不表明这些CD 123或CD 303阳性细胞是否产生I型IFN。

如果系统性红斑狼疮(SLE)患者的pDC经历了一个活动期，即产生Ⅰ型IFNs，然后进入衰老期，那么在我们的数据中，我们可以看到这两种情况都由高、低产pDC的人群所代表，并根据IFN评分或疾病活动在这些比例上发生了变化。在我们研究的ANA阳性人群中，我们没有观察到这一点，即使在没有器官炎症，没有免疫抑制治疗，通常也没有进展到临床自身免疫的高危阶段。相反，我们发现系统性红斑狼疮和PSS患者及高危个体的PDC功能普遍受损，缺乏所有免疫原功能和与衰老相关的转录谱。这些pDC在趋化因子受体的表达上没有任何变化，表明它们的迁移特性，而我们在这些组的皮肤活检中没有发现BDCA-4阳性细胞。血pDC的数量和功能与IFN活性、疾病活动或治疗无关。

端粒缩短，如我们观察到的风险和系统性红斑狼疮pDC，可能表明复制衰老。然而，这不太可能解释我们的结果。PDC是一种终末分化的细胞类型。在正常情况下，当它们产生I型干扰素时，它们不会增殖。其他机制可能导致端粒缩短和生物老化，例如轻微的氧化应激，导致类似的表型。55,56,57。氧化应激是狼疮病理的一个重要特征，尤其是T细胞，导致一系列疾病相关的变化。58。值得注意的是，年龄诱导的细胞应激通过破坏iff 7和pi3k通路而影响人pdc产生α的能力。59,60,61.

最近的其他数据使人们对pDC对SLE患者Ⅰ型干扰素活动的贡献产生了怀疑。单基因干扰素刺伤的pDC中检测到了干扰素-α蛋白的肺泡浓度，而在系统性红斑狼疮标本中则未检测到这一现象。62。然而，对TLR激动剂的反应没有测试。62。在缺乏TREX 1的小鼠中，没有调节针刺介导的抗病毒反应，导致产生异常的Ⅰ型干扰素。这种干扰素反应已被证明是在非造血细胞中启动的，类似于我们在人类身上的发现。63。此外，对易发狼疮小鼠的实验研究报告，在疾病晚期，pdc产生干扰素α的能力逐渐丧失。64,65。重要的是，慢性病毒感染的小鼠模型维持着功能衰竭的pdc库，这与我们在人类慢性自身免疫中所描述的状态相似。66.

近来有关系统性硬化症的研究发现pDC中存在tLR 8的异常表达，导致了干扰素-α的产生，提示rna敏感的tLR参与纤维化的建立具有重要的病理作用。67。然而，在我们从高危人群或系统性红斑狼疮患者中提取的pDC的RNA测序数据中，我们无法证实TLR 8在任何样本中的阳性表达。

在pdc群体中，不同的子集被描述为不同的免疫功能。68。单细胞rna测序数据显示，人pdc对流感病毒的反应有三种表现型(P1，P2，p3-pdc)，具有不同的转录谱和功能。69。在本研究中，系统性红斑狼疮患者的pDC大多与P1-表型相似，反映了pDC的常规分泌功能和形态。这与我们发现系统性红斑狼疮pdc诱导CD4的能力下降是一致的。+CD 25高Foxp 3+T细胞，其数量和功能已知在活动期SLE患者中是受损的。70,71,72。此外，系统性红斑狼疮pdc差异表达基因是众所周知的参与细胞衰老和应激、tlr和MAPK通路负调控以及IL-10下游信号传导的基因，这些基因可能抑制pdc细胞因子的产生和存活。73,74,75。类似于我们在pDC上的发现，肾浸润的T细胞在小鼠狼疮最近已经显示出一个耗尽的转录特征和表型。76.

系统性红斑狼疮患者的皮肤疾病活动与全身ISG信号有关。77。在我们的工作中，我们通过分析配对血液和皮肤样本来扩展这一发现，以证明即使在没有临床炎症和高危个体的情况下，IFN评分在皮肤中也明显富集。因此，这意味着在全身疾病发生前，皮肤局部产生干扰素。

干扰素-κ主要由人角质形成细胞产生，其作用与干扰素-α/β相似。78。在SLE患者中，角质形成细胞通过细胞凋亡或坏死最终释放自身抗原参与了皮肤损伤的发病过程。79。先前的研究表明，皮肤红斑狼疮患者的角质形成细胞与健康对照组相比，产生了更多的IL-6，而I型IFNs则增强了这一过程。80。此外,IFNK据报道，红斑狼疮患者皮损皮肤中与光敏性有关的表达显著增加。81。通过观察Ⅰ型干扰素转录本在人体皮肤活检中的直接表达，我们证实并扩展了这些发现。漫射表达IFNK不仅可见于SLE患者皮损表皮，更重要的是未见ANA阳性者血液中IFN活性较高的皮肤表皮，无炎症的临床或组织学特征。紫外线诱导角质形成细胞产生干扰素-κ的作用在体外已经得到证实。81。在这里，我们证明了紫外线在体内诱导了更高的表达。IFNK系统性红斑狼疮非活动性疾病患者的表皮。值得注意的是，角质形成细胞的体外培养显示出较高的表达量。IFNK基线时，TLR 3和rig-i激动剂的刺激作用增强。IFNK表达，即使是在处于危险中的个体。此外，IFN(kappa、beta、lambda)的类型在系统性狼疮和盘状狼疮之间以及不同的细胞刺激之间存在差异。因此，这些结果表明，在pDC或组织白细胞缺乏产生的情况下，非造血细胞在启动自身免疫早期和以特定疾病的方式产生I型IFNs。

总之，虽然Ⅰ型干扰素在SLE中的重要性是不可否认的，但其正常生产调控失败的原因尚不清楚。我们的研究结果表明，皮肤等组织并不仅仅是白细胞介导的免疫过程的被动靶点，而是在产生IFN反应中起着积极的作用，而IFN反应在惰性pDC中占主导地位。非造血组织的免疫功能可能决定这些异质性疾病的临床表现。它们可能有助于解释组织炎症对常见的以白细胞为靶点的治疗方法的抵抗力，并将其指向常规免疫系统之外的治疗靶点。对这些组织的进一步研究可能会提供对自身免疫性疾病早期事件的深入了解，因此，这些组织如何成为疾病预防的靶点。