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SARS-CoV-2感染非人类灵长类动物急性、溶解或进行性新冠肺炎的细胞事件

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发表时间:2020-11-30 09:32作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

了解SARS-CoV-2相关免疫病理对研制泛效疫苗和治疗至关重要.在此,我们研究了非人灵长类动物(NHP)在非典-CoV-2感染后4周内的免疫事件。我们展示了表达CD 16的单核细胞在急性发作期向肺部的强劲迁移,并描述了两组间质巨噬细胞(hda-dr)。+CD 206):过渡性CD11c+CD 16+细胞数量与血浆中IL-6水平和长期持续的CD11b直接相关。+CD 16+细胞群。单核细胞的转运是由TARC(CCL 17)介导的,与支气管刷中的病毒载量有关。我们还描述了疾病的结果与肺部大量细胞浸润(包括CD11b)之间的关系。+CD 16巨噬细胞和CD11b+中性粒细胞。巨噬细胞的积累是长期的,甚至在有轻微或没有疾病迹象的动物身上也是可以检测到的。有趣的是,具有抗炎反应的动物,包括高IL-10:IL-6和kynurenine/色氨酸比值的动物,表现出较轻的疾病。我们的结果揭示了新冠肺炎的细胞机制,并提示NHP可能是测试免疫治疗的合适模型。

导言

新冠肺炎大流行是一场重大的公共卫生危机,引发了全球性的医疗突发事件。

目前尚无完全治疗或预防新冠肺炎的有效疫苗或药物,目前尚不清楚该疾病的发病机制。新冠肺炎的结果变化很大,出现症状的患者表现出范围广泛的疾病,从轻度(发烧、咳嗽、呼吸急促)到严重(呼吸困难、肺炎、快速进展的放射学改变)。1。目前,据估计,高达15%的新冠肺炎患者发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。2是SARS-CoV-2例死亡的主要原因.阐明sars-cov-2感染的分子和免疫学细节的研究正在进行中,许多已报道的临床观察表明,这种疾病至少部分是由于宿主过度反应的结果,目的是清除病毒,而不是促进疾病的发展。3。这一假说得到了对密切相关的冠状病毒sars-cov-1的研究的支持。4,5,6,根据临床报告,sars-cov-2感染患者体内的促炎细胞因子IL-6水平升高,髓系细胞室严重失调,特别是在有严重症状的患者中。3,7,8,9.

有趣的是,IL-6的增加与负责骨髓生成和单核细胞向肺内吸收的趋化因子的上调相一致。3,10提示外周炎性单核细胞和组织巨噬细胞可能在新冠肺炎重症患者的细胞因子风暴中起作用。11。老年人潜在的炎症状态和骨髓增生可能是造成这一群体高死亡率的原因之一。12。更好地了解新冠肺炎的免疫病理,将有助于发展有针对性的免疫治疗和有效的疫苗。

非人类灵长类动物(Nhp)已被用作研究急性呼吸系统疾病(如sars和mers)的动物模型。13。在这些研究中,非洲绿猴(AGM)比恒河猴(Rm)更容易患上严重的疾病。14。不管物种的差异,并且考虑到nhp和人类免疫系统之间的重叠,这两种nhp都是研究宿主对冠状病毒的反应的有用模型。5。我们和其他人已经证明,agm和rm都可以通过鼻内和气管内途径或通过气溶胶成功地感染sars-cov-2。15,16,17,18。暴露后,agm和rm在呼吸道中的病毒复制率高达2周,这两种病毒都有新冠肺炎的肺病理特征,从轻微到严重不等。19。其他小组描述了sars-cov-2感染的恒河猴早期的免疫事件,包括单核细胞的扰动,肺巨噬细胞的增加,以及血液中的细胞活化,这些都发生在感染后几天。16.

在此,我们通过描述感染后4只非洲绿猴(AGM)和4只恒河猴(RM)的血液和肺内免疫事件的动力学,从感染后的急性期到感染后4周。总的来说,我们观察到从血液到肺的先天细胞和适应性细胞的多相动员,这对两个物种来说都是非常常见的。急性炎症期的特点是单核细胞的频率增加,与支气管病毒复制呈正相关。CD11b+巨噬细胞和中性粒细胞在所有受感染动物的肺部被检测到,但是在严重疾病中的数量更多。与肺部炎症的分解相一致20第二阶段的特征是两种植物均向2型反应转变。我们鉴定了两群间质巨噬细胞(HLA-DR)。+CD 206)在BAL中;(1)CD11c+CD 16在感染急性期,与血浆中IL-6水平有关的人群增加;(2)长期存在的CD11b。+和CD 16在AGM和RM的肺中聚集的人群,特别是在那些疾病严重程度增加的人群中。临床症状较明显的动物血浆中IL-10:IL-6和kynurenine/色氨酸比值(抗炎:促炎)细胞因子(抗炎:促炎)细胞因子水平低于无症状或轻度征象的动物。21。通过研究免疫细胞的时空变化,我们的研究将NHP患者和人类患者的研究结果联系在一起,并揭示新冠肺炎的细胞事件。22,23。此外,我们还发现NHP是研究新冠肺炎免疫病理的高度相关的模型,可能是检验SARS-CoV-2免疫治疗和疫苗的合适模型。

结果

感染后单核细胞和趋化因子水平的增加与病毒载量和疾病严重程度有关。

4名成人rm和4名成人aGM暴露于sars-cov-2,包括口腔、鼻内、气管内和结膜(多途径)暴露(补充表)。1)。这项研究在暴露后4周结束(如图所示)。1A)18。到第一周,所有8只动物的鼻咽拭子和支气管刷上的RT-PCR都能检测到病毒载量(图1)。1B和补充表2)。在咽、鼻、颊、直肠和阴道拭子中也检测到病毒RNA。病毒载量(VL)在不同接触途径之间或两种动物在第一周时均无差异(补充表)。2还有无花果。1B)。值得注意的是,在第2周,AGM在支气管刷中的VL高于RM,而在第3周,RM中的VL大部分无法被检测到,而在AGM中直到研究完成为止,它仍然保持在检测水平之上(图1)。1B和补充表2)。与人类相似,不同动物的病程差异很大,详见表1。在四只AGM患者中,有两只动物在感染后第8天(NC 34)和22天(NC 33)出现严重呼吸体征并被安乐死,这符合NHP研究方案的终点标准,正如我们先前所报道的那样。18。其余2例AGM中,NC 38多灶轻到中度间质性肺炎,分布于所有肺叶,NC 40多无症状,尸检时所有肺叶均无炎症。四个RM中有三个(GH 99、HD 09和FR 04)发展为肺炎,其特征是肉芽肿性肉芽肿性炎症反应。GH 99严重,HD 09轻度,FR 04最低。第四RM(HB 37)的组织病理学显示右肺中叶有淋巴细胞性血管炎和增殖性血管病变。

图1:单核细胞是支气管肺泡病毒复制的相关因素。
figure1

a学习设计原理图。箭表示接种SARS-CoV-2(第0天)或献祭(感染后最多28天)的时间.除非另有说明,恒河猴的数据以teal显示,非洲绿色猴子的数据以洋红显示。bSARS-CoV-2RNA水平随时间的推移而变化。cSARS-CoV-2在支气管刷中的负荷与所有八种动物疾病严重程度的关系(最严重的病例=1;最轻微的病例=8)(Spearman检验,n=8)。d感染前后血液中单核细胞计数的变化(经单向方差分析调整,图基试验进行多次比较,n=8)。e总单核细胞比例(HLA-DR)+CD 16+和/或CD 14+脱离CD 45+(基线和第1周=8只动物,第2周,3=7只动物,Kruskal-Wallis检验,Dunn‘s多重比较)。fSARS-CoV-2型支气管刷病毒载量与感染后1周血单核细胞绝对计数的相关性(1wk Pi)n=8)。g非经典单核细胞(CD 14)的典型流式细胞术改变低层CD 16感染后血液(1wkπ)。h占古典(CD 14)的百分比CD 16低层)和i非经典单核细胞(CD 14)低层CD 16)外周血单个核细胞总数(基线=8只动物,第1周=4只动物,第2周=3只动物;Kruskal-Wallis检验,Dunn‘s多重比较)。j血液中单核细胞绝对值与血浆TARC(CCL 17)的相关性(1wk Pi)。k支气管肺泡刷(1wk Pi)趋化因子折叠变化与SARS-CoV-2病毒载量的关系。l热图显示对数-8种趋化因子与单核细胞向肺的交通有关的变化(1wk Pi)。动物是按疾病严重程度排序的。所有相关分析均采用Spearman相关检验。

表1 SARS-CoV-2感染后临床和病理结果的异质性.

在研究过程中观察到的临床症状包括GH 99(补充表)中的轻度呼吸暂停(第11天)和咳嗽(第15天)。3)。HB37(感染后1~21天)出现间歇性轻、中度发热.支气管肺泡刷的病毒载量在所有时间点,温度,脉搏氧水平(Spo)2)和排名在女性之间没有差别(n=3)和男性(n=5)或暴露于不同感染途径的动物之间(多途径)n=4和气溶胶n=4),可能是由于每组动物数量很少(补充表)24).

病毒载量与肺病理没有显著关联,但根据上述观察和病理结果,我们在第1周观察到病毒载量与疾病严重程度(从最严重到最不严重的1-8级)之间成反比关系(AGM:R=0.8;RM:R=-0.4,所有动物:P=0.057,R=−0.71,通过Spearman相关检验)(图1.1C和补充图。1A,b,补充表5).

有趣的是,病毒驱动的免疫变化在当时物种之间是非常相似的(图一)。1和补充图。1)。为了研究两组病毒复制所致的总体变化,我们结合他们的免疫学分析,同时对每种动物保持了不同的规格(teal=rm和洋红=AGM)。数据和统计数据也分别显示在每组补充图中。1。在感染后1周,AGM和RM均增加了血液中单核细胞的绝对数量和频率。P=0.065,以及P=0.02,分别通过Tukey多重比较检验,n=8)与基线水平比较(图1)。1D,e)。这一变化仅在AGM一项就具有重大意义(绝对值:P=0.0006,n=4),在所有RM中也观察到,特别是GH 99(补充图)。1C-f)。值得注意的是,当将GH 99从统计分析中剔除时,单核细胞的绝对数量仍然显著增加(P=0.00002,补充图。1g)。血液中中性粒细胞的绝对数量没有随时间变化(补充图)。)。有趣的是,第一周单核细胞的绝对数量与支气管刷样本中病毒载量水平呈显著正相关(P=0.002,R当所有动物组合在一起时,斯皮尔曼试验为0.93(见图)。1F)(AGM:R=0.8;R=1,在分离组中无显着性意义,补充图。1I,j),当GH 99从统计分析中去除时仍显着(补充图)。1K).

然后,我们使用CD 14和CD 16标记来区分三种循环单核细胞的亚型:经典的(CD 14)。CD 16低层)、中间(CD 14)CD 16)和非经典(CD 14)低层CD 16(CD 45,Live,HLA-DR)+CD16hi)流式细胞仪检测单核细胞群体。1H-I和补充图。2)。子集是门控的,如附图所示。2A,使用不包括CD 16的策略+HLA-DR阴性的NK细胞24。在第一周,人类血液中经典单核细胞的频率显著增加。25,而非经典人口则严重枯竭(基线水平的增加相对于第一周的水平:古典水平)。P=0.007和下降的非经典P=0.005在所有动物中,n=4)(图4。1H,I和补充图。2Be)。正如我们观察到的频率,与基线值相比,经典单核细胞和非经典单核细胞在第1周的绝对计数也分别显著增加和减少(补充图1)。2F,g)。有趣的是,感染前的水平即使在感染后3周也没有完全恢复(第1周和第3周:经典的)。P=0.03和非经典P=0.03),作为循环CD 16的数量单核细胞随时间增加(非经典的第一周与第三周:P=0.0019)。这些结果表明,在这两种物种感染后,新生的骨髓发生和快速、健壮地补充组织中的巡逻单核细胞。我们没有观察到中间单核细胞的频率或数量的变化(补充图)。2H,i)。根据我们观察到的单核细胞总数,在第一周,单核细胞亚群的计数与在支气管肺泡部位检测到的病毒复制呈正相关(经典:R=0.98;P=0.06,非经典:R=0.96;P=0.03和中间R=0.94;P=0.06,皮尔逊试验),进一步表明,健壮的骨髓生成是由肺部病毒驱动的。在单核细胞总数中,非经典单核细胞的频率与较低的病毒载量显著相关(经典:R=−0.9867;P=0.0133,经皮尔逊检验,经多次比较调整后P=0.07)。重要的是要注意的是,这些分析中没有一个是显着的,当数值被调整为多个比较时(补充表)。6).

最近对人类的研究表明,在新冠肺炎患者中,CD 14阳性细胞表达低水平HLA-DR的频率增加。这些细胞表型与骨髓源性抑制细胞(MdSCs)的抑制亚群相似。8因此,它们可以减少疾病引起的炎症。我们和其他人已经用流式细胞术鉴定了猴子血液中的MDSCs为HLA-DR。低层CD 14CD 45/活细胞26,27。在我们的研究中,一些动物在第三周的MDSCs频率比基线水平增加,然而,这些变化并没有显着性(补充图)。2L)。我们在同一时间点(基线和第3周)测定精氨酸酶1活性作为评价免疫抑制性髓系细胞功能的一种方法,并且我们没有观察到随着时间的推移血浆有明显的变化(补充图)。2M)28.

我们分析了一组已知参与从血液到肺的天然细胞(包括单核细胞)动员的8种趋化因子:IP-10(CXCL-10)、MCP-1(CCL 2)、MCP-4(CCL 13)、Eotaxin、TARC(CCL 17)、MDC(CCL 22)、MIP-1α和MIP-1β(补充图)。3A-h)。补充图中的主成分分析显示,两种动物(MCP-4、Eotaxin、MIP-1b和MDC)在基线时测定的一些趋化因子存在差异。3I(补充表格)79)。参与Th2细胞募集的CCR 4配体TARC(CCL 17)的血浆水平29,与血液中单核细胞的频率密切相关(P=0.003,R=0.95,Spearman检验,经多次比较调整后:P=0.02)(图1。1J)。同样,TARC/CCL 17也与BAL在第1周的病毒复制有关(图1)。1K和补充图。3J,k) (P=0.02,R=0.857,经多次比较调整后:P=0.2,和R=0.927和P=0.016当GH 99被排除在分析之外时),如IP-10(P=0.05,R=0.78,经多次比较调整后,当所有动物分组在一起时(如图所示)。1K和补充图。3L),CXCR 3的一种配体,与疾病严重程度相关,并预测新冠肺炎在人体内的进展。30。为了更好地理解一种共同的环境,可能是推动单核细胞迁移的两组观察到的,我们分析了这些标记水平的变化与基线(图一)。1L和补充表8)。总的来说,这一分析显示,疾病最严重的动物在第一周有更高水平的趋化因子,包括IP-10,TARC(CCL 17)。

骨髓细胞浸润BAL并与IL-6相关

观察到严重新冠肺炎患者肺内巨噬细胞大量涌入人体。31。为了监测细胞向肺部的迁移,我们在基线和感染后第3周收集支气管肺泡灌洗(BAL)。正如预期的那样,在基线时BAL中发现的大多数细胞是肺泡巨噬细胞(AM)。32。这些细胞容易被甘露糖受体C型(CD 206)标记物所识别,表达高水平的HLA-DR,并且对清道夫受体CD 163呈阳性。2和补充图。4A,b)。我们观察到两种动物感染后第一周AM的比例下降,与髓系HLA-DR的内流相对应。+CD 206CD 163细胞(图1.2A,b和补充图。4C)。除一只动物外,所有动物(GH 99)均于第2周恢复与感染前相似的AM水平,并观察到cd86平均荧光强度(MFI)随之增加,提示m1处于激活状态。33(补充图。4D)。CD 206的频率也有所增加。+CD 163以前曾被描述为内皮细胞,它促进淋巴细胞的迁移,在炎症事件中可在BAL中检测到(如图所示)。2C)34.

图2:BAL中髓鞘细胞增多与IL-6有关.
figure2

a肺泡巨噬细胞减少(定义为HLA-DR)+CD 206+CD 163+感染后BAL细胞)。b髓细胞浸润频率增加(定义为HLA-DR)+CD 206CD 163)和c内皮细胞(定义为HLA-DR)+CD 206CD 163+)BAL感染(1wkπ)。数字ac, n基线周分别为7,4,8,4周,分别为1、2和3个时间点,并采用Dunn的多重比较检验Kruskal-Wallis检验进行分析。条形图表示平均误差和标准误差。dTsne图显示CD 16、CD11b和CD11c标记在活体/HLA-DR上的表达动力学+BAL感染前后细胞数量。eCD11c浇口+和CD11b+基于抗原表达和离散密度聚类的tSNE图谱上的群体。f中所示的种群特征e。热图描绘了每种抗原与阴性表达细胞群体的通道值相比较的折叠变化值。gCD 16的百分比增加+赫拉博士+细胞和h间质巨噬细胞百分比(CD 16)+CD 206赫拉博士+)CD11c和CD11c的表达iBAL加班费中的CD11b(基线)n=8,第1周n=4,第2周和第3周n=7;Kruskal-Wallis检验,Dunn的多重比较)。

T分布随机邻居嵌入(TSNE)分析显示CD 16、CD11b和CD11c阳性群体在感染后1~2周的表型变化最为明显(图一)。二维f)。与我们在血液中观察到的情况相比,CD 16增加了。+赫拉博士+BAL加班费中的细胞(图1.2G,以及附图。4E,f)。我们观察到CD11c水平暂时升高。+CD 16+髓核细胞功能被描述为巡逻,它们参与组织的快速侵袭和单核细胞的存活(基线与第一周:P=0.015)(图1。2H)35,36。CD11c频率+在第3周时,BAL中的巨噬细胞与血浆中促炎性IL-6细胞因子的水平在同一时间点(第3周:P=0.003,R=0.96,Spearman检验)(附图。5)。CD11b标记是单核细胞迁移到炎症部位所必需的。37,并在从血液中募集并分化为巨噬细胞的髓系细胞上高表达。38。我们还观察到CD11b的百分比有所增加。+CD 16+赫拉博士+CD 206感染后第2周和第3周BAL中的髓鞘细胞(如图所示)。2I),参与调节肺部炎症反应的人群20,33,39,40。两个粒细胞的门控策略如图所示。4G.

感染动物肺组织中积聚间质巨噬细胞

在研究结束时为所有动物收集肺部,相当于感染后4周(上一次BAL采集后1周,如图所示)。2),但NC 33和NC 34除外。与其他六只猴子相比,这两只动物在尸检中的IL-6水平较高,NC 34的症状与ards相似。18(无花果)3)。总体上,坏死时SARS-CoV-2感染的AGM和RM肺中可见巨噬细胞浸润,重症动物的巨噬细胞浸润较强(图一)。3A)。我们用AM标记物CD 206(蓝色)和CD11b整合素(绿色)和CD 16(红色)染色进一步表征了肺巨噬细胞的数量。3B)。如箭头所示,在非感染对照RM的肺中可见少量巨噬细胞,分布在肺间质和肺泡间隙。在对照组中,这一群体是双态的,由cd11b阴性的cd 16组成。+CD 206(箭头)在肺泡间隔或CD 16中+CD 206+肺泡间隙内的细胞(箭头)(图)。3B)。在所有被感染的动物中,我们可以检测到CD11b。+CD 16+巨噬细胞。FR 04(RM级=7)肺巨噬细胞分布于肺间质和肺泡间隙。表型群体异质性强,CD11b含量低。+CD 16+CD 206巨噬细胞。最严重的RM GH 99(排序=3)有大量巨噬细胞多灶包围小气道,以星号表示。值得注意的是,这种动物在第一周血液中的单核细胞绝对数量更多(补充图)。1D)。CD11b数量低+CD 16+CD 206细胞分布在CD11b的优势种群中。+CD 16+CD 206+巨噬细胞。巨噬细胞也分散在间质和肺泡间隙。NC 34和NC 33(AGM排序分别为1和2)具有多灶聚集出血区(NC 33,箭头所示),肺实质被巨噬细胞多焦聚集浸润(NC 34),巨噬细胞浸润到中低数量的巨噬细胞。表型群体具有异质性,由一定数量的CD11b组成。+CD 16+CD 206巨噬细胞。

图3:SARS-CoV-2感染动物肺间质巨噬细胞增多.
figure3

a在感染SARS-CoV-2的恒河猴和AGM患者中,巨噬细胞浸润从小到重不等。bAGM和RM肺组织中CD 16浸润的荧光免疫组化研究+CD11b+CD 206巨噬细胞(箭头),CD 16较少+CD 206+巨噬细胞(箭头)嵌体显示CD 16的高倍率+CD11b+CD 206巨噬细胞(箭头)Asterix显示GH 99中巨噬细胞多灶包围小气道。白色:DAPI(细胞核);绿色:CD11b;红色:CD 16;蓝色:CD 206。

用CD 68/CD 163(红色)和CD3:(蓝色)染色动物FR 04、GH 99和NC 34。动物FR 04(RM排名=7)已分离出CD3+细胞散落于肺内。GH 99(RM排名=3)有混合群体CD3的细胞聚集。+和CD 68/CD 163+细胞在一个孤立的区域发炎。NC 34(AGM排名=1)有罕见的、小的CD3聚合体。+细胞(附图)6)。总之,这些发现提供了一幅长期持续的肺部炎症的图片,尽管在有严重疾病征象的动物中更为明显,但在感染开始后4周后,病毒载量不明显和轻微或没有疾病迹象的动物也会出现这种情况。

重症动物中性粒细胞积聚

在这项研究中,我们没有观察到感染过程中血液中中性粒细胞绝对数量的变化(补充图)。)。有趣的是,对猴子和人类的研究表明,中性粒细胞的水平增加了,并暗示他们的成熟不受管制,CD11b是定义前中性粒细胞的标志之一。8,9,41,42,43。我们用中性粒细胞的抗髓过氧化物酶(MPO)抗体和抗CD11b抗体对NC 33、NC 34、GH 99、FR 04和NC 40的肺进行染色。4A)。MPO+细胞44重症动物(NC 33,NC 34)升高。GH 99有中性粒细胞聚集区,其余动物低。对照组肺内的中性粒细胞很少(如图所示)。4B)。CD11b+MPO+中性粒细胞仅存在于感染的动物中,同时也存在于NC 33中(如图所示)。4C)。因此,在患有严重疾病的动物身上可以看到中性粒细胞和淋巴细胞,而在中度疾病的动物中则看不到(补充图)。7)。NC 34(感染后第8天死亡;秩=1,严重)有淋巴管周围的淋巴细胞聚集,与中性粒细胞和组织细胞混合。在NC 38(死亡第28天,第5级,中度)淋巴细胞聚集分散在肺泡间隔,主要与组织细胞和罕见的中性粒细胞混合。

图4:CD11b+中性粒细胞聚集在感染严重疾病的动物的肺中。
figure4

aAGM和RM肺组织荧光免疫组化显示MPO浸润+中性粒细胞与MPO+CD11b+中性粒细胞。MPO和CD11b染色。白色:DAPI(细胞核);绿色:CD11b;红色:MPO。MPO阳性细胞(红色、箭头)的数量与肺疾病的严重程度成正比,从对照组的罕见(HK11)增加到FR 04的轻度、GH 99的中度和NC 34的重度。对偶正MPO+CD11b+阳性细胞(箭头)存在于受影响最严重的动物(NC 34)中。bMPO的平均数和数目+细胞,每个点是一个计数,标准差表示阳性细胞/面积和c和MPO+CD11b+每毫米2肺坏死。

NKG2A+细胞与pd-1+血T细胞减少,BAL加时增加

SARS-CoV-2感染的AGM和RM在尸检时肺内可见淋巴细胞浸润,重症动物的淋巴细胞浸润较强(图一)。5A)。我们首先分析了先天NK细胞亚群的动力学,我们将其定义为HLA-DR。CD3表达NKG2A受体的细胞,这是已知的肺交通45(无花果)5B-f和补充图。8)。有趣的是,NKG2A的频率+在感染过程中,AGM和RM的外周血细胞明显减少(基线与第3周,P=0.03)(图1。5B)。我们还观察到,与所描述的髓细胞群的模式一致,NKG2A的频率也随之增加。+BAL中的细胞(基线与第3周,P=0.05)(图1。5C,d和补充图。8A-c)。四分之一的AGM降低了NKG2A+外周血中的细胞与BAL中相同细胞的增加相一致。而NKG2A的模式+RM外周血中的细胞无统计学意义,但该物种BAL中这些细胞明显增多。这些结果表明NKG2A的丢失+PBMC中的细胞与NKG2A的增益+BAL中的细胞可能与这些细胞从外周血进入组织的过程相吻合。因此,NKG2A的频率+表达CXCR 3的细胞,这是一种与NK细胞向肺迁移相关的标记物46随着时间的推移,血液也明显减少(基线与第三周相比,P=0.03,图1。5E)。尽管淋巴细胞表型发生了这种变化,但在感染的前2周,淋巴细胞的绝对数量并没有变化(图1)。5F然而,重要的是要注意的是,所有三个剩余的AGM在第3周有所增加(补充图)。8D,e).

图5:肺部淋巴细胞浸润与疾病严重程度有关。
figure5

a病理组织学表现为淋巴细胞浸润AGM(NC 40和NC 34)和RM(FR 04和GH 99),轻度(NC 40和FR 04),中度(GH 99)和重症(NC 34)。bNKG2A频率+血液中的细胞c流式细胞术检测SARS-CoV-2感染后基线、2周和3周时4例AGM和4例RM的BAL。d具有代表性的流式细胞仪图显示NGK2a的频率降低+PBMCs细胞和BAL细胞频率在SARS-CoV-2感染后第3周增加至基线。图中每种动物各有一只。e降低CXCR 3的频率+NKG2A+SARS-CoV-2感染后2周和3周血中细胞与基线相比较。f感染前后淋巴细胞绝对数。gTSNE图显示Pd-1在淋巴细胞群体中的表达动力学。hPd-1频率+Th2(CXCR 3)CCR 6)CD4+T细胞在RM和i在AGM感染后加班加点。jPd-1中Th2(紫色)、Th1(蓝色)和Th17(灰色)细胞百分比的变化+CD4+T细胞群kPD-1所占百分比显著增加+CD8+BAL中的T细胞。方差分析(ANOVA)用于比较多组间的统计差异,邓恩(Dunn)的多重比较检验b, c,和k.

Tsne分析显示pd-1水平在感染后第2周和第3周升高,与相应的空间区域相重叠。+T和CD8+T细胞(图1.5G和补充图。9A)。事实上,pd-1的频率+CD4+T细胞在RM和AGM血液中均升高。5H,i分别)。在感染后的第一周,我们观察到ip-10和IFN-γ(补充图)的增加。9B)然而,我们也观察到一种向Th2型反应的转变,其特征是Th2细胞因子IL-5和IL-13随时间的增加而增加(补充图1)。9B)。因此,Th2型细胞逐渐增多(定义为cxcr 3)。CCR 6CD4+T细胞)24在Pd-1阳性人群的血液中被发现(如图所示)。5J)。Pd-1的增加+Th2细胞与IL-4细胞因子水平呈显著正相关(P=0.016,R=0.94,Spearman检验)(附图。9C)。此外,我们观察到pd-1水平升高。+CD8+BAL中的T细胞(基线与第2周,P=0.015;基线与第3周,P=0.03)(图1。5K)。按物种划分的动物如附图所示。9d,e。病毒复制与pd-1频率的关系+CD4+血中T细胞与pd-1+CD8+第3周BAL中发现T细胞(补充图)。9g-i)然而,它们很可能是由AGM驱动的,而不是RM,在特定的时间点,Rm在支气管刷中没有可检测到的病毒复制。

抗炎和促炎反应的比率与疾病进展有关.促炎症细胞因子IL-6被描述为人类疾病进展的一个强有力的预测因子。3,7。我们测定了所有动物血浆中的IL-6和IL-10。6A)。IL-6水平与NHPs的疾病严重程度无关,血浆中IL-10-IL-6水平的比值与疾病严重程度的排序和通过分析肺部炎症和水肿的扩展所获得的病理评分有关(R=0.76P=0.037;及R=−0.76,P=0.03,通过Spearman相关检验,所有动物)。6B,c)。为了进一步研究,我们还测量了血浆中色氨酸和尿激酶水平在基线,第1周,第3周,在尸检(补充图)。10)。Kynurenine在第3周升高,与基线水平相比显著增加(P=0.013;)Kynurenine(Kyn)/色氨酸(Tryp)比值被用来测量吲哚胺2,3-双加氧酶(Ido)的活性,并经常与T细胞调节功能相关。21。与观察到的IL-10:IL-6比值的关联一致,Kyn/Tryp比值也与病理评分呈负相关(1=轻度-18=严重),提示免疫抑制程度较高的动物肺部炎症较少,病情转归较好(图一)。6d).

图6:在没有IL-10的情况下,IL-6升高与疾病进展有关.
figure6

血浆IL-6和IL-10水平随时间的变化(pg/mL)a)和b血浆IL-10/IL-6比值与疾病严重程度的关系c病理评分(n=8),经Spearman相关检验。d血浆Kyn/Tryp比值(PG/mL)与病理评分的相关性(英文)n=8,Spearman检验)。eSARS-CoV-2感染动物肺和血液中免疫事件的总结,从1-急性期2-转变为Th2型反应和3-分辨期。

这些发现显示了肺部一系列复杂的免疫事件,这些事件很可能是作为宿主对病毒的反应开始的,然后随着时间的推移演变成较少的抗病毒反应,如图所示。6E.

讨论

迫切需要制定安全有效的战略,预防和治疗新冠肺炎。这些策略的发展需要明确了解新冠肺炎参与的免疫细胞及其在发病机制中的独特作用。对病人的临床观察和对非人类灵长类动物的研究很少开始揭示新冠肺炎所涉及的免疫方面。8,9,11,22,47,48。在此,我们进一步描述了sars-cov-2感染后的免疫事件。16,18.

总之,我们的发现为AGM和RM的多期免疫反应提供了第一证据,其特征是:(1)单核细胞向肺内募集的初始炎症期;(2)从1型逐渐转变为2型反应;(3)“要么成功,要么打破它”期,增加抗炎细胞因子IL-10和具有抑制活性的调节细胞亚群或IL-6,这是一种与人类疾病进展相关的促炎细胞因子。6E.

通过观察单核细胞、粒细胞细胞和巨噬细胞在血液、BAL和肺中的时间和空间分布,我们证实并扩展了对人类和NHPs的研究,表明在最初由肺部复制的病毒驱动的感染期间,髓系细胞从血液中向肺中募集,从而增强了骨髓造血。3,16,22。类似于Wilk等人所描述的。和Thevarajan等人。在人类身上,我们观察到经典CD 14的增加。单核细胞及其在外周血中表达CD 16的频率下降22,23。重要的是,我们利用这些发现,同时增加了巡逻CD 16的频率。赫拉博士+通过描述两种CD 16的动力学,BAL中的单核细胞发生在两种细胞中+赫拉博士+CD 206巨噬细胞优先填充肺泡间质并表现出抗原提呈细胞特征的巨噬细胞49。CD11c+CD 16+血管内CD 16细胞在急性期巡逻单核细胞,并与IL-6水平及CD11b相关。+巨噬细胞群参与肺炎症的解决20,33,39,40。CD11b频率较高+人类血液中观察到疾病严重程度增加的单核细胞。8。这些间质巨噬细胞的来源和确切功能仍有待确定。

与人类观察到的和以前报告的rm数据不同,我们没有检测到中性粒细胞数量的增加,因为这些反应可能出现在感染后1周之前,正如其他人所显示的那样。16。在尸检,CD11b+MPO+嗜中性粒细胞存在于患有严重疾病的动物的肺部,就像在人类身上所观察到的那样。还需要更多的研究来确定sars-cov-2是否导致未成熟的中性粒细胞的积累,就像人类所看到的那样。8,9.

这两种动物的共同之处是观察到,肺内髓样细胞和淋巴细胞浸润程度较高的动物的疾病结局更差。对sars-cov-1和cov-2的几项研究都报告了严重患者外周血NK细胞的减少。11,22,25,47。我们的数据支持NKG2A的概念。+细胞在sars-cov-2感染期间向肺内迁移,最有可能是由ip-10(cxcl-10)介导,从而促进cxcr 3的生成。+Th1胸腺细胞和NKs50,51。NKG2A的表达与炎症的活化和抑制有关。52SARS-CoV-2的作用有待进一步研究.在外周,我们还观察到T细胞上Pd-1水平的升高.这与描述sars-cov-1和cov-2感染期间的T细胞表型的人类研究结果是一致的。11,53.

我们发现TARC(CCL 17)可能是SARS-CoV-2期肺内髓样增生的介导因子.树突状细胞和CD11b+在其他肺部炎症疾病中,肺巨噬细胞已被确认为气道中CCL 17的来源。54,55。这些细胞促进T辅助型2型(Th2)淋巴细胞进入气道。54。有趣的是,我们观察到Th2淋巴细胞进入气道和Th2型细胞因子(如IL-5和IL-13)逐渐增多。这些发现显示了肺部一系列复杂的免疫事件,这些事件最有可能是宿主对病毒的反应,它们可能演变成其他不太有效的抗病毒反应,作为组织修复/解决炎症的一种尝试,如图所示。6E或者是病毒直接免疫调节宿主反应的结果6.

Nhp在sars-cov-1中的固有物种特异性易感性已被描述。6AGM比恒河猴更易患严重疾病。RM和AGM的免疫反应在动力学和质量上有出乎意料的相似之处,特别是在感染的急性期,但AGM没有清除感染,RM和两例AGM的症状最严重。56。虽然参加这项研究的动物数量不足以观察物种间的差异及其对疾病进展的影响,但我们发现血浆中IL-10:IL-6的高比例与疾病的严重程度有关。毫无疑问,还需要更多的研究来证明或否定IL-10和IL-6在新冠肺炎疾病发病中的单一贡献,并找出这两个潜在的关键因素的来源。57。动态平衡对SASR-CoV-2的PRO和抗免疫反应在疾病进展和预后中具有重要作用的观点得到了病理评分和Kyn/Tryp的支持,提示T调节细胞在新冠肺炎肺部炎症的解决中起着重要作用。

总的来说,这项研究揭示了宿主对SARS-CoV-2的免疫反应的关键步骤,并描述了病毒复制与疾病进展的相关关系。我们发现病毒驱动的炎症/细胞向肺部的吸收迅速发生,并持续到感染后4周,这可能部分解释了新冠肺炎观察到的人体缓慢恢复的原因。最后,这些发现可能有助于解释目前正在对几个候选疫苗进行的人体试验的结果,并可能有助于制定有针对性的治疗策略,以解决新冠肺炎患者严重的肺部免疫失调问题。

方法

关于动物使用和SARS-CoV-2处理的伦理声明

动物和感染。杜兰大学动物保护和使用委员会审查并批准了这项研究的所有程序。杜兰国家灵长类研究中心完全通过AAALAC认证。所有动物都是按照ILAR指南护理和使用实验动物第8版。杜兰大学机构生物安全委员会批准了样品处理、灭活和从BSL 3安全壳转移的程序。

动物与感染

4只非洲绿色成年猴子(来自加勒比)和4只恒河猴(猕猴,印度血统)暴露于SARS-CoV-2;2019年-nCoV/美国-WA1/2020409(MN 985325.1)。病毒在Vero E6细胞中制备,序列经PCR和/或Sanger测序证实。对Vero E6细胞进行菌斑分析。恒河猴来自杜兰国家灵长类研究中心繁殖群体,无猴D型逆转录病毒(SRV)病原体,马卡辛疱疹病毒1(B)猴免疫缺陷病毒(SIV),猴T淋巴细胞/白血病病毒(STLV),麻疹病毒(MV)及结核分枝杆菌(TB)。这些非洲绿猴被野生捕获,并被关在TNPRC超过一年,然后被分配到这项研究。为了模拟人类感染的不同途径,动物被暴露在气溶胶中(吸入剂量为2.0×103和2.5×103 TCID)。50)或通过多种途径(口服、鼻、气管内、结膜)接种3.61×106 pfu累积剂量(补充表)1).

多途径接触4只动物,1只成年RM雄性(GH 99,14岁),1只成年RM雌性(HD 09,13岁)和2只AGM,1只成年雄性(NC 40,16岁,约)和1只老年雌性(NC 33,16岁,约)。另外两名成年男性RM(分别为FR 04和HB 37、15和13岁)和一名男性和女性AGM:NC 34和NC 38(大约16岁)被气溶胶暴露(补充表)。1)。恒河猴的笼养寿命一般为20年,而非洲绿猴的寿命为15年。58。与人类相比,猕猴的年龄通常是3岁,GH 99的肺部老化迹象与新冠肺炎无关。

细胞计数与CO2和SPO2压力测量

在2级实验室的SysmexXN-1000V血液学分析仪和3级实验室的SysmexXN-1000V血液学分析仪上,对总白细胞计数、白细胞分化、红细胞计数、血小板计数、红细胞压积值、总血红蛋白浓度、平均红细胞体积、平均红细胞体积和平均红细胞血红蛋白浓度进行了分析。协和2测量是在三级实验室使用Piccolo Express化学分析仪进行的,是代谢综合面板的一部分。SPO2数值是用Masimo Rad-57手持式脉冲氧表(补充表)获得的。3).

样品采集与处理

乙二胺四胺四乙酸(EDTA)经静脉穿刺、支气管刷取血,BAL经支气管镜取血。对于后者,支气管镜被导入气管并直接进入其中一个支气管。支气管镜被推进到支气管镜的直径与支气管的尺寸近似的程度。支气管刷通过支气管镜的通道。毛刷轻轻地向前推进,直到支气管或细支气管的管腔接近毛刷的尺寸。然后,刷子被轻轻地向前推进,在粘膜上来回移动以收集细胞。将毛刷从支气管镜通道移除,并将刷置入2 0 0μL的dna/RNA屏蔽X1(Cat.R 1200,Zymo Research,Irvine,CA)。支气管镜保持不变,两个20毫升生理盐水的假体被注入支气管,然后吸气。这个过程然后在相反的肺重复。

血液在Ficoll-菌斑+(GE Healthcare 17144003)上分层,并在带帽的适配器中离心30分钟。离心过程中细胞的差异迁移导致了包含不同细胞类型的层的形成,并允许从其他群体收集外周血单个核细胞(PBMCs)。PBMCs收集、计数、留置管内或再悬浮于含胎牛血清和DMSO的冷冻培养基中。支气管肺泡灌洗(BAL)用离心法(2000×15 min)分离细胞和上清液。g细胞在室温下用氯化铵溶解缓冲液溶解5 min(吉布科#A 1049201),用2%的FBS洗涤,再悬浮在PBS中,在BCL 3的层流罩下计数。新鲜细胞进行流式细胞术染色。

BAL和PBMCs染色

新鲜获得的PBMCs和BAL细胞用合适的抗体鸡尾酒染色,室温下孵育30 min。抗体列于补充表10。除CD 56和PD-1(4μL)外,其余均采用3种μL抗体。隔夜用4%或2%的PFA-BSA固定细胞.样品在生物安全柜内的FACSAria融合流式细胞仪(Becton Dickinson)上运行,每个样本至少运行5分钟。对于所有面板,使用活/死固定的Aqua死细胞染色试剂盒(热Fisher#L 34957)。单核细胞亚群被门控,如补充图所述。2A如前所述24。肺泡巨噬细胞根据HLA-DR、CD 206和CD 163标记的大小和表达进行门控。髓系浸润细胞CD 206和CD 163阴性,HLA-DR、CD 16和CD11b阳性。门控策略如图所示。4G。NKG2A+在补充图中,CD3阴性亲本群体(BAL FR 04,第2周)对细胞进行了门控。8A。Th1、Th2和Th17细胞被关闭,如前面所述。24。使用opt-sne算法在Flowjo中进行tsne分析,并使用ggplot 2软件包在R中创建图。59.

组织病理学和评分

将组织标本固定在石蜡包埋的Z-FIX(Anatech)中,切下5-μm厚的切片,贴于荷电玻片上,用苏木精和伊红染色。所有的幻灯片在蔡司Axio扫描仪上扫描。Z1数字幻灯片扫描仪。利用HALO软件(Indica实验室)获取图像。应用Halo软件对病理病变进行定量。机器学习(随机森林)算法是由董事会认证的病理学家训练的,以识别RM和AGM肺部的液体和细胞炎症。根据肺受感染的百分比,分别对流感和细胞炎症进行评分。所有叶和动物的流体力学和细胞炎症评分相加,从1(最高)到8(最低)。

血浆细胞因子和趋化因子

用纺丝法收集血浆,并在使用前解冻。用497个中尺度发现法测定细胞因子。IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和IL-13是V-Plex临炎症小组1,10-Plex的一部分.V-plex。趋化因子面板(#K15049D,中尺度发现,马里兰州罗克维尔)也被使用,按照试剂盒的说明。该板块是在Meso Quickplex 500 SQ 120机器上读取的。

热图是使用R中的“phatmap”包生成的。60,61。对数据进行标准化处理,将第一周的原始值除以每只动物的基线值,然后应用log。2。在检测极限以下的值被替换为基于每次运行的标准曲线的最低检测值,或替换为运行期间检测到的最低值,以较小的值为准。使用R中的“ggplot 2”包生成气泡图,使用热图中显示的相同的归一化数据。59。散点图使用原始数据点绘制,并显示Pearson的相关系数和95%的置信区间。

RNA分离

在2 0 0μL的dna/rna屏蔽X1(Cat.R 12 0,Zymo Research,Irvine,CA)中采集拭子和支气管刷标本,用快速RNA病毒试剂盒(Cat.R 1034/5,Zymo Research)提取病毒RNA(VRNA)。病毒RNA缓冲液直接分配到DNA/RNA盾牌中的拭子上。棉签直接插入自旋柱。VRNA洗脱(45μL),5μL加入0.1mL快速96孔光学微滴度板(猫#4346906,热费雪,CA)中。

病毒RNA检测

采用RT-qPCR反应TaqPath 1-步骤多路聚合酶链反应(猫#A 28527,热Fisher)和2019年-nCoV Ruo Kit(猫#10006713,IDTDNA,Coralville,IA)针对SARS 2-nCoV 19基因N1片段(登录MN 908947)。在覆盖光学薄膜的微滴度板(猫#4311971;热费舍尔)上加入主混合物,然后进行旋涡和脉冲离心。RT-qPCR程序包括:25°C孵育2 min,RT 50°C孵育15 min,95°C酶活2 min,95°C变性3s,60°C退火30s,应用生物系统QantStudio6序列检测器检测荧光信号。利用序列检测器软件V1.3(应用生物系统,福斯特市,CA)对数据进行采集和分析。病毒拷贝数是通过绘制从未知(即测试)样本中得到的CQ值来计算的,而标准曲线则表示已知的病毒拷贝数。检测限为每反应体积10份。将2019年-nCoV阳性对照(猫#10006625,IDTDNA)与每组检测样本并行分析.非模板控制(NTC)也包括在内。

免疫组织化学

将5片福尔马林固定、石蜡包埋的肺片安装在带电玻璃片上,在56°C下烘烤一夜,通过二甲苯、分级乙醇和双蒸馏水去除石蜡和再水合物组织切片。利用微波进行热诱导表位的提取,并在载体实验室(H-3301和H-3300)的高、低pH溶液中依次进行。CD 16+和MPO+细胞检测采用Mach3AP试剂盒(Biocare MedicalM3M532或M3R533)和永久性红色底物(DAK0640)。MPO+CD3细胞+细胞CD11b+CD 68细胞+/CD 163+细胞和CD 206+用补充表中描述的抗体检测细胞10。用1%正常驴血清或10%正常山羊血清组成的封闭缓冲液孵育玻片40 min。所有初级抗体在室温下孵育60 min,所有二次抗体孵育40 min,其间彻底清洗。用DAPI(4‘,6-二氨基-2-苯基吲哚)标记各区段的细胞核.幻灯片安装在自制的抗猝灭安装介质中,包括Mowiol(CalBiochem#475904)和DABCO(Sigma#D 2522),并用蔡司Axio扫描仪成像。

精氨酸酶活性

采用精氨酸酶活性分析试剂盒(MAK 112,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)分析血浆中精氨酸酶活性。简单地说,样品在冰上解冻,为了消耗尿素,将40μL的血浆装入AMION Ultra 10K离心式过滤器(UFC 501096 EMD微孔),用纯水稀释至500μL,然后以13 000×10×离心。g4°C离心30 min后,洗脱液被丢弃。过滤后的样品用纯净水稀释至500μL,然后以13,000×g在4°C下离心30 min,测定每个样品的剩余体积,并加入超纯水达到40μL。每个样品装入96孔板(20μL/井)的两口井中,代表样品井,每口井加入空白井,每口井加入20μL/井的超纯水。与样品一起,分别以尿素标准和水作为阳性对照和阴性对照。样本以单一的方式加载,而对照组则以一式两份的形式加载。除空白井外,分别加入精氨酸缓冲液和锰溶液组成的5×底物缓冲液10μL,在37℃下孵育120 min,分别加入由试剂A和B组成的2 0 0μL尿素试剂,以阻止反应。最后,在样品空白井中加入10μL的5×底物缓冲液,使其具有与样品井相同的试剂比例。搅拌后,在RT下孵育60 min,最后用微板分光光度计XS2(BioTek测仪器,Winooski,VT)在430 nm处测定吸光度(A)。430)每一口井。精氨酸酶活性按[(样井)−(空白)/(尿素−空白)]×[(1mm×50×10 3)/(40μL×12 0 min)]方程测定。

尿氨酸和色氨酸血浆水平

用色氨酸ELISA法(美国科罗拉多州落基山诊断法、美国Cat.#BA E-2700)和金纽林ELISA试剂盒(科罗拉多州斯普林斯州洛基山诊断法、美国科罗拉多州CO公司、美国Cat.#BA E-2200)测定血浆色氨酸和尿氨酸浓度。色氨酸测定采用20μL血浆沉淀,回收上清液衍生化,产物按生产厂家指示进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。Kynurenine法用10μL的血浆进行酰化,并根据生产厂家的指示进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。数据以Kynurenine与色氨酸(Krn/TRY)水平的比值表示。

统计分析

用非参数Spearman秩相关方法(双尾,95%置信度)进行相关分析。P-使用等级时的值,或两个变量连续时的Pearson相关检验。方差分析(ANOVA)用于比较多组间的统计差异,随后采用Dunn的多重比较检验。采用Kruskal-Wallis方差分析或Man-Whitney检验。所有统计分析都使用GraphPad Prism(美国加利福尼亚州La Jolla GraphPad软件8.4.2版)和R软件(URL:Http://www.R-project.org/)。相关图分别使用R中的“性能分析”和“corrr”图创建。61,62,63.

统计与重现性

所有的免疫组织化学技术,在肺组织上进行,已经验证和批准使用中心的质量保证单位。经验丰富的核心人员遵循严格的标准操作程序。


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