您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!2008-2020
本企业通过iso9001质量体系认证

Rab6调节MR1分子的循环和逆行运输

 二维码
发表时间:2020-11-30 09:17作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

黏膜相关不变T细胞(MAIT)是一类先天的T细胞亚群,在早期对细菌和病毒性肺部病原体的反应中起着重要的作用。MAIT细胞识别细菌小分子代谢物出现在类I类分子MR1上。与其他I类和II类分子一样,MR1可能通过多种细胞途径在细胞内环境中取样配体。Rab6是一种小的gtp酶,调节着许多内胚体的贩运途径,包括逆行转运到反式高尔基网络(trans-Golgi Network,TGN),它参与了配体的呈现。结核分枝杆菌(MTB)至MAIT细胞。Rab6介导的贩运途径包含与Mtb细胞内室共同特征的内小体区。通过MR1的诱导表达,本研究证明Rab6通过细胞内小体贩运区调节MR1分子从细胞表面到TGN的循环。这种Rab 6依赖的再生MR1库,可用于从细菌病原体(如mtb)中重新装载配体,对于早期识别肺中的MAIT细胞感染细胞可能很重要。

导言

根据2016年世界卫生组织的报告,下呼吸道感染是全世界第四大死亡原因。1。CD8+T细胞识别并杀死受感染的靶细胞,对于控制细胞内肺部细菌病原体的感染尤为重要,如结核分枝杆菌(MTB)2,3,这本身就是导致全世界死亡的第10大原因。1。黏膜相关不变T(MAIT)细胞是细胞毒性T细胞的一个子集,它识别由许多细菌和真菌中存在的维生素B生物合成途径产生的小分子代谢物。4,5,6。动物模型显示MAIT细胞在对肺部细菌病原体的早期反应中起着重要作用,例如[医]塔拉氏白僵菌7,8, 肺炎克雷伯菌9,和长叶军团菌10。这一功能可能是由于黏膜组织中MAIT细胞的相对富集所致。4,6,11,12以及它们表现出即时效应功能的能力13对细菌感染的细胞的反应。

MAIT细胞识别非经典MHC类分子MR1上的细菌小分子配体5,14。MR1在MHCⅡ类阳性和阴性哺乳动物细胞中广泛表达,包括气道上皮细胞。15,16。虽然对mtb的免疫反应的研究主要集中在感染的巨噬细胞和树突状细胞上,但气道上皮细胞对mtb感染很敏感,在向mtb细胞呈递配体方面非常有效。17。MR1在这些细胞中的表达以及MAIT细胞与气道上皮的接近表明,它们在接触Mtb或其他肺部病原体后可以充当哨兵。综上所述,假定MAIT细胞配体丰富,MR1在哺乳动物细胞中普遍表达,MAIT细胞在黏膜组织中富集,提示需要严格调控MR1的载量和呈现,以防止炎症免疫反应的不适当激活。然而,对细菌MAIT细胞配体在MR1上的表达调控机制尚不完全清楚。

由于小分子MAIT细胞配体的性质,MR1的加载不需要经典的抗原处理途径,例如在经典MHCⅠ类分子上加载肽配体的途径。4,18,19。与其他I类分子不同,MR1主要位于内质网(ER)和内小体区。18,20,21,22并在配体的加入下迁移到细胞表面。21,22。虽然有证据表明MR1表面表达式需要MHC第II类伴侣链,但不变量链18这并不能解释MR1抗原在气道上皮细胞等不表达MHCⅡ类或不变链的细胞类型中的表现。目前使用6-甲酰基翼状胬肉素(6-fp)、乙酰基-6-甲蝶呤(ac-6-fp)和5-op-ru配体的模型表明,mr1在c1R细胞中被载于ER中。23)。然而,还有其他途径来控制细菌衍生配体的负载,这些途径有别于外部添加的合成配体的加载和利用内体mr 1。21,24。在随后的报告中,我们确定了6-fp负载的mr 1是允许配体交换的,为气道上皮细胞装载外源性配体提供了稳定的mr 1池。25。我们以前已经证明,内胚体介导的途径被用于mtb在mr1上的配体表达。21,提示细胞内吞和再循环MR1在细胞内微生物配体的表达中起着重要作用。这项研究突出了小GTPase Rab6在MR1依赖抗原呈递的不同途径中的作用。我们构建了一株具有诱导表达MR1的支气管上皮细胞系,以探讨新合成的或已有的MR1蛋白的转运。这种对MR1合成的控制,使我们能够更深入地理解ER-驻留或内质室-驻留的MR1的差异通路,从而将其转移到细胞表面进行抗原提呈。我们在此证明Rab6通过内小体途径调节MR1的循环和逆行转运,但不影响MR1向细胞表面的转运。我们的数据也符合一个模型,其中MR1居住在非ER室是可用的装载新的配体。Mtb的细胞内定位提示Mtb配体可以通过这个Rab6介导的途径进入MR1。

结果

用诱导启动子表达MR1的动力学研究

在支气管上皮细胞系Beas-2B中沉默Rab6可降低MAIT细胞对mtb感染的反应。21。我们以前证明了MR1数量的增加。+兔6-沉默细胞内小泡;6-fp处理后,MR1在细胞表面的易位不受影响。21。本研究利用构成性高表达MR1的细胞,难以确定Rab6沉默是如何特异地影响MR1在不同细胞间的表达和功能的。此外,虽然elispot试验中的mait细胞反应清楚地表明mr1分子负载mtb配体到达beas-2B细胞表面,但mr1在mtb感染过程中的细胞定位和表面易位没有明显变化,与其他mtb感染的结果一致。22。相对于已经确定的外加配体的加载机制,如6-fp和5-op-ru。22,这对识别细胞内感染过程中产生的细菌配体的负载机制提出了挑战。为了解决这些问题,我们构建了一个具有诱导MR1表达的细胞系。使用先前描述的构造25在多西环素(Doxy)诱导启动子后,稳定表达MR1与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达。与瞬时转染和诱导doxyMR1-gfp构建一致25在培养基中加入多羟基可导致MR1-GFP在ER和内胚层的表达,并在加入6-FP后使MR1在细胞表面易位(如图6所示)。1a)。此外,mit细胞对DOxy处理的Beas-2B:doxyMR1-gfp细胞的反应垢分枝杆菌上清液比Beas-2B:doxyMR1-GFP细胞增加(表达野生型MR1水平)。1(B),证实了所构建的多氧诱导MR1-GFP结构具有抗原提呈和激活MAIT细胞的能力。这些结果表明Beas-2B:doxMR1-GFP细胞中的MR1与内源性和构成性过度表达的MR1相似。

图1
figure1

在稳定转导的Beas-2B细胞中,在诱导启动子后表达的MR1具有功能。(ABeas-2B:DoxyMR1-GFP细胞经羟氧处理24h后,用100 uM6-FP孵育16h。顶部:荧光显微镜观察MR1在活细胞中的定位。底部:采用流式细胞仪观察6-FP(+6-FP)或Iso处理后的MR1在细胞表面的稳定性,用26.5抗MR1抗体(MR1)观察MR1在细胞表面的稳定性。(B)Beas-2B:doxymr 1-gfp细胞,用含0.625-10 ul的elispot法孵育。[医]巨细胞瘤上清液和MAIT细胞克隆D426G11。用IFN-γ斑点形成单位(SFU)检测MAIT细胞反应.实验结果代表了至少三个独立的实验。

RT-PCR分析MR1在添加和随后去除氧基后进行基因表达,测定MR1在这些细胞中过表达的动力学。增加MR1在添加剂量后的16-24小时表达达到高峰,并至少在24小时内保持在这个水平上(如图所示)。2A,左)。通过洗涤细胞和更换介质来去除羟,减少了MR1基因表达,在洗后16-24小时恢复到接近前的水平(如图所示)。2(A,右)。流式细胞仪和荧光显微镜分析显示MR1-GFP蛋白表达的动力学。流式细胞术显示细胞MR1-GFP总蛋白表达在洗除DOxy后24h明显下降(如图所示)。2(B),反映RT-PCR结果.

图2
figure2

用诱导启动子表达MR1的动力学。(ABeas-2B:doxyMR1-GFP细胞在提取RNA和RT-PCR之前,先用Doxy处理一次。左面板表示MR1记录在无Doxy控制下,当Doxy未被从井中移除时。右边的面板表示MR1从井中清除和清洗羟后24小时的转录本。每一行都是一个有代表性的独立实验。(B)流式细胞仪检测Beas-2B:DoxyMR1-GFP细胞在洗涤和孵育前24h内MR1-GFP蛋白的表达。(C用荧光显微镜观察MR1-GFP蛋白的表达情况,分别加入羟基24小时、6FP 16 h后,再从水井中去除并洗涤12和24 h后,观察MR1-GFP蛋白的表达情况。D)图片来自(C)用Imaris进行分析,以量化(左)MR1的数目。+每个细胞的内小体间隔和(右)每个MR1的平均荧光强度+隔间。对于B-D,所示的结果至少代表了三个独立的实验.*表示p值<0.001。(E)示意图显示MR1-GFP诱导、羟自由基洗涤、6-FP的加入和Rab6siRNA转染的时间.

Beas-2B:doxyMR1-GFP细胞经DOXY处理后,与图中的RNA表达实验平行。2A测定MR1的细胞内定位(图1)。2C,TOP),在某些情况下用6-FP治疗以确定MR1的表面易位(图1)。2(c,底部)。图像分析采用Imaris对GFP内小室进行量化。加药后早期(8h),MR1主要定位于ER。在处理后24h,MR1出现在ER后内质体区(p=0.001),在ER中停留的程度较小(见图)。2(c,D,顶部,24小时)。类似于图中的结果。2B,mr1-gfp信号从细胞中洗出12和24 h(36和48 h,p<0.001),而mr1较低。+细胞内小体间隔(36和48h,p<0.001,p=0.006)。在6-fp处理的细胞中,在所有三个时间点细胞表面均观察到mr1,而mr1的总数量变化不大。+每个细胞的内小体间隔(图)。2C底部,D)。先前的证据表明,6-fp可以保护mr1不被降解。25,这可能解释了6-FP处理的细胞在洗涤doxy后12h内MR1荧光的增加(图1)。2C,D,36h,p<0.001)。相比之下,MR1的数量和亮度+未经6-FP处理的细胞在加入羟基后24h达到内小体区的峰值。这种模式有多种可能性,但观察证实,在我们的细胞中,MR1在初次合成后,在不添加外源配体的情况下,从ER转移到内小体样的细胞间隔。在6-FP驱动的表面易位和随后的配体去除后,MR1能够被循环到多个细胞区域,包括ER和内小体区。

综上所述,这些数据证实Beas-2B:doxyMR1-GFP细胞可以在“新合成”和“已有”MR1的背景下分析Rab6对MR1表面易位的影响(图1)。2e)。具体来说,通过在培养基中添加羟基之前操纵Rab6的表达或功能,我们可以分析Rab6对新近合成的,主要是ER定位的MR1的影响(图1)。2E,左)。此外,通过在特定的时间点操纵Rab6的表达或功能,我们可以分析Rab6对存在于细胞内小室的MR1和细胞表面的影响(如图6所示)。2E,右)。Beas-2B:doxyMR1-gfp细胞所提供的时间控制是探索Rab6是否在抗原结合MR1从ER转移到细胞表面(新合成的时机)或抗原结合MR1在内质体间隔与细胞表面之间的循环(预先存在的时间)中发挥作用的关键。

Rab6调控MR1的总表达和表面表达

用流式细胞术检测兔6-沉默Beas-2B:doxyMR1-GFP细胞中MR1的表达。2E.在不加外源配体的情况下,在诱导MR1表达前(即“新合成的”MR1)细胞中,GFP信号测定的MR1总量和α-MR1 26.5抗体表面染色测得的表面MR1均无差异(图1)。3a)。在表达MR1的细胞中,Rab 6沉默细胞的MR1总量在稳态状态下有所增加(图6所示)。3b)。虽然这种增加没有统计学意义,但在表达新合成的MR1的细胞中是不可重复的。此外,它与我们以前使用的具有mr1本构式过表达的系统的结果是一致的。21。表达MR1的Rab6沉默细胞没有相应的表面MR1表达增加(如图6所示)。3A、B)。由于Rab6沉默不影响新合成的MR1在细胞表面的表达或易位,我们推测Rab6沉默所引起的变化影响了先前存在的MR1。

图3
figure3

Rab6沉默对MR1的表达和表面易位有影响。(ABeas-2B:用Rab6或错义控制siRNA(Mis)siRNA、doxy和6-FP对doxyMR1-GFP细胞进行处理,并按图所示的“新合成的MR1”方案进行研究。2E.活细胞进行表面MR1染色,然后立即进行流式细胞术(GFP)和表面MR1(26.5)MR1分析。用RT-PCR方法验证了Rab6的沉默效率。拉布6表达)。(BBeas-2B:用Rab6或错义控制siRNA(Mis)siRNA、doxy和6-FP处理doxyMR1-GFP细胞。2按A.描述的方法对细胞进行染色和分析。结果表明,每种条件的相对荧光的几何均值和标准差都是由4个独立实验得出的。

接下来,我们将研究Rab6沉默是否会影响体外添加配体6-FP的MR1的总表达和表面MR1的表达。首先,我们在诱导MR1前使Rab6沉默,并与6-FP共同孵育,观察沉默Rab6对新合成的MR1的影响。类似于我们以前在图中的观察。2C、D和in25与6-FP共同孵育的细胞MR1总量增加,表明6-FP能稳定MR1分子。3a)。在培养物中加入6-FP,能明显增加MR1在Rab6沉默细胞中的总表达和表面易位(图1)。3a)。这些数据表明,Rab6不调节新合成的MR1在6-FP环境下的负载或流出。接下来,我们在含有MR1的细胞中沉默Rab6,然后添加6-FP。与先前存在的稳态MR1状态相似的是,与6-FP孵育的细胞相比,Rab 6-沉默细胞中的MR1总量有较小但稳定的增加,而表面稳定的MR1则没有增加(图6所示)。3b)。综上所述,这些数据表明Rab6可能在MR1的贩运中发挥作用,而不是在细胞表面的易位水平上。此外,这些数据还提供了证据,证明像6-fp这样的胞外配体可以被装载到未被新合成的mr1上。25.

Rab6调节细胞表面的MR1循环

由于我们通过流式细胞术观察到MR1或表面MR1的变化很小,但在统计学上没有什么变化,所以我们接下来用荧光显微镜观察MR1在Rab6沉默细胞中的定位是否有任何变化。在表达新合成的或已有的MR1-GFP的细胞中,我们量化了含有MR1的内小体样区的数量和这些结构中MR1的相对数量。正如我们以前在细胞中所显示的那样,mr1-gfp表达过高。21,我们观察到MR1的数量增加了。+表达新合成的MR1的兔6沉默细胞内小体(图1)。4a)。有趣的是,每个内小体的MR1-GFP明显减少(p=0.003),而内胚层较小(p<0.001)。在6-FP背景下,对照细胞和Rab6沉默细胞之间存在相同的差异,但差异较小(图1)。4b)。这在未经6-FP培养的细胞中更为明显,因为细胞表面的易位不受外源抗原的影响。这些结果共同支持了以下假设:Rab6影响内质体MR1的贩运,而不是ER的MR1表面易位。

图4
figure4

Rab6沉默对MR1定位于内小体区有影响。新合成的Beas-2B:doxyMR1-GFP细胞A)或预先存在(BMR1实验时间如图所示。2用RT-PCR方法验证了Rab6的沉默效率。细胞存活和MR1的数目+采用Imaris定量方法测定各室内小室、MR1的平均相对荧光和室内体积。每个点表示单个单元格或mr1。+内小体室*表示p值<0.001。结果代表了至少三个独立的实验。

在表达先前存在的MR1的细胞中,MR1的数目+对照细胞和家兔6-沉默细胞的细胞内小体间隔在稳态或与6-FP孵育后无显着性差异(图6)。4b)。因此,我们检测了MR1-GFP荧光信号在这些区域的相对数量。在稳态和6FP治疗的背景下,我们观察到MR1-GFP信号在内部小室中的不同分布(图)。4(B)与Rab6沉默细胞相比,MR1-GFP信号在对照中的多模态分布证明了这一点。数据分布分析表明,在兔6-沉默细胞内,平均MR1-GFP信号较高(p<0.001),且MR1-GFP信号在不同条件下的分布差异有显着性(P<0.05)。为支持这一点,MR1的平均体积也显著减少。+兔6-沉默细胞内的内小体区,加入或不添加6-FP(图1)。4C,p<0.001)。这再次表明在Rab6-沉默细胞表面稳定后,MR1的再循环或MR1的内吞功能受到损害,因此MR1遵循不同的内小体贩运途径,导致不同的细胞内分布。

Rab6调节MR1分子向TGN的转运

为了进一步了解Rab6是如何介导MR1再循环的,我们在Beas-2B细胞中构建了野生型(WT)和突变型(Q72L)Rab6蛋白与RFP融合。Rab6-q72L突变体是gtp-锁定和结构活性的突变体。26。如预期的那样,Rab6-WT主要定位在高尔基体上,在那里它与Golgin-97、P230和GM 130共同定位。5,左)。Rab6-Q72L也定位于高尔基体附近的一个区域,但结构更加密集和紧密,与Golgin-97、P230和GM 130基本不同。5与Rab6-Q72L相比,Rab6-WT的结构改变反映在细胞Rab6的体积上(图6)。5,以及需要在不同的设置下获取图像,以达到类似的发射值,以避免反褶积和分析目的的饱和(Rab6-WT:100%传输,0.05-0.10s;Rab6-Q72L:32%传输,0.025-0.15s)。

图5

Rab6-Q72L改变了高尔基标记Golgin-97、P230和GM 130的细胞定位。转染Beas-2B细胞表达Rab6-WT或Rab6-Q72L与RFP(红色)融合。24 h后,细胞固定,用金-97、P230、GM 130(绿色)和DAPI(蓝色)抗体染色。用Imaris对Rab6结构的体积进行量化。对于白线所指示的区域,用ImageJ法测定线性平面上的荧光强度,以显示Rab6-WT和-Q72L相对于每一个高尔基体标记的不同定位。所显示的图像代表了至少三个独立实验中的至少60个细胞。

这些Rab6结构随后在Beas-2B:doxyMR1-GFP细胞中表达,表达新合成的或已存在的MR1。与图中的错误控制相比较。4A,B,Rab6-WT的表达对新合成的或预先存在的MR1的定位没有影响(图1)。6a,b)。一般来说,MR1与两个Rab6-RFP肿块的中心之间的距离有一个双峰分布,这可能说明MR1居住在不同的内部小室中。在6-FP处理的细胞中,新合成的MR1位于Rab6-Q72L质量中心的位置比Rab6-WT质量中心远(如图所示)。6A,p<0.001)。虽然没有显着性,但在稳态状态下也存在类似的模式,其中Rab6-Q72L细胞比Rab6-WT细胞有更多的远距离MR1细胞。综上所述,这些数据表明,本构性Rab6作用改变了新近合成的MR1在ER后内质内小室中的运输。在稳态条件下,MR1与Rab6-Q72L的距离比Rab6-Q72L大(p<0.001),而在外源配体处理的细胞中,MR1与Rab6-Q72L的差异不显著(P>0.05)。综上所述,这些数据表明Rab6在细胞表面的MR1的循环和逆行转运中起着作用,它通过细胞内小体通路到达跨高尔基网络。

图6
figure6

表达Rab6-Q72L的细胞内MR1的定位发生改变。Beas-2B:doxyMR1-GFP细胞转染RAB6-WT或Rab6-Q72L与RFP融合表达,同时转染Doxy和6-FP。对新合成的MR1-GFP,在诱导MR1-GFP表达前8h转染Rab6。对于先前合成的MR1,转染Rab6构建物后24h,从细胞中清洗出DOXY。用Imaris对细胞进行活体成像和分析,以量化每个MR1之间的距离(以m为单位)。+每个室的内小体室和Rab6-RFP的中心构成质量和MR1的平均相对荧光。*表示p值<0.001。结果代表了至少三个独立的实验。

讨论

MR1在MHCⅠ类分子和类I类分子中是独一无二的,尽管在RNA水平上普遍表达,但在感染前几乎没有MR1在细胞表面表达。这表明MR1的抗原处理和表达途径不同于其他I类分子。众所周知,6-fp等外加配体优先负载在rr 1上,然后转移到细胞表面。23。然而,与第一类和第二类一样,很可能有一种以上的途径可以装载配体。首先,来自细胞内病原体的配体有不同的途径,例如结核分枝杆菌(MTB)可以加载在MR1上。Mtb配体可以被载于ER-驻留的mr 1上,但它们也是通过不同的高尔基后通路(如Rab6和vamp 4等内小体贩运分子)来加载的。21。此外,mr 1以前装载了6-fp,并被转移到细胞表面,再循环到一个可以与其他外加配体交换的隔间中。25。有趣的是,从活的或固定的配体大肠杆菌也是通过不同的途径呈现的。24。这些数据共同支持了MR1可以使用多种途径来取样来自细胞外和细胞内环境的配体的概念。在这里,我们寻求更好地理解Rab6在定义MR1抗原呈递通路中的作用。分枝杆菌配体,以诱导型MR1表达和6-FP作为代配体.

我们曾证明,沉默Rab6后,WT Beas-2B细胞对MAIT细胞的mtb配体表达减少,但在高表达mr1的细胞中加入6-fp后,mr1不影响mr1在细胞表面的易位,提示mtb配体可以通过与6 fp不同的途径加载和呈现。21。为了评估Rab6在转运新合成的MR1分子和先前存在的MR1分子中的作用,我们构建了一个在多西环素诱导启动子后面稳定表达MR1的细胞系。通过MR1的诱导表达,我们可以特别观察Rab6沉默对新合成的MR1分子的影响。虽然前后一致清除了羟基,但下降的水平在.MR1成绩单没有我们预期的那么快。从.消失之间的有限时间MR1转录本和可检测到的MR1-GFP蛋白的丢失表明,MR1通过内部小体循环途径迅速转运到表面,并最终降解。这种基因与蛋白表达的关系给分析Rab6基因敲除对MR1转运的影响带来了挑战。我们必须平衡实现Rab6沉默所需的时间和增加观察到的MR1存在而不是新形成的可能性所需的时间,同时保持在降解前检测剩余MR1蛋白的能力。因此,在某些情况下,Rab 6沉默细胞和对照细胞之间检测到显著差异的能力降低。尽管如此,因为我们能够将Rab6沉默对先前存在的MR1分子的影响与我们所知道的新合成的MR1分子进行比较,因此我们相信数据显示了Rab6沉默的生物相关性影响。

我们的数据最能支持Rab6从质膜向TGN逆行转运MR1的功能。在Rab6沉默细胞中观察到的表型可由该通路内的几种可能的Rab6功能来解释。第一,Rab6可能直接参与细胞表面的内吞,因此当Rab6被沉默时,MR1就会被困在细胞表面。由于我们没有观察到表面MR1的这种增加,我们的数据更好地支持了第二种可能性,即MR1从细胞表面被内吞,然后被分成多个离散的通路,其中一些是由Rab6介导的。从细胞表面内切而来的MR1可以进入途径,随后通过交换或不交换新配体而返回细胞表面,也可能进入溶酶体降解途径。我们的影像数据表明Rab6可能导致优先贩运到这些途径之一。在稳态状态下,结构活性Rab6-Q72L的表达会导致更多的先前存在的MR1可能居住在内小体区,但表面易位(经6-FP处理)消除了这一效应。对于新近合成的MR1细胞,只有经过6-FP处理后才能看到MR1从ER到表面的转运。这些发现共同提示Rab6在逆行转运表面或内质体MR1中起作用。在高表达mr1的Beas-2B细胞中,大部分细胞内mr1在表达晚期内质体和溶酶体标记的间隔中,如Rab7和LAMP 1。21。相反,在高表达MR1的C1R淋巴母细胞株中,除了晚期内含子标记外,还观察到一群MR1的早期内胚体标记,如EEA 1。22因此,在内胚层途径中,配体被装载的点可能是细胞类型依赖性的。在我们的模型中,Rab6的活性会引导MR1进入配体交换和再循环到细胞表面的途径。当Rab6被静音时,MR1将被定向到无法进行配体交换和再循环到细胞表面的隔间。还需要做更多的工作来确定在我们的Rab6沉默细胞中观察到的这些不同的内体细胞亚群的表型。这一模型表明,微生物衍生的MR1配体在细胞内吞作用早期,即在将细菌贩运到溶酶体以进行降解之前,被装载到MR1上。Mtb抑制吞噬体与溶酶体的融合,并在宿主细胞内继续具有代谢活性,这可能表明Mtb配体和MR1依赖的MAIT细胞反应的持续存在具有独特的重要性。

我们的数据和我们之前的工作21,25与MR1配体(包括6-FP和细菌感染产生的配体)交换的模式是一致的,其中有些是Rab6介导的。这与C1R淋巴母细胞的情况不同。22并提出了细胞特异性MR1的可能,以及从细胞外衍生的配体在细胞内感染过程中的负载途径。进一步探讨MR1配体在上皮细胞和专业抗原提呈细胞中的交换可能揭示MR1表达在这些细胞类型中的不同生理作用。在细菌感染过程中,这些不同途径在粘膜组织中的意义尚不清楚。此外,影响MR1内胚体再循环的通路的扰动也可能影响宿主细胞摄取的细菌的内化和贩运。沉默贩运分子如Rab6对MR1配体可用性的影响尚待探讨。MR1抗原表达的途径可能不是相互排斥的。来自不同细胞内和外源来源的配体可能优先,但不完全是通过这些途径呈现的。继续了解MR1配体的机制对于理解MAIT细胞的活化如何被调控以防止粘膜组织中不适当的炎症反应,以及更好地针对MAIT细胞进行治疗和疫苗接种至关重要。

方法

人类主体

这项研究是根据“赫尔辛基宣言”所表达的原则进行的。研究参与者、协议和同意书由俄勒冈州卫生和科学大学机构审查委员会(IRB00000186)批准。获得了所有捐赠者的书面和知情同意。人类参与者没有直接参与这项研究。健康成年人从俄勒冈州健康与科学大学的雇员中招募,如前所述,目的是获取人类血清2.

细胞和试剂

从美国型培养物(ATCC CRL-9609)中获得Beas-2B支气管上皮细胞,并在添加L-谷氨酰胺和10%热灭活胎牛血清的DMEM培养基(吉布科)中培养。MR1限制性T细胞克隆D426G11的生成和扩展如前所述。2,4,在添加L-谷氨酰胺和10%热灭活人血清的RPMI(吉布科)培养基中培养。垢分枝杆菌MC2155(ATCC)在7H9肉汤中培养。随着生长到后期,细菌被颗粒化,上清液通过0.22微米的过滤器,作为抗原在ELISPOT试验中使用。

α-MR1(26.5,与PE或APC结合,Biolegend),α-golgin-97(CDF 4,Invitrogen),α-GM 130(35/GM 130,BD生物科学),α-P230(15/P230,BD生物科学),α-小鼠IgG,α-兔IgG,α-链亲和素-Alexadin(生命技术)。多西环素(Sigma)悬浮于无菌水中,用量为2μg/mL。6-甲蝶呤(6-FP,Schirck‘s实验室)在0.01MNaOH中悬浮,终浓度为100μ。从新英格兰生物实验室获得了限制性内切酶(EcoRI和KpnI)和连接酶。

慢病毒的产生及稳定Beas-2B:doxMR1-GFP细胞系的构建

Bas-2B细胞在多西环素(Dox)诱导启动子(Beas-2B:doxMR1-gfp)下稳定表达mr 1与gfp融合。27。将低传代HEK 293 T细胞(ATCC CRS-3216)与包装质粒(psPAXs和pMD2.G)及脂质体3000(Invitrogen)构建的pDMLV2.1:doxMR 1共转染。PDMLV2.1:doxMR 1是从先前用于瞬时转染的pci:doxMR 1结构中亚克隆doxMR1-gfp盒生成的。25转化成pLenti6.2质粒。48小时后,去除培养基并通过0.45微米过滤器清除细胞碎片。滤液与等量的DMEM混合,含8μg/mL的聚丁烯(Sigma),用于野生型Beas-2B细胞的转化。细胞在2μg/mL的DOxy存在下培养4天,再用BD内流细胞分类器进行分类。细胞分选培养后,流式细胞仪和荧光显微镜检测MR1-GFP的诱导表达。

ELISPOT法

酶联免疫吸附试验(ELISPOT)按前面所述进行。28。简单地说,WT Beas-2B或Beas-2B:doxMR1-gfp细胞(每井5e3)被用作抗原提呈细胞,并与滴定法共同孵育。[医]巨细胞瘤在ELISPOT分析中作为抗原的上清液。用MAIT细胞克隆D426G11(每井5e3)产生干扰素-γ作为MAIT细胞激活的读出器。

SiRNA沉默

Beas-2B:doxMR1-GFP细胞在6孔组织培养板或1.5mm玻璃底室玻片中,70%汇合,用HiPerFect转染剂(Chiagen)转染5 NM siRNA(热Fisher科学)。细胞在使用和分析之前被培养了一定的时间。所有实验均以错义siRNA为对照,用RT-PCR方法验证基因沉默。

实时定量PCR

Rna的提取、cdna的合成和rt-PCR的研究如前所述。21,25应用TaqMan基因表达法检测Rab6(Hs01042278_M1)和GAPDH(Hs02758991_G1)(LifeTechnologies)的表达。所有反应一式三份。将表达数据归一化为GAPDH,用2确定相对Rab6表达水平。−ΔΔCT方法29.

MR1表面稳定试验

Beas-2B:doxMR1-GFP细胞在6孔或12孔组织培养板中被镀,并按指示用siRNA和doxy处理。细胞经100μM6-FP孵育16h后,在2%人血清、2%山羊血清和0.5%FBS存在下,用α-MR1-PE或-APC(26.5)染色40 min。细胞用贝克曼Coulter细胞屈肌进行清洗和分析。所有分析均采用FlowJo10(TreeStar)进行。

Rab6-RFP结构设计及转染

Rfp-Rab6 wt和突变体结构是使用pci asci结构生成的,前面对其他基因进行了描述。21。简单地说,从LifeTechnologies公司获得了rfp编码rfp的重复dna寡核苷酸,并通过ecoRI和kpni限制性位点连接到pci表达载体中,得到的质粒在有能力的条件下被扩展。大肠杆菌。单个克隆被选择并进一步扩展以验证质粒序列。将RFP-Rab6构建物转染Beas-2B细胞,用Amaxa细胞系Nucleofector Kit T(Lonza)和程序G-016在Lonza核2b上转染RFP-Rab6。流式细胞术和荧光显微镜观察转染效率。

荧光显微镜

将Beas-2B细胞接种于#1.5玻璃底箱玻片(NUNC)中,按规定用试剂处理。在37°C和5%CO的条件下获得活细胞图像。2。抗体染色:用4%多聚甲醛洗涤细胞,用0.05%皂甙渗透30 min后,再用4%多聚甲醛固定。使用CoolSNAP ES2 HQ(Nikon)的高分辨率广域CoreDV显微镜(应用精度)获取活细胞和固定细胞图像。图像以1024×1024格式在Z堆栈中拍摄,使用60×PLApoN目标(NA 1.42)。研究人员对细胞的治疗条件视而不见。对于MR1定位的固定细胞成像分析,采用DAPI染色法以无偏的方式选择细胞。在MR1定位的活细胞成像分析中,采用Rab6表达的方法,以无偏的方式选择细胞。利用10次迭代的光学传递函数(Softworx,应用精度),采用迭代算法对图像进行反卷积。


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297