抑制CCL 2受体CCR 2增强肿瘤对免疫检查点治疗的反应

针对PD-1/PD-L1轴的免疫治疗是目前临床治疗多种肿瘤类型的主要方法，但许多肿瘤仍然没有反应。CCL 2在多种肿瘤类型中均有高表达，并与预后不良有关。因此，抑制或阻断CCL 2/CCR 2信号轴是肿瘤治疗的一个研究领域。在此，我们跨多个小鼠肿瘤和转移模型，CCR 2拮抗与抗PD-1联合治疗导致敏化和增强肿瘤反应的抗PD-1单药。我们发现治疗反应的增强与CD8的增强有关。+T细胞的募集和活化及其伴随的CD4减少+调节性T细胞。这些结果为进一步临床探索CCR 2与PD-1/PD-L1联合免疫治疗提供了强有力的临床基础，特别是考虑到小分子CCR 2抑制剂和抗体的有效性。

以免疫检查点为基础的治疗癌症的进展和批准导致了新一波可用的第二，最近，第一线疗法的传统化疗和放疗方案。程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)的定向治疗已被证明能使CD8恢复活力。+T细胞，将它们从筋疲力尽的状态中拯救出来，从而产生新的免疫反应，在许多情况下，肿瘤得到持久的清除。1。靶向pd-1既可作为一种单一疗法，也可与化疗、靶向药物或其他类型的免疫治疗相结合。2,3,4,5,6,7,8,9已经或正在进行3000多项临床试验10。虽然这些试验中的许多病人相对于护理标准已经改善了反应，但有相当一部分人将无法从这些治疗中获益。10。这导致人们把注意力集中在确定更有效的治疗组合上。11,12.

针对细胞因子和/或其同源受体的新的抗癌药物的开发，无论是用于单药治疗还是作为佐剂与其他治疗药物相结合，都是肿瘤治疗的重要研究领域。使用IL-2激活癌症患者的免疫系统是目前癌症免疫治疗的一个早期里程碑。以IL-2为基础的免疫治疗证明免疫系统可以消灭肿瘤细胞。13,14,15。虽然黑色素瘤和肾细胞癌患者在IL-2治疗后很少有完全缓解和长期无疾病存活的报道。16.

到目前为止，大多数已经或正在进行临床试验的新组合，都涉及免疫检查点疗法的经验组合，相互之间，以及在互补治疗类中的其他药物。11,12。识别成功组合的新方法是基于对患者无法对单一疗法作出反应的机制的理解。17,18，以及在实验模型中使用功能基因组筛选的研究。19,20。通过在体功能基因组学筛选，我们发现ddr 2受体酪氨酸激酶是影响免疫检查点阻断治疗效果的重要因素，与pd-1靶向抗体联合抑制导致肿瘤反应较单药增强。21。同样，Manguo等人。20在体内进行了功能缺失的基因筛选，发现PTPN2是增强免疫治疗的潜在靶点。在另一个屏幕上，Patel等人。19鉴定APLNR作为增强免疫治疗反应的关键基因，APLNR的缺失降低了T细胞免疫治疗的疗效。

我们筛选出的最有吸引力的候选基因之一是细胞因子CCL 2/mcp-1、单核细胞趋化因子和活化因子/单核细胞趋化蛋白-1。21。CCL 2是巨噬细胞趋化和活化的关键分子。22，与银屑病、类风湿性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化等多种疾病的发病机制有关。23,24,25。阻断CCL 2/CCR 2信号通路对OVA致过敏性哮喘小鼠的保护作用26。CCL 2是由肿瘤细胞和基质细胞共同产生的，它优先与CCR 2结合，CCR 2在血液、脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、卵巢、胰腺、脊髓、脾脏和胸腺等多种器官和组织中都有不同程度的表达。传统上预后较差的肺腺癌患者中发现高水平的CCL 2。27。乳腺癌患者肿瘤及系统性CCL 2表达增高与预后不良相关28,29。CCL 2在人肝癌中也有过表达，是肝癌患者的预后指标。30。CCL 2/CCR 2之间的相互作用已被证明可以招募免疫抑制细胞，如骨髓源性抑制细胞(MDSC)和促进转移的单核细胞。31,32。也有令人信服的证据表明CCL 2/CCR 2在治疗各种癌症中具有靶向作用。敲除或阻断CCL 2/CCR 2抑制原发性肝癌和转移生长，延长生存期30.

在这里，我们检查了我们的筛选结果的生物学意义。21提示CCL 2受体CCR 2的阻断，增强了Pd-1抑制肿瘤的疗效。我们证实，在多种癌症类型中，联合抗PD-1和CCR 2靶向治疗比单独使用任何一种药物都能提高疗效。探索其作用机制，这一发现揭示了与单一疗法相比，联合治疗的肿瘤在免疫细胞数量和细胞因子方面的明显差异。

CCL 2/CCR 2作为增强抗PD-1反应的候选细胞

我们最近报告了一项功能基因组研究，该研究评估了美国食品和药物管理局(Fda)批准的药物，其相应的靶基因在被抑制时可以增强对抗pd-1免疫治疗的反应。21。在本研究中21以N-丁基-N-(4-羟基丁基)亚硝胺(BBN)诱导的小鼠膀胱肿瘤细胞株为实验材料，经体外细胞培养，用于筛选。这些细胞被用于在体内的shrna筛选鉴定的基因，当被击倒时，显示由免疫激活的抗pd-1介导的肿瘤细胞死亡。21。为了确定这一点，我们对肿瘤标本进行了测序，对缺失和存在的shrna结构进行了定量分析，并与同型对照和抗pd-1治疗组进行了比较，目的是鉴定在抗pd-1治疗中优先丢失的基因。21。这项研究发现并证实了ddr 2激酶是一种很有前途的靶点，可以增强抗pd-1免疫治疗的反应。21.

除DDR 2外，其他几个基因，当被shRNA耗尽时，似乎增强了抗Pd-1免疫治疗的效果，因此也可能是可行的靶点。因此，我们开始了一个多步骤的过程，从这个屏幕上选择更多的目标来进行进一步的调查。

首先，我们寻找与DDR 2在人类肿瘤中的表达模式相一致的基因，因为这些基因可能是肿瘤可以用来逃避DDR 2缺失的信号通路的成员。使用两个人类膀胱癌数据集CNUH33和MSKCC34，我们在每个数据集中鉴定了18个基因，其表达模式与DDR 2的表达模式成组(图2)。1A)。有趣的是，在这两个数据集中，18个基因中有16个(80%)与DDR 2聚在一起(p < 0.001 by Fisher’s Exact Test) (Fig. 1B)，从这里开始，将被称为“DDR 2集群”。

为了进一步确定这一基因集的临床相关性，我们从DDR 2簇中的这16个基因中开发了一个表达评分，并发现与12个不同的膀胱癌患者组的侵袭性和晚期肌肉浸润性(MI)肿瘤相比，非侵袭性无肌侵袭性(NMI)患者的表达评分在统计学上有显着性差异(图1)。1C)。曲线下面积(AUC)<0.50在NMI肿瘤中表达较高，AUC>0.50在MI肿瘤中表达较高，AUC=0.5是偶然的。16基因DDR 2簇的高表达与更高级的MI疾病有关(图1)。1C)。相比之下，从DDR 2簇外的基因产生的分数在12个数据集中的10个数据中，AUC<0.5，表明这些基因与一般非致命性NMI疾病无关(图1)。1C).

因为单用pd-1治疗并不会影响肿瘤的生长。21我们推测，与IgG对照相比，PD-1治疗肿瘤中的16种基因均较高，而在携带shDDR 2和PD-1的应答者肿瘤中，任何基因均未改变或降低，可作为理想的额外治疗靶点。这种基因选择策略意味着这些基因的表达可能有助于抗PD-1治疗。为了确定这些基因是否存在，我们生长了对照和shRNA缺失的NA13肿瘤，用IgG或抗PD-1(补充图)对其进行治疗。1)并进行了rna-seq的描述。21。有趣的是，有三个基因通过了严格的选择标准：成纤维细胞激活蛋白α(FAP)、CCL 2和CXCR 4(表)。1)。有趣的是，CCR 2是CCL 2的主要受体。35，该配体还能与CXCR 4结合并激活CXCR 4。36。巨噬细胞通过CCL 2参与转移性膀胱癌的研究37以及免疫治疗的潜力38，这是令人感兴趣的。

为了在人类肿瘤中进一步评估这一点，我们使用bc-bet工具。39，并发现CCL 2在MI患者中的表达高于NMI肿瘤在所有12个数据集中的表达(图一)。1D)。在多个数据集中，CCL 2的高表达也与更糟糕的疾病特异性或整体存活率有关(如图所示)。1E)。有趣的是，ccl 2的表达与抗pd-1的耐药有关。21。综上所述，这些数据为研究CCL 2抑制与抗PD-1联合治疗在癌症模型中的疗效提供了强有力的理论依据。

CCL 2对抗PD-1致敏小鼠膀胱肿瘤生长的靶向作用

我们观察了靶向CCR 2联合PD-1在多种肿瘤模型中的疗效。肿瘤细胞系NA13、B16F10和E 0771在体外表达CCL 2和PD-L1(附图)。2)和PD-L1在体内(补充图。3)达到不同的水平。为了确定CCL 2活性降低与抗PD-1联合作用对肿瘤生长的影响，我们使用两种不同的shRNAs之一(补充图)来降低NA13细胞中CCL 2的表达。4A)。CCL 2基因敲除不影响NA13的体外生长(数据未显示)。将表达CCL 2 shRNA(ShCCL 2)的NA13细胞接种于小鼠体内，第14天给予IgG对照或抗PD-1治疗。肿瘤生长在接受抗PD-1的shCCL 2肿瘤中受到阻碍，而在接受IgG(补充图1)的shCCL 2肿瘤中则不然。4B)。为了确定这一方法的翻译潜力，我们使用CCL 2同源受体的小分子抑制剂rs 504393靶向CCR 2。40,41。RS504393是一种高选择性的CCR 2趋化因子受体拮抗剂，常用于预防CCL 2/CCR 2在体外和体内的相互作用。42,43,44,45,46,47,48。当RS 504393与抗PD-1免疫检查点阻断联合使用时，这种抑制NA13肿瘤生长的协同作用，在某些情况下导致肿瘤完全清除(图1)。2).

a同基因小鼠注射NA13细胞后皮下肿瘤的生长n=每组6只不依赖生物的小鼠)。代表两个独立实验的数据。经双向方差分析，统计学上有显着性差异。箭头表示进行抗PD-1治疗的日期。平均±SDb单个肿瘤体积随时间的变化而变化。每一行代表一个鼠标(n=每组10只或11只不依赖生物的小鼠)。c瀑布图显示NA13肿瘤体积在肿瘤注射后第30天与使用或不使用CCR 2拮抗剂RS 504393和/或抗PD-1治疗前相比有变化。从第14天开始，小鼠每日服用CCR 2拮抗剂RS 503393，每3天用抗PD-1药物治疗一次。

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CCR 2拮抗剂RS 504393与抗PD-1联合治疗小鼠黑色素瘤肺转移瘤疗效观察

为了评价CCR 2拮抗剂和抗PD-1联合治疗膀胱癌及转移性疾病的疗效，我们观察了该联合治疗B16F10黑色素瘤肺转移的疗效。已知b16f10被pd-1单药控制得很差。49,50,51。为了支持我们的假设，我们发现与对照组或单一治疗组相比，联合治疗能有效地减少肺转移瘤的数量(图1)。3A-c)。这些差异通过肺质量量化得到证实，对照组和单一治疗组的肿瘤重量负担较高(图一)。3B).

为了更好地理解肿瘤负担差异的潜在机制，我们使用流式细胞术观察了肺癌的微环境(附图)。5)。对四个治疗组的肺部分析表明，西格勒克-F值存在差异。+肺泡巨噬细胞(AM)在单核细胞(Mono)、间质巨噬细胞(IM)和树突状细胞(DC)中差异无统计学意义。3D，e)。与cd11b和cd11c联合使用的siglc-f是一种特殊的标记物，可用于小鼠非间质或炎性巨噬细胞不表达的住肺细胞。52,53。联合治疗组AMS的比率有统计学意义(见图)。3D，e)，它的肿瘤负担最低，与以前观察到的更高的AM含量与较低的肺肿瘤负担是一致的。54。西格尔-F+Ams优先定位于肿瘤结节外的健康肺泡间隙，并随着肿瘤负担的增加而逐渐减少。54。因此，他们在联合治疗组中的更大的存在为我们观察到该组较低的肿瘤负担提供了进一步的支持。

CCR 2拮抗作用还能增强抗pd-1治疗小鼠乳腺肿瘤的疗效。

自从CCR 2/CCL 2轴在乳腺癌中的促肿瘤作用已被广泛报道。28,29,32,47,55，我们试图利用E 0771细胞株在乳腺癌模型中进行联合治疗，该细胞系最初是从一只雌性C57BL/6小鼠的自发乳腺肿瘤中提取出来的。56。再一次，CCR 2拮抗剂和抗PD-1联合治疗在抑制肿瘤生长方面比单一治疗更有效。4A-C)。流式细胞术对肿瘤的分析显示T细胞衰竭标志物LAG 3和PD-1的表达水平存在差异(图1)。4D-f，补充图。6)。较高比例的pd-1+LAG 3−论CD8+用CCR 2拮抗剂和抗PD-1治疗小鼠肿瘤中的T细胞。4E)。相比之下，pd-1并无统计学差异。+LAG 3+，pd-1−LAG 3−，以及pd-1−LAG 3+未治疗对照和联合治疗之间的人群(图)。4F，补充图。7)。与对照组相比，CCR 2拮抗剂和/或抗PD-1治疗后LAG 3和PD-1的总表达水平降低(图1)。5A，b)。经pd-1治疗和联合治疗的肿瘤pd-1水平较低。+LAG 3+TIGIT+CD8+T细胞(附图)8A)，但仅根据TIGIT的表达没有差异(补充图)。8B)。此外，抑制FoxP 3的频率+CD4+与对照组相比，单一药物和联合治疗后调节性T细胞减少，但在联合治疗组中有统计学意义(图1)。5C)。CD8频率+T细胞在四个不同的治疗队列中存在差异，而对照组中CD8的频率最低。+T细胞(图1.5D)。联合治疗组具有较高的pd-1比值。+LAG 3−和干扰素γ+CD8+T细胞相对于Tregs(补充图)9)。3株肿瘤细胞系NA13、B16F10、E 0771均在不同程度上表达Ⅰ类MHC，提示其可作为CD8的直接靶点。+T细胞识别(附图)10A)。用表达卵清蛋白肽SIINFEKL的E 0771-OVA细胞检测CD8的表达情况。+T细胞反应是肿瘤特异性的。肿瘤浸润细胞用四聚体染色以鉴别CD8。+能识别肿瘤抗原的T细胞。四聚体的平均数量增加了+CD8+联合治疗组肿瘤中的T细胞，但无统计学意义。值得注意的是，五只小鼠中有三只表现出非常强烈的反应，联合治疗后抗原特异性T细胞增多(补充图)。10b)。对照组与联合治疗组单核细胞和巨噬细胞的频率无差异。(补充图。11).

通过细胞因子面板分析观察大量肿瘤，三种细胞因子在治疗组之间有统计学上的显著差异(图一)。5E，补充图。12)。联合治疗的小鼠肿瘤中IL-1Rα和sICAM-1水平较低，但IFN-γ水平较高。5E，补充图。12)。此外，干扰素γ的频率没有差异。+CD8+T细胞，每克肿瘤的原始细胞数显示出更多的干扰素γ。+CD8+联合治疗组在同等肿瘤重量的基础上进行比较时，T细胞(如图所示)。5F)。接下来，我们对tcga中的人膀胱癌rna序列数据进行了cbersort分析，以估计相对免疫细胞的数量。57(补充图。13)。在比较CCL 2肿瘤表达的上下四分位数的免疫群体差异时，发现CCL 2低表达肿瘤中存在较高的活化DC和自然杀伤细胞，它们都是干扰素γ的产生者(补充图)。13)。而CD8+T细胞在CCL 2高肿瘤中更高，用CiberSort分析不能解释这些T细胞的激活或衰竭状态(补充图)。13)。虽然在CCL 2低肿瘤组织中存在较高的Tregs，但实验数据与CiberSort分析结果之间的推论在结论上有一定的局限性。需要注意的一个关键的区别是，Cibersort正在研究内在的、基线CCL 2水平与基于治疗封锁的小鼠实验。这些人类数据将具有相当大的可变性/异质性，因为这些是从一种肿瘤类型MIBC的临床测序样本中推断出的免疫群体的估计值，MIBC已知具有大量的肿瘤间和内部异质性。

总之，我们观察到联合治疗的小鼠肿瘤细胞毒性T细胞的合成和活化明显增加，而抑制性调节性T细胞的数量也随之减少。我们认为T细胞数量的这一变化与观察到的肿瘤减少和联合治疗小鼠的转移负担有关。

CCL 2/CCR 2的抑制已在临床上作为一种可能的癌症治疗手段进行了探讨。虽然到目前为止，可用的数据仍然不多，但这种疗法并没有明显的益处。对非转移性胰腺癌患者的1b期试验表明，CCR 2抑制肿瘤浸润的巨噬细胞和调节性T细胞，同时增加效应T细胞。58。CCR 2特异性拮抗剂CCX 872与FOLFIRINOX(氟尿嘧啶[5-Fu]、亮氨酸、伊立替康、奥沙利铂)的联合治疗表明，与单药(29%比19%)相比，联合治疗无安全隐患。59。相比之下，人类IgG 1的第一阶段试验(NCT 00537368)k与ccl 2，carlumab(又称cnto 888)结合的单克隆抗体在接受常规治疗的晚期实体肿瘤患者中，在44例患者中没有任何一例表现出客观的抗肿瘤反应。60。一项第二阶段的研究(NTC 00992186)评估了卡鲁马对转移性前列腺癌患者的疗效。61。这些人类研究与我们在这里报道的结果是一致的，我们观察到CCL 2/CCR 2阻断对单一疗法的轻微或无反应。所有这些研究共同的一个重要发现是治疗的一般耐受性，很少有轻微到中度的不良反应。这使得CCL 2/CCR 2抑制与其他治疗方法(如免疫检查点阻断)相结合是理想的。

联合应用CCR 2拮抗剂与抗PD-1联合治疗对肿瘤的疗效改善(图1)。2)与CCL 2基因敲除(补充图)比较。4B)可归因于以下几个原因：CCR 2受体信号的降低是通过CCL 2的减少而实现的；其他类型的细胞(如CAFs)对CCL 2表达的阻断是已知的，它们分泌CCL 2并促进肿瘤中的巨噬细胞；最后，该抑制剂的非特异性效应会意外地影响抗PD-1反应。由于肿瘤固有的CCL 2可能不是CCL 2的唯一相关来源，在我们的研究中我们选择了CCL 2受体CCR 2。此外，CCR 2拮抗剂提供了更大的现实相关性，我们的研究结果可以更容易地应用于临床试验中使用CCR 2拮抗剂。BMS-741672，BMS-813160，PF-04634817是临床试验中已经或正在测试的三种CCR 2拮抗剂(ClinicalTrials.gov标识符：NCT 04123379，NCT 00699790，NCT 01712061，NCT 00699790)。事实上，根据我们的发现，针对CCL 2/CCR 2的治疗结合阻断PD-1在某些患者中可能产生协同反应。除分别阻断CCL 2/CCR 2和PD-1外，还开发了双特异性抗体。62对于抑制癌细胞中的这些分子来说，这将是一种新颖而优雅的解决方案。

在我们对肿瘤浸润免疫细胞的分析中，pd-1所占的比例较高。+LAG 3+CD8+对照组小鼠肿瘤中存在T细胞。与免疫检查点pd-1一样，LAG 3是一种抑制T细胞活化和细胞因子分泌的共抑制受体。63。LAG 3和PD-1通常被描述为耗尽T细胞的标志，两者的联合靶向能有效地激发强烈的T细胞反应，导致肿瘤清除。64。据报道LAG 3与pd-1协同作用，有可能增强pd-1的抑制作用。65。因此，这种新的联合治疗可能降低LAG 3的调节，可能改变免疫检查点阻断的反应。最近，CD8的祖细胞、过渡型和末期耗尽的亚群+T细胞是对慢性刺激的反应，对检查点阻断有不同的反应。66。在这项研究中，LAG 3在最终耗尽的子集中表达最多。Pd-1的出现+LAG 3−细胞与治疗效果相关，但这些细胞是否代表一种特定类型的效应细胞，是效应细胞的直接祖细胞，还是另一个过渡的细胞群，在未来需要对其转录体进行更广泛的分析。

虽然我们观察到在阻断CCL 2/ccr 2轴与抗pd-1或无抗pd-1联合作用后髓系室内几乎没有变化，但Siglc-F增加了。+Am人口被看到了(图中所示)。3D，e)。Siglc-f是一种特异性标记物，是一种非间质或炎性巨噬细胞不表达的小鼠肺源性巨噬细胞的标记物。67,68。摘要肺泡巨噬细胞在维持肺内动态平衡方面起着重要作用。69。AMs通过细胞表面受体和细胞因子与肺泡上皮细胞相互作用，清除明显的凋亡细胞、环境颗粒和病原体。70.

Siglecs属于跨膜凝集素家族，在免疫细胞上表达，与唾液酸结合。71。癌细胞表达高水平的唾液酸，可与免疫细胞上的siglecs相互作用。71。Siglecs既能促进肿瘤的生长，又能抑制抗肿瘤活性。72。其抗肿瘤作用与抑制促肿瘤炎症有关。72。例如，表达siglc-1(CD 169)的巨噬细胞被证明向细胞毒性T细胞表达肿瘤抗原，而siglc-1缺乏的巨噬细胞则会抑制抗肿瘤免疫。73。在皮下同基因小鼠模型上，研究了人Siglic-9与小鼠等效的Siglic-E的功能.一旦肿瘤形成，与野生型相比，西格勒克-E缺乏会导致更有侵略性的肿瘤生长。74.

在PoczoButt等人的一项研究中。75，鉴定了多个髓系细胞亚群：MACA细胞，标记为Ams(Siglc-F)。+/CD11c+)，MacB 1细胞(CD11b)+/CD 64罗氏/CD11c+)，MacB 2细胞(CD11b)+/CD 64INT/CD11c2)和MacB 3细胞(CD11b)+/CD 64嗨/CD11c+)。利用PRECOG的数据，他们报告说，MACA代表了一个居民AM群体，该群体富含预测良好临床结果的基因。75.

我们观察到更多的干扰素γ+CD8+联合治疗组T细胞。同时，我们还观察到干扰素γ水平的增加，这是通过一个多细胞因子小组来测量的。在临床环境中，高表达的干扰素γ或相关的信号与改善免疫检查点阻断的结果有关。76,77。转移性非小细胞肺癌(NSCLC)和尿路上皮癌患者，均接受了pd-L1抑制剂，随后显示出一种增强的干扰素γ基因信号(干扰素γ，CD 274，LAG 3，和CXCL 9)总有效率较高，中位无进展生存期较长，与pd-l1表达无关。76。此外，在接受抗pd-1治疗的黑色素瘤和非小细胞肺癌患者中，较高的干扰素γ蛋白表达与更长的无进展生存期有关。77。重要的是，从我们的研究中观察到更高比例的干扰素γ和干扰素γ表达细胞不仅表明小鼠肿瘤生长减少，而且更有可能被临床翻译为患者的预后。综上所述，这一发现，已知的CCR 2靶向治疗患者的耐受性，以及该组合在多个肿瘤模型中更为有效的证据，我们认为临床试验是非常合理的。

细胞株

从N-丁基-N-(4-羟基丁基)亚硝胺(BBN)致癌物诱导的C57BL/6雌性小鼠膀胱肿瘤中分离培养NA13细胞。21。E 0771是科罗拉多大学Traci Lyons博士的礼物。用5%胎牛血清(FBS)在RPMI中维持E 0771。B16F10是通过科罗拉多大学组织培养核心从美国类型培养集(ATCC)中获得的，在DMEM培养基中用10%的FBS进行维护。所有菌株均经鉴定和检测为无支原体。所有谱线都是在37°C的加湿大气中生长的(5%CO)。2).

qPCR

细胞匀浆采用QIAshredder(前胶原)，然后用带有gDNA清除器的RNeasePlus Mini试剂盒提取RNA。利用iScript逆转录超混合(Bio-Rad)技术合成cDNA.然后进行qPCR(Quant Studio 6 Flex实时PCR系统，应用生物系统，美国)，使用IQ SYBR Green SuperMix(Bio-Rad)78。采用以下引物对：小鼠CCL 2：正向5‘AGTAGCTGGAGCTACAA 3’；反向5‘GTCTGCTGCCCATTCCTTC 3’和小鼠PD-L1：前5‘TCTATCCTTTTTCCTCATT 3’反向5‘TCCATCTAGC ATTCTCACTTG 3’。用qrt-pcr法检测mrna表达的变化，用ΔΔ法检测mrna的表达。Ct方法采用。表达为内控型β-肌动蛋白。

免疫印迹分析

采用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(ROCHE)的RIPA缓冲液(Sigma，USA)从NA13、B16F10和E 0771细胞株中提取总蛋白进行westernblot分析。总蛋白定量后，用4-20%的最小蛋白分离出等量的蛋白质。®TGX™蛋白凝胶(BioRad)转移到PVDF膜上。用抗PD-L1(MAB 90781，R&D系统，美国)或抗β-actin(13E5，细胞信号传导，美国)单克隆抗体在1：1000稀释于5%脱脂乳阻塞缓冲液中进行检测。根据制造商的指示，使用iBright成像系统对水垢进行成像(美国热费舍尔科学公司)。

免疫组织化学分析

用兔抗小鼠抗体(D5V3B，CellSignalTechnology，USA)稀释1：100，对福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)NA13肿瘤的5m厚切片进行免疫组织化学染色。用10 mm枸橼酸盐缓冲液加热，按标准程序进行抗原提取。在PBS中，内源过氧化物酶(过氧化物酶阻断剂，DAKO)活性被中和，然后用山羊血清1：100阻断非特异性结合。组织切片与原抗体孵育。用抗兔HQ二次抗体和抗HQHRP连接抗体孵育玻片(美国文塔纳医疗系统)。最后，用DiscoveryChromoMapDAB试剂孵育玻片。切片用苏木精染色，乙醇脱水，固定。使用奥林巴斯DP 26数码相机，在×20放大的奥林巴斯BX 43光显微镜上拍摄了幻灯片。

重组干扰素γ(rIFNγ)预处理肿瘤细胞

研究小鼠肿瘤细胞对rIFNγ(R&D系统)的反应，在6孔组织培养板中用rIFNγ(50和250单位)孵育48h后，用APC抗小鼠H-2DB和APC小鼠IgG2a-K同工型对照抗体(Biolegend)进行流式细胞术(FACS)分析mHCⅠ类抗原的表达。

体内研究

雌性C57BL/6小鼠(CharlesRiver)在6周龄时，在恒温、恒湿的无菌微型隔离笼中驯化至少一周。老鼠可以免费获得食物和水。小鼠被安置在无病原体的特定条件下，并按照美国国立卫生研究院的指导原则进行护理，所有程序都由科罗拉多大学丹佛动物护理和使用委员会批准，并按照批准的协议执行。

NA13小鼠注射1×10。6100 L无菌PBS细胞在后侧皮下。E 0771乳腺肿瘤模型小鼠注射5×10。4第三胸廓脂肪垫中的细胞。在B16F10诱导的肺转移模型中，小鼠静脉注射2×10。5B16F10细胞在100 L无菌PBS中的表达。每周对小鼠进行两次检查。肿瘤测量从肿瘤第一次触诊开始。用电子卡尺测量肿瘤的长度和宽度，计算出：L × W2)/2，其中L是肿瘤最大直径的测量W是较短的垂直肿瘤测量。从每只荷瘤小鼠的不同样本中进行测量。动物被随机分为治疗组，确保组间肿瘤平均体积相似，并通过耳部穿孔来称重和鉴别。

小鼠抗PD-1抗体(IgG 1-D265A)和同型对照(IgG 1，克隆4F7)由布里斯托尔-迈尔斯·斯基布实验室(Redwood City，CA)制备，在PBS中配制，腹腔注射50μg/鼠(NA 13，E0771)或100μg/鼠(B16F10)，共3剂。CCR 2小分子抑制剂RS 504393，每日2mg/kg灌胃给B16F10小鼠，腹腔注射E 0771和NA13小鼠。

流式细胞术

B16F10小鼠在注射肿瘤细胞4周后被安乐死。提取肺组织，量化可见转移灶的数量，对肺进行处理和分析。79。E 0771肿瘤在没有巯基乙醇或L-谷氨酰胺的情况下在Click‘s培养基中机械分离。细胞在37℃下消化1h，用500单位/ml胶原酶Ⅱ型和Ⅳ型胶原酶和20μg/mlDNase(Worthington生化)。消化后的组织悬液通过100μm过滤器过滤。滤过的细胞被仔细地分层在一个离心管中，其中含有5ml的Lympholyte-M(CedarLane)。细胞在1500×离心条件下离心。g20 min后，仔细去除界面淋巴细胞层。染色前冲洗细胞。CD8 T细胞组：CD8 APC/Cy7(克隆53-6.7)(1：400)、CD3 FITC(克隆17A2)(1：300)、CD45BV510(克隆30-F11)(1：300)、CD 44 BV421(克隆IM7)(1：400)、PD-1 PE(克隆29F.1A12)(1：200)、LAG3PerCP-Cy5.5(克隆C9B7W)(1：100)和Tigit APC(Clone1G9)(1：100)。CD8T细胞在活细胞上有门控，CD3。+/CD8+双阳性细胞。然后根据Pd-1和延迟-3的表达对细胞进行进一步分类。巨噬细胞组：CD 45 BV 510、F4/80 APC/Cy7(1：100)、CD11b BV 421(M1/70)(1：600)、CD 64 PerCP-Cy5.5(克隆x54-5/7.1)(1：200)、MERTK FITC(克隆2B10C42)(1：100)、PD-L1 PE(克隆10F.9G2)(1：200)和Ly-6G APC/Cy7(克隆1A8)(1：100)。活细胞为CD 45+细胞。中性粒细胞通过Ly-6G的表达进行门控嗨/CD11b+，不包括在进一步的分析中。巨噬细胞门控为F4/80+/CD11b嗨人口和MERTK嗨/CD 64嗨人口。单核细胞被证实为F4/80。罗氏/CD11b+和MERTK罗氏/CD 64罗氏79,80,81,82。四聚体组为CD8 APC/Cy7、CD 35 BV 410、CD44BV421、LAG 3 PerCP Cy5.5、Pd-1 APC(克隆29F.1A12)(1：100)、CD4 FITC(克隆GK1.5)(1：200)和MHC-I-SIINFEKL四聚体PE(NIH)(1：200)。活CD8+细胞门控CD 44嗨/四聚体+。进一步分析Pd-1和延迟-3的表达情况.基于MERTK的IMS被识别嗨CD 64嗨CD11b嗨，并细分为三种肺IM亚型：IM1(CD11c)。罗氏CD 206+MHCII罗氏)，IM2(CD11c)罗氏CD 206+MHCII嗨)和IM3(CD11c)嗨CD 206罗氏MHCII嗨)。所有使用的流式细胞仪抗体都是从Biolegend购买的，除非另有说明。所有样本均用CyanADP流式细胞仪进行检测，并采用高峰软件(BD生物科学)采集，用Flowjo软件(TreeStar)进行分析。流式细胞仪的数据取自不同的样本，而不是相同的重复测量的样本。

细胞内细胞因子染色

从组织中分离细胞，在RPMI+2.5%FBS中，分别与12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波酯(PMA)(20 ng/ml)(Sigma，St.Louis，MO)加离子霉素(1μg/ml)(Sigma，St.Louis，MO)在37°C下作用4~6h，在RPMI+2.5%FBS中加入2μg/ml的brefeldin A(Adipogen，San Diego，CO)。细胞用CD8 APC/Cy7、CD45BV510、CD44BV421和CD4 PerCP-Cy5.5(克隆GK1.5)染色(1：400)。细胞在37℃下孵育30 min。培养后，洗净细胞，用1%多聚甲醛和4%蔗糖固定10 min。细胞经BD-PermWash(BD生物科学)渗透，细胞因子IFNγ、APC/Cy7(XMG 1.2)染色(1：200)。细胞在4℃黑暗中孵育一夜，然后用PERM洗涤，再悬浮于FACS缓冲液(0.5%牛血清白蛋白和0.1%叠氮钠)中。

FoxP 3染色：CD8 APC/Cy7、CD45BV510、CD4 perCP-Cy5.5、B 220 FITC(克隆RA3-6b2)(1：300)、CD 25 APC(克隆3C7)(1：200)和PD-1 BV 421(克隆29 F.1A12)(1：100)。37°C抗体孵育细胞30 min。用FoxP 3转录因子染色缓冲液组(eBioscience；00-5523)在4°C条件下固定和渗透30 min。细胞用FoxP3PE(MF-14)(1：200)染色，4°C在黑暗中过夜。+，然后是CD4。+/CD8−人口。活化CD4 T细胞作为CD 25的进一步分类+/FoxP 3−调节CD4 T细胞作为FoxP 3+.

肿瘤表达分析(RNAseq)

利用Novogene进行文库的制备和测序。21。测序在Illumina平台上进行，末端为150 bp，每个样本读取2000万条。

转录本量化用RSEM(v1.2.31)83默认参数和Bowtie 2(v2.1.0)作为读取对齐器84。利用Ensembl r91基因的注解，将READS直接映射到小鼠的转录本上，并在基因水平上进行总结，构建GRCm38.p5基因。按预期计数对基因进行量化。用VOM函数在角膜缘R包中进行差异表达85。去除平均期望计数<5的基因，计算归一化因子，用缺省参数的VOOM函数对各组间进行比较。

蛋白细胞因子阵列

分离肿瘤，液氮冷冻闪光。组织匀浆在含有完全迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒(MilliporeSigma)的PBS中。均匀化后，加入TritonX-100，终浓度为1%，然后在-80°C下冷冻过夜。样品在冰上解冻，离心10,000×g培养5 min，取上清液。采用BCA蛋白测定法测定溶出蛋白浓度(Pierce，Thermo Science)。纯化的蛋白质裂解物按照制造商的指示(研发系统，ARY 006目录)应用于蛋白质组剖面仪、小鼠细胞因子阵列试剂盒、A板。用BioradChemidocMP成像系统测定化学发光反应。

基因表达分析

膀胱癌生物标志物评价工具的初步分析(BC-BET)39评价CCL 2表达与膀胱癌特征的关系。12个病人组(n=1257)BC-BET然后下载39。简单地说，处理过的数据是从基因表达式Omnibus下载的。86(8月1日队列：加入#GSE 3167)87；AUH-2：GSE 547988；CNUH，GSE 1350733；DFCI：GSE 3168489林德格伦：GSE 1991590林德格伦-2：GSE 3254891；MDA-1：GSE 48276和MDA-2：GSE 4807592；UVA：GSE 3731793，来自阵列快车94，(Stransky-1和Stransky-2：e-TABM-147)95或者作为Blaveri的补充材料96和MSKCC34。从微阵列平台注释中鉴定出靶基因探针。当一个基因的多个探针可用时，使用平均表达量最高的探针。97。基于样本间的欧氏距离，采用完全连锁的层次聚类方法。将16个探针的表达归一化为平均值为0，标准差为1，求得DDR 2聚类评分，然后求出每个样本的所有标记探针的平均值。