用诱导启动子表达MR1的动力学研究
在支气管上皮细胞系Beas-2B中沉默Rab6可降低MAIT细胞对mtb感染的反应。21。我们以前证明了MR1数量的增加。+兔6-沉默细胞内小泡；6-fp处理后，MR1在细胞表面的易位不受影响。21。本研究利用构成性高表达MR1的细胞，难以确定Rab6沉默是如何特异地影响MR1在不同细胞间的表达和功能的。此外，虽然elispot试验中的mait细胞反应清楚地表明mr1分子负载mtb配体到达beas-2B细胞表面，但mr1在mtb感染过程中的细胞定位和表面易位没有明显变化，与其他mtb感染的结果一致。22。相对于已经确定的外加配体的加载机制，如6-fp和5-op-ru。22，这对识别细胞内感染过程中产生的细菌配体的负载机制提出了挑战。为了解决这些问题，我们构建了一个具有诱导MR1表达的细胞系。使用先前描述的构造25在多西环素(Doxy)诱导启动子后，稳定表达MR1与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达。与瞬时转染和诱导doxyMR1-gfp构建一致25在培养基中加入多羟基可导致MR1-GFP在ER和内胚层的表达，并在加入6-FP后使MR1在细胞表面易位(如图6所示)。1a)。此外，mit细胞对DOxy处理的Beas-2B：doxyMR1-gfp细胞的反应垢分枝杆菌上清液比Beas-2B：doxyMR1-GFP细胞增加(表达野生型MR1水平)。1(B)，证实了所构建的多氧诱导MR1-GFP结构具有抗原提呈和激活MAIT细胞的能力。这些结果表明Beas-2B：doxMR1-GFP细胞中的MR1与内源性和构成性过度表达的MR1相似。
图1在稳定转导的Beas-2B细胞中，在诱导启动子后表达的MR1具有功能。(ABeas-2B：DoxyMR1-GFP细胞经羟氧处理24h后，用100 uM6-FP孵育16h。顶部：荧光显微镜观察MR1在活细胞中的定位。底部：采用流式细胞仪观察6-FP(+6-FP)或Iso处理后的MR1在细胞表面的稳定性，用26.5抗MR1抗体(MR1)观察MR1在细胞表面的稳定性。(B)Beas-2B：doxymr 1-gfp细胞，用含0.625-10 ul的elispot法孵育。[医]巨细胞瘤上清液和MAIT细胞克隆D426G11。用IFN-γ斑点形成单位(SFU)检测MAIT细胞反应.实验结果代表了至少三个独立的实验。
RT-PCR分析MR1在添加和随后去除氧基后进行基因表达，测定MR1在这些细胞中过表达的动力学。增加MR1在添加剂量后的16-24小时表达达到高峰，并至少在24小时内保持在这个水平上(如图所示)。2A，左)。通过洗涤细胞和更换介质来去除羟，减少了MR1基因表达，在洗后16-24小时恢复到接近前的水平(如图所示)。2(A，右)。流式细胞仪和荧光显微镜分析显示MR1-GFP蛋白表达的动力学。流式细胞术显示细胞MR1-GFP总蛋白表达在洗除DOxy后24h明显下降(如图所示)。2(B)，反映RT-PCR结果.
图2用诱导启动子表达MR1的动力学。(ABeas-2B：doxyMR1-GFP细胞在提取RNA和RT-PCR之前，先用Doxy处理一次。左面板表示MR1记录在无Doxy控制下，当Doxy未被从井中移除时。右边的面板表示MR1从井中清除和清洗羟后24小时的转录本。每一行都是一个有代表性的独立实验。(B)流式细胞仪检测Beas-2B：DoxyMR1-GFP细胞在洗涤和孵育前24h内MR1-GFP蛋白的表达。(C用荧光显微镜观察MR1-GFP蛋白的表达情况，分别加入羟基24小时、6FP 16 h后，再从水井中去除并洗涤12和24 h后，观察MR1-GFP蛋白的表达情况。D)图片来自(C)用Imaris进行分析，以量化(左)MR1的数目。+每个细胞的内小体间隔和(右)每个MR1的平均荧光强度+隔间。对于B-D，所示的结果至少代表了三个独立的实验.*表示p值<0.001。(E)示意图显示MR1-GFP诱导、羟自由基洗涤、6-FP的加入和Rab6siRNA转染的时间.
Beas-2B：doxyMR1-GFP细胞经DOXY处理后，与图中的RNA表达实验平行。2A测定MR1的细胞内定位(图1)。2C，TOP)，在某些情况下用6-FP治疗以确定MR1的表面易位(图1)。2(c，底部)。图像分析采用Imaris对GFP内小室进行量化。加药后早期(8h)，MR1主要定位于ER。在处理后24h，MR1出现在ER后内质体区(p=0.001)，在ER中停留的程度较小(见图)。2(c，D，顶部，24小时)。类似于图中的结果。2B，mr1-gfp信号从细胞中洗出12和24 h(36和48 h，p<0.001)，而mr1较低。+细胞内小体间隔(36和48h，p<0.001，p=0.006)。在6-fp处理的细胞中，在所有三个时间点细胞表面均观察到mr1，而mr1的总数量变化不大。+每个细胞的内小体间隔(图)。2C底部，D)。先前的证据表明，6-fp可以保护mr1不被降解。25，这可能解释了6-FP处理的细胞在洗涤doxy后12h内MR1荧光的增加(图1)。2C，D，36h，p<0.001)。相比之下，MR1的数量和亮度+未经6-FP处理的细胞在加入羟基后24h达到内小体区的峰值。这种模式有多种可能性，但观察证实，在我们的细胞中，MR1在初次合成后，在不添加外源配体的情况下，从ER转移到内小体样的细胞间隔。在6-FP驱动的表面易位和随后的配体去除后，MR1能够被循环到多个细胞区域，包括ER和内小体区。
综上所述，这些数据证实Beas-2B：doxyMR1-GFP细胞可以在“新合成”和“已有”MR1的背景下分析Rab6对MR1表面易位的影响(图1)。2e)。具体来说，通过在培养基中添加羟基之前操纵Rab6的表达或功能，我们可以分析Rab6对新近合成的，主要是ER定位的MR1的影响(图1)。2E，左)。此外，通过在特定的时间点操纵Rab6的表达或功能，我们可以分析Rab6对存在于细胞内小室的MR1和细胞表面的影响(如图6所示)。2E，右)。Beas-2B：doxyMR1-gfp细胞所提供的时间控制是探索Rab6是否在抗原结合MR1从ER转移到细胞表面(新合成的时机)或抗原结合MR1在内质体间隔与细胞表面之间的循环(预先存在的时间)中发挥作用的关键。
Rab6调控MR1的总表达和表面表达
用流式细胞术检测兔6-沉默Beas-2B：doxyMR1-GFP细胞中MR1的表达。2E.在不加外源配体的情况下，在诱导MR1表达前(即“新合成的”MR1)细胞中，GFP信号测定的MR1总量和α-MR1 26.5抗体表面染色测得的表面MR1均无差异(图1)。3a)。在表达MR1的细胞中，Rab 6沉默细胞的MR1总量在稳态状态下有所增加(图6所示)。3b)。虽然这种增加没有统计学意义，但在表达新合成的MR1的细胞中是不可重复的。此外，它与我们以前使用的具有mr1本构式过表达的系统的结果是一致的。21。表达MR1的Rab6沉默细胞没有相应的表面MR1表达增加(如图6所示)。3A、B)。由于Rab6沉默不影响新合成的MR1在细胞表面的表达或易位，我们推测Rab6沉默所引起的变化影响了先前存在的MR1。
图3Rab6沉默对MR1的表达和表面易位有影响。(ABeas-2B：用Rab6或错义控制siRNA(Mis)siRNA、doxy和6-FP对doxyMR1-GFP细胞进行处理，并按图所示的“新合成的MR1”方案进行研究。2E.活细胞进行表面MR1染色，然后立即进行流式细胞术(GFP)和表面MR1(26.5)MR1分析。用RT-PCR方法验证了Rab6的沉默效率。拉布6表达)。(BBeas-2B：用Rab6或错义控制siRNA(Mis)siRNA、doxy和6-FP处理doxyMR1-GFP细胞。2按A.描述的方法对细胞进行染色和分析。结果表明，每种条件的相对荧光的几何均值和标准差都是由4个独立实验得出的。
接下来，我们将研究Rab6沉默是否会影响体外添加配体6-FP的MR1的总表达和表面MR1的表达。首先，我们在诱导MR1前使Rab6沉默，并与6-FP共同孵育，观察沉默Rab6对新合成的MR1的影响。类似于我们以前在图中的观察。2C、D和in25与6-FP共同孵育的细胞MR1总量增加，表明6-FP能稳定MR1分子。3a)。在培养物中加入6-FP，能明显增加MR1在Rab6沉默细胞中的总表达和表面易位(图1)。3a)。这些数据表明，Rab6不调节新合成的MR1在6-FP环境下的负载或流出。接下来，我们在含有MR1的细胞中沉默Rab6，然后添加6-FP。与先前存在的稳态MR1状态相似的是，与6-FP孵育的细胞相比，Rab 6-沉默细胞中的MR1总量有较小但稳定的增加，而表面稳定的MR1则没有增加(图6所示)。3b)。综上所述，这些数据表明Rab6可能在MR1的贩运中发挥作用，而不是在细胞表面的易位水平上。此外，这些数据还提供了证据，证明像6-fp这样的胞外配体可以被装载到未被新合成的mr1上。25.
Rab6调节细胞表面的MR1循环
由于我们通过流式细胞术观察到MR1或表面MR1的变化很小，但在统计学上没有什么变化，所以我们接下来用荧光显微镜观察MR1在Rab6沉默细胞中的定位是否有任何变化。在表达新合成的或已有的MR1-GFP的细胞中，我们量化了含有MR1的内小体样区的数量和这些结构中MR1的相对数量。正如我们以前在细胞中所显示的那样，mr1-gfp表达过高。21，我们观察到MR1的数量增加了。+表达新合成的MR1的兔6沉默细胞内小体(图1)。4a)。有趣的是，每个内小体的MR1-GFP明显减少(p=0.003)，而内胚层较小(p<0.001)。在6-FP背景下，对照细胞和Rab6沉默细胞之间存在相同的差异，但差异较小(图1)。4b)。这在未经6-FP培养的细胞中更为明显，因为细胞表面的易位不受外源抗原的影响。这些结果共同支持了以下假设：Rab6影响内质体MR1的贩运，而不是ER的MR1表面易位。
图4Rab6沉默对MR1定位于内小体区有影响。新合成的Beas-2B：doxyMR1-GFP细胞A)或预先存在(BMR1实验时间如图所示。2用RT-PCR方法验证了Rab6的沉默效率。细胞存活和MR1的数目+采用Imaris定量方法测定各室内小室、MR1的平均相对荧光和室内体积。每个点表示单个单元格或mr1。+内小体室*表示p值<0.001。结果代表了至少三个独立的实验。
在表达先前存在的MR1的细胞中，MR1的数目+对照细胞和家兔6-沉默细胞的细胞内小体间隔在稳态或与6-FP孵育后无显着性差异(图6)。4b)。因此，我们检测了MR1-GFP荧光信号在这些区域的相对数量。在稳态和6FP治疗的背景下，我们观察到MR1-GFP信号在内部小室中的不同分布(图)。4(B)与Rab6沉默细胞相比，MR1-GFP信号在对照中的多模态分布证明了这一点。数据分布分析表明，在兔6-沉默细胞内，平均MR1-GFP信号较高(p<0.001)，且MR1-GFP信号在不同条件下的分布差异有显着性(P<0.05)。为支持这一点，MR1的平均体积也显著减少。+兔6-沉默细胞内的内小体区，加入或不添加6-FP(图1)。4C，p<0.001)。这再次表明在Rab6-沉默细胞表面稳定后，MR1的再循环或MR1的内吞功能受到损害，因此MR1遵循不同的内小体贩运途径，导致不同的细胞内分布。
Rab6调节MR1分子向TGN的转运
为了进一步了解Rab6是如何介导MR1再循环的，我们在Beas-2B细胞中构建了野生型(WT)和突变型(Q72L)Rab6蛋白与RFP融合。Rab6-q72L突变体是gtp-锁定和结构活性的突变体。26。如预期的那样，Rab6-WT主要定位在高尔基体上，在那里它与Golgin-97、P230和GM 130共同定位。5，左)。Rab6-Q72L也定位于高尔基体附近的一个区域，但结构更加密集和紧密，与Golgin-97、P230和GM 130基本不同。5与Rab6-Q72L相比，Rab6-WT的结构改变反映在细胞Rab6的体积上(图6)。5，以及需要在不同的设置下获取图像，以达到类似的发射值，以避免反褶积和分析目的的饱和(Rab6-WT：100%传输，0.05-0.10s；Rab6-Q72L：32%传输，0.025-0.15s)。
图5Rab6-Q72L改变了高尔基标记Golgin-97、P230和GM 130的细胞定位。转染Beas-2B细胞表达Rab6-WT或Rab6-Q72L与RFP(红色)融合。24 h后，细胞固定，用金-97、P230、GM 130(绿色)和DAPI(蓝色)抗体染色。用Imaris对Rab6结构的体积进行量化。对于白线所指示的区域，用ImageJ法测定线性平面上的荧光强度，以显示Rab6-WT和-Q72L相对于每一个高尔基体标记的不同定位。所显示的图像代表了至少三个独立实验中的至少60个细胞。
这些Rab6结构随后在Beas-2B：doxyMR1-GFP细胞中表达，表达新合成的或已存在的MR1。与图中的错误控制相比较。4A，B，Rab6-WT的表达对新合成的或预先存在的MR1的定位没有影响(图1)。6a，b)。一般来说，MR1与两个Rab6-RFP肿块的中心之间的距离有一个双峰分布，这可能说明MR1居住在不同的内部小室中。在6-FP处理的细胞中，新合成的MR1位于Rab6-Q72L质量中心的位置比Rab6-WT质量中心远(如图所示)。6A，p<0.001)。虽然没有显着性，但在稳态状态下也存在类似的模式，其中Rab6-Q72L细胞比Rab6-WT细胞有更多的远距离MR1细胞。综上所述，这些数据表明，本构性Rab6作用改变了新近合成的MR1在ER后内质内小室中的运输。在稳态条件下，MR1与Rab6-Q72L的距离比Rab6-Q72L大(p<0.001)，而在外源配体处理的细胞中，MR1与Rab6-Q72L的差异不显著(P>0.05)。综上所述，这些数据表明Rab6在细胞表面的MR1的循环和逆行转运中起着作用，它通过细胞内小体通路到达跨高尔基网络。
图6表达Rab6-Q72L的细胞内MR1的定位发生改变。Beas-2B：doxyMR1-GFP细胞转染RAB6-WT或Rab6-Q72L与RFP融合表达，同时转染Doxy和6-FP。对新合成的MR1-GFP，在诱导MR1-GFP表达前8h转染Rab6。对于先前合成的MR1，转染Rab6构建物后24h，从细胞中清洗出DOXY。用Imaris对细胞进行活体成像和分析，以量化每个MR1之间的距离(以m为单位)。+每个室的内小体室和Rab6-RFP的中心构成质量和MR1的平均相对荧光。*表示p值<0.001。结果代表了至少三个独立的实验。
