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体外转录抗原受体mRNA纳米载体在体内循环T细胞中的瞬时表达

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发表时间:2020-11-30 09:10作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

工程嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(Tcr)有助于建立疾病特异性T细胞进行靶向治疗,但在体内制造工程T细胞的成本和严谨性可能是抑制性的,因此在体内规划T细胞可能是一种可行的选择。在这里,我们报告了一种可注射的纳米载体,它提供体外转录(IVT)CAR或TCRmRNA,用于对循环T细胞进行瞬时重新编程,以识别与疾病相关的抗原。在小鼠白血病、前列腺癌和乙型肝炎诱导的肝细胞癌模型中,重复输注这些聚合物纳米载体可诱导足够的宿主T细胞表达肿瘤特异性CAR或病毒特异性TCRs,使疾病消退程度类似于体内外工程淋巴细胞的剂量。由于这些纳米载体及其相关平台易于制造、分销和管理,它们可以成为治疗多种疾病的良药。

导言

过继性T细胞疗法是一种强大的治疗方式,从病人或供体中提取的T细胞被基因改造成针对癌症或感染性药物,其疗效得到了许多临床试验的支持,这些试验显示了令人印象深刻的结果。1,2,3,4。然而,制造针对每个病人的定制T细胞产品的复杂性和高成本,而不是以标准化的形式批量制备一种药物,使得很难与一线治疗方案(如小分子药物或单克隆抗体)竞争。5。目前,大多数car-T和tcr工程T细胞都是通过一个繁琐的过程制造的,包括:(I)白细胞清除术,从两根静脉导管连接的病人身上提取T细胞,持续几个小时。6。这对患者来说是不舒服的,会产生大量的金钱成本,最终可能会限制大量采用自体T细胞;(Ii)T细胞的激活和转导;(Iii)在细胞因子补充的组织培养基中,在大约两周的时间内,将转导的T细胞扩展;(Iv)在给药前清洗和浓缩T细胞。对于在中央设施生产并运输到远程治疗中心的T细胞产品,必须对电池进行冷冻保存;(V)每批CAR-T产品都需要质量控制释放试验。整个过程必须在环境控制的GMP条件下进行,维护和运行成本很高。由于每一种汽车-T产品都是由接受治疗的病人的起始材料(T细胞)制成的,因此没有规模经济。7.

体外转录(IVT)mrna是一种具有破坏性的新药,可以直接编码体内感兴趣的治疗相关蛋白。8,9。合成的mrna分子可以快速设计和操作,并能相对成本效益地大规模生产。10。在过去的几十年里,科学家们已经学会了如何从药物和免疫的角度优化mrna,使其更像药物一样应用于临床。11,12,13,14.

在这里,我们探索作为一种注射药物,通过基因重组循环T淋巴细胞来瞬时表达疾病特异性受体,从而绕过从患者身上提取和培养淋巴细胞的需要(图一)。1)。为了保护治疗有效载荷,并将其精确定位于T细胞,我们研制了可生物降解高分子纳米载体。我们首次证明,单粒纳米粒子的应用可常规转染培养的T细胞>70%,转染CD 19特异性的1928 z car(fda-批准用于治疗B细胞淋巴瘤)。15或具有HBcore18-27 TCR特异性的乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(目前处于治疗乙肝相关肝细胞癌患者的一期研究中;ClinicalTrials.gov标识符:NCT 03634683)。转染纳米粒子的T细胞在其表面瞬时表达这些汽车转基因或TCR转基因,平均持续7天。利用原位异种移植小鼠的淋巴瘤、前列腺癌和乙肝病毒诱导的肝癌模型,我们证明,与传统的过继转移的T细胞相比,CAR编码或tcR编码的mrna粒子可以对循环T细胞进行基因再编程,产生与传统过继转移的T细胞相似的抗肿瘤反应。

图1:图示说明我们如何利用聚合物纳米颗粒携带的IVT mRNA在原位重新编程T细胞来表达疾病特异性CARS或TCRs。

这些粒子被配体包裹,这些配体以细胞毒性T细胞为靶标,因此一旦它们被注入患者的循环中,它们就可以将携带的转基因基因转移到淋巴细胞中,并瞬时编程使细胞在其表面表达疾病特异性的CARS或TCRs。

目前,通过基因转移将CARS或TCRs插入淋巴细胞的过程发生在患者身体以外的专用制造套件中,但无论是进出洁净室的过程还是基因转移过程本身,都是劳动强度大、成本高、耗费宝贵时间的。如果工程T细胞疗法能够扩展到各种癌症类型的不同人群,经济和制造业的挑战可能会增加。

我们证明,mrna纳米小地毯可以获得有效的、无副作用的细胞治疗的力量,并能方便地使用一种现成的药物。就像传统药物一样,使用这种新的治疗方式,患者可以在必要的医疗条件下很容易地重新服用。

结果

用car或tcr基因转染T细胞的mrna纳米载体

为了将编码疾病特异性受体基因的IVT mRNA导入人淋巴细胞,我们使用了一种可生物降解的聚氨基酯(PBAE)聚合物作为载体基质。2A)。我们在研究中使用的PBAE-447聚合物将mRNA浓缩成纳米颗粒,最初是在约翰霍普金斯大学的约旦绿色实验室开发的。16。在过去的十年里,他的小组和其他人广泛地描述了PBAE的关键特性。17。PBAES通过在较低的pH值下进行内小体室的质子化,从而使内小体逃逸成为可能,从而导致渗透压的增加,从而产生缓冲,从而导致内小体破坏。用于核酸传递的PBAES的高通量组合文库筛选表明,叔胺的存在提高了低pH条件下的缓冲能力,并促进了内小体的逃逸。PBAES骨架结构中的酯键在水相条件下发生水解,使PBAEs的毒性比PEI等其它不可降解阳离子聚合物的毒性要小,PEI作为一种核酸载体得到了广泛的研究。阳离子PBAE自组装成与阴离子核酸的纳米配合物,通过静电相互作用(图1)。2B)。将一种抗CD8抗体与聚酰胺酸(PGA)偶联,形成电吸附在颗粒上的共轭物,使颗粒具有细胞靶向作用。由此产生的mRNA纳米载体可以冻干长期储存。在使用前,颗粒在加入无菌水后几秒钟内就会水合物,以恢复原来的浓度。我们使用粒子追踪分析(NanoSight NS 300,MalvinPANalytical)对10批独立生产的粒子进行了表征(图1)。2C)。发现PbAE/PGA-抗CD8纳米粒子的平均粒径为106.9±7.2nm.ζ电位为4±2,用QubitRNA HS试剂盒测定其包封率为90.9±6.2%。

图2:淋巴细胞编程纳米粒子的设计与制造。

a我们实验中使用的T细胞靶向IVTmRNA纳米载体的原理图。为了制造一种试剂,可以简单地通过接触来改变原始T淋巴细胞(这些T淋巴细胞对非病毒转染方法不耐受性),我们用四种功能成分组成了生物工程聚合物纳米粒子:(i)表面锚定的靶向配体,选择性地将纳米粒子与T细胞结合,并启动快速的受体诱导的内吞作用,将其内化。在我们的实验中,我们使用了抗CD8抗体;)一种带负电荷的涂层,它通过减少纳米粒子的表面电荷,使非目标结合最小化。由于它在药物传递平台上已经得到了广泛的应用,我们选择了聚谷氨酸(PGA)来实现这一目的。三、)一种载体基质,它在核酸处于内小体时凝结并保护其不被酶降解,但当粒子被运入细胞质时释放它们,从而使编码的蛋白质得以翻译。为此,我们使用了一种可生物降解的聚(β-氨基酯)聚合物配方,在水相条件下半衰期为1~7h;四、四)核酸(IVTmRNA),包裹在载体内,产生疾病特异性CAR或TCR的瞬时表达。b描述我们如何制造纳米粒子的图表。c尺寸分布,用纳米Sight NS 300仪器测量。顶部显示平均直径±SD、ζ电位和包封±SD。N=3个独立制造的纳米粒子批次。

我们首先确定了在人淋巴细胞培养中加入靶向IVTmRNA纳米载体是否能有效地转染细胞。为了在临床相关系统中测试我们的技术,我们装载了编码白血病特异性1928 zCAR的IVTmRNA的纳米粒。3A-E)。CD 19靶向受体是当今研究最多的car-T细胞产品,目前国际上正在进行近30项临床试验,3项已获fda批准的癌症治疗方案。18,19。作为第二个例子,我们交付了编码高亲和力乙肝特异性TCR的IVTmRNA(如图所示)。3F-j)。T细胞治疗慢性乙型肝炎是一种恢复抗病毒免疫和治疗感染的新方法。乙型肝炎病毒核心抗原特异性HBcore 18-27 TCR是从HLA-A 02.01供者中分离出来的。20。对于1928 z CAR和HBcore18-27 TCR结构,我们首先采用实时定量PCR和流式细胞术检测其在人T细胞中的表达水平。我们发现转基因表达在纳米粒子暴露后24小时达到高峰,然后逐渐下降。3A,f)。值得注意的是,只有具有T细胞特异性(抗CD8或抗CD3)抗体功能化的纳米粒子才能有效地传递转基因,而同类型的控制功能纳米粒子则产生接近背景水平的基因表达(补充图)。1)。这转化为高水平的CAR或TCR表面表达,最大在第2天(75±11%的T细胞表达1928 z CAR,图)。3B,c平均89±4%的T细胞表达HBcore18-27TCR,如图所示。3G,h)。培养8d后,CAR受体表达率为28±6%,TCR受体表达率为26±9%。接下来,我们比较了纳米粒子转染的T细胞对这些受体用病毒方法构建的T细胞的杀伤和细胞因子产生的作用。为了证明对肿瘤抗原的特异性,我们包括与肿瘤无关的car基因转导的T细胞对照组(p28z,针对前列腺特异性膜抗原)。21),或tcr基因(msln-tcr,专门用于间皮素)。22)。采用实时孵育活细胞试验,我们不能测量转染IVT mRNA的T细胞选择性裂解抗原阳性靶细胞的能力(1928 z CAR的Raji淋巴瘤细胞和HBcore18-27 TCR稳定转染HBcAg的HepG 2肝癌细胞)的能力。3D,我)。此外,同样水平的T细胞分泌效应细胞因子在纳米粒转染与病毒转导的T细胞(图一)。3E,j).

图3:IVTmRNA纳米载体通过CAR或TCR基因转染人T细胞。

用包被TCR/CD3抗体和共刺激CD 28受体的珠子刺激分离的人CD8+T细胞。24小时后,珠子被移除,CD8靶向纳米粒子(Nps)含有编码白血病特异性1928 z car的mRNA。ae)或HBcore18-27 TCR(fj)加入细胞悬液中,浓度为3g mrna/10。6细胞。a1928 z CAR NPs作用于T细胞后相对1928 z CAR mRNA表达的qPCR测定。图为平均值±SD。N=9个生物独立样本。b用带有1928 z CAR编码mRNA的NPs孵育后,在所指示的时间点对T细胞进行流式细胞术检测。c体外基因转移效率概述。图为平均值±SD。N=9个生物独立样本。d比较纳米粒转染与逆转录病毒转染T细胞对Raji淋巴瘤细胞的体外杀伤作用。T细胞与Raji肿瘤细胞按5:1比例共培养。我们使用IncuCyte活细胞分析系统对1928 z-CAR或对照组(P28z-Car)转染的T细胞的免疫细胞杀伤进行了定量研究。数据是两个独立实验的代表。每个点代表平均±S.E.M。从两项独立实验中汇集而成,一式三份。eELISA法检测转染细胞的IL-2(24h)、TNF-α和IFN-γ(48h)的分泌。所示为平均值±SD;两尾未配对学生的t-测试。N=9个生物独立样本。f定量PCR检测T细胞接触HBcore18-27 TCR NPs后相对HBcore18-27TCRmRNA的表达。图为平均值±SD。N=9个生物独立样本。g, h基因转移效率iHBcore18-27或对照(MSLN-)TCR转染T细胞对HepG 2核心核光红细胞的杀伤作用。T细胞与HepG 2肿瘤细胞按5:1比例共培养。N=9个生物独立样本。jELISA法测定转染细胞分泌的细胞因子。所示为平均值±SD;两尾未配对学生的t-测试。

纳米粒重组宿主T细胞识别白血病

接下来,我们研究了淋巴细胞靶向的IVTmRNA纳米粒子是否可以重新编程循环T细胞,数量大到足以导致肿瘤消退,其效果与传统方法相似。作为第一个体内试验系统,我们用1×10接种免疫缺陷NOD.Cg-Prkdccid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠,建立白血病模型。6CD 19+Raji细胞表达萤火虫荧光素酶。5天后,用10×10重组小鼠6CD3+人T细胞,每周6次输注编码1928 zCAR的纳米粒(50μg/剂量),产生白血病特异性或携带GFP基因的对照粒子(图1)。4A)。选择每周给药方案,根据IVTmRNA纳米颗粒在体内的体外表达动力学,显示相关受体表达达8d(图1)。3B,c)。为了比较纳米粒子输注与常规过继T细胞治疗的疗效,我们还对单剂量5×10的小鼠进行了治疗。6T细胞通过编码1928 z CAR的慢病毒载体进行体外转导。这一数量相当于目前临床研究中使用的更高剂量的CAR T细胞,在这些研究中,患者接受了多达1.2×10的治疗。7每公斤体重的CAR T细胞23。在另一种给药方案中,我们将慢病毒介导的CAR T细胞过继转移与系统注射载有控制GFP mRNA的纳米粒结合起来,以确定纳米粒子介导的转染是否会损害T细胞的抗肿瘤功能。对照组小鼠要么不接受治疗,要么注入未转导的人效应T细胞。用生物发光显像连续定量肿瘤生长,并监测其生存差异。我们发现,体外工程的1928 z CAR-T细胞过继转移可显著提高存活率。10只小鼠中有6只消除了肿瘤,其余的小鼠则显示肿瘤消退,平均32天生存率提高(图1)。4B,c)。传统的过继性T细胞治疗所获得的治疗效果类似于在体内将同样的CARS编程到淋巴细胞上的IVTmRNA纳米粒子治疗,10只小鼠中有7只实现了肿瘤根除,复发动物的存活率平均提高了37天(图一)。4C)。第一次给药后2天的流式细胞术显示,携带1928 z的纳米粒能有效地重新编程循环T细胞以识别白血病细胞(平均10%car)。+CD8中+±4.3%,图1。4D,e)。如mRNA传递系统所料,这些CARS的瞬时表达时间长达1周(0.8±0.4%CAR+CD8)。+第7天T细胞)。值得注意的是,重复剂量的纳米粒子与第一次注射同样有效,平均将10.7±3.6%的基因转移到宿主T细胞中(见图)。4E)。这表明,IVTmRNA虽然具有短暂性,但仍可作为实现宿主淋巴细胞持续原位CAR表达的平台。

图4:纳米粒子编程的CAR淋巴细胞可导致白血病消退,其疗效与过继性T细胞治疗相似.

a时间线和纳米粒(NP)给药方案。b萤火虫荧光素酶表达的Raji淋巴瘤细胞序贯生物显像。每组五只有代表性的老鼠(n=10)。c治疗后动物的生存,描述为Kaplan-Meier曲线。每组10只小鼠由三个独立实验组合而成。中位生存期。用对数秩检验对治疗组与对照组进行统计学分析;P < 0.05 was considered significant. d注射纳米粒前后外周血T细胞流式细胞术,转染编码1928 z CAR的IVT mRNA。这里显示的每个时间点的三个轮廓代表了两个独立的实验,每组10只老鼠。e反复输注1928 z CAR NPs后,汽车转染CD8+T细胞百分率的概述图。每一行代表一只动物。展示的是来自两个独立实验的十只动物。每个时间点的平均转染效率(±SD)在顶部。

全免疫应答宿主的治疗反应

为了研究单独靶向如何将纳米粒子相互作用限制在循环T细胞上,以及它如何影响它们的命运,我们使用了完全免疫能力强的爱14报告鼠。24。在这个转基因模型中,所有的细胞都含有一个氧氟沙星侧的停止盒,阻止一个由cacg启动子驱动的tdtomato蛋白的转录。只有成功转染编码cre重组酶(Cre)mRNA的细胞,才能切除氧氟沙星侧的停止盒,形成永久的tdtomato转录和随后强的、扩增的tdTomato表达。我们首先测定了携带CREmRNA的CD3靶向(或同类型对照功能化)纳米粒子在爱14小鼠体内的全器官荧光。非靶向颗粒介导的基因表达最高见于肝脏,而淋巴细胞靶向纳米载体诱导的基因转移主要发生在脾脏、淋巴结和胸腺(见图)。5A,b)。脾脏的详细流式细胞术分析(图1)。5C显示CD3靶向纳米粒优先转染T细胞(8.1±1.9%),不影响存活率(附图)。2)。其他CD 45+(免疫)亚型,如巨噬细胞(3.2±1.5%)、B细胞(1.1±0.9%)、中性粒细胞(0.3±0.2%)和树突状细胞(1.9±0.8%),dtTomato信号水平明显降低。

图5:免疫能力强的小鼠有效的T细胞靶向。

B6.Cg-GT(Rosa)26Sortm14(CAG-tdTomato)HZE/J(AI报告)小鼠,每天3次静脉注射15μgmRNA编码核定位信号(NLS)-CRE的纳米粒。纳米粒子是针对小鼠T细胞使用全长抗CD3 MuIgG2a,或IgG2a的同型对照。这两种抗体都被设计为LALAPG变体,以抑制FC受体的结合和补体的激活。最后一次注射后48小时,采集器官,用荧光IVIS成像法测定全器官dttomato荧光。用不同免疫细胞亚型的抗体标记脾脏和血液中的单细胞悬液,用流式细胞仪进行分析。a代表(N荧光IVIS成像显示dtTomato在器官中的表达。b各器官荧光信号的定量研究。每个符号表示一个被测量的器官。水平线表示平均值,误差条表示平均值的标准差。两组间荧光强度成对差异用两组尾不成对学生进行统计分析。t-测试。N=从两个独立实验中收集到的7个生物独立样本。c图示脾内免疫CD 45+dtTomato+细胞平均±SD%。检测巨噬细胞(CD 45+,CD11b+,MHCII+,CD11c−,Ly6C−/Low,Ly6G−),B细胞(CD 45+,B 220+),T细胞[CD4+T细胞(CD 45+,TCR-β链+,CD4+,CD8-),CD8+T细胞(CD 45+,TCR-β链+,CD4−,CD8+),中性粒细胞(CD 45+,CD11b+,CD11c−,Ly6G+),树突状细胞(CD 45+,CD11c+,CD11b−,MHCII+)。每个符号表示一个鼠标。水平线表示平均值,误差条表示平均值的标准差。两组间荧光强度成对差异用两组尾不成对学生进行统计分析。t-测试。N=7个生物独立样本。

在这些分布研究的基础上,我们接下来测试了我们测量到的纳米粒子定向T细胞的数量是否足以在完全免疫能力的宿主中减少已建立的癌症。为此,我们将表达荧光素酶的Eμ-ALL 01白血病细胞注入白化C57BL/6小鼠体内(用免疫活性小鼠模型建立B细胞急性淋巴细胞白血病模型)。25)并使用生物发光成像来量化治疗组间肿瘤进展的差异(如图所示)。6A)。小鼠要么接受CD3靶向纳米粒传递编码1928 zCAR基因的基因,要么接受GFP对照(补充方法)。第三组未接受治疗。我们发现,只有编码1928 z CAR的纳米载体的注入才能有效地控制白血病的进展(图一)。6B,c),与绿色荧光蛋白对照组相比,治疗三周后平均减少了26倍的肿瘤负担。

图6:免疫活性小鼠抗白血病反应。

a时间线和给药方案。b纳米粒子注射后E-ALL 01荧光素酶信号强度图。每条线代表一只动物,每个点代表它的整个动物光子计数。用两个未配对学生的尾尾检验统计差异t-测试。显示的是10只老鼠的数据,每种治疗条件从两个独立的实验中汇集而成。c白化C57BL/6小鼠系统注射萤火虫荧光素酶Eμ-ALL 01白血病细胞序列生物显像。每组五只有代表性的老鼠(n=10)。

实体瘤的治疗反应

为了证实该技术不仅适用于血液系统恶性肿瘤的治疗,也适用于实体肿瘤的治疗,我们接下来研究了纳米粒子将前列腺肿瘤特异性car基因导入循环宿主T细胞诱导小鼠前列腺肿瘤消退的能力。与白血病细胞不同的是,白血病细胞表达高水平的CD 19抗原,循环淋巴细胞可以很容易地获取,实体性恶性肿瘤是异质性和保护性的。26。这意味着一部分肿瘤细胞将逃避目标车的识别,并被免疫抑制防御所包围,从而使T细胞功能失调。事实上,共同作者彼得·纳尔逊博士使用了140例前列腺癌转移的全基因组/转录图谱来确定前列腺癌病变中三种关键细胞表面蛋白(前列腺特异性膜抗原(Psma)、前列腺干细胞抗原(Psca)和受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(Ror 1)在患者中的表达不均匀(图1)。7A)。为了重述人类疾病,我们进行了LNCaP C42前列腺癌细胞的原位移植,这些细胞表面蛋白的表达差异很大(如图所示)。7b),进入NSG小鼠前列腺背叶。7C)。为了用生物发光成像技术连续监测肿瘤负荷,用萤火虫荧光素酶(Fluc)对肿瘤细胞进行基因标记。在原位移植后,所有小鼠在三周内可重复发生病变(如图所示)。7C(右面板),用人10×10进行重组。6CD3+人T细胞,随机分为各治疗组或对照组。7D)。我们首先测定了系统注射10只荷瘤小鼠的疗效。6离体换能器+肿瘤抗原ROR 1特异性T细胞。我们发现,即使抗ROR 1 car-T细胞没有达到肿瘤清除率,接受治疗的小鼠的存活率也增加了一倍以上(69天,而非治疗对照组则为32天)。7D)。为了确定我们的“现成”纳米试剂是否能达到类似的治疗效果,我们每周系统地给小鼠注射rr 1转基因纳米粒(50μgmRNA/剂量;图1)。7E)。粒子诱导的CAR编程与未治疗的对照组相比,平均延长了40天的生存时间,这与传统的过继T细胞治疗所获得的生存效益相似(Δ平均生存期=3d,N.S.,P=0.23;图1。7D,f)。T细胞的适当定位和持续是抗实体肿瘤活性的先决条件,因此我们接下来评估了随着时间的推移,ROR 1 CAR-T细胞浸润到前列腺肿瘤中的频率。T细胞转移后4天、7天和11天的LNCaP C42前列腺肿瘤的流式细胞术显示,静脉输注T细胞进入肿瘤部位(平均892±295 car+T细胞/mg肿瘤组织),但不能生长(第4天至第11天只有1.04倍的整体扩张;7g,h)。此外,原位编程的CAR-T细胞能有效地浸润肿瘤(平均648±240 car+T细胞/mg肿瘤组织),并在下调受体之前维持高水平的CAR转基因(平均91±7 car+T细胞/mg肿瘤组织,图7)。7H)。同一天静脉注射增强剂ROR1-car编码mRNA纳米粒后,肿瘤病灶再次被重新编程的外周血T细胞浸润(平均1066±225个CAR+T细胞/mg肿瘤,第11天)。7H),它重新描述了我们在白血病研究中已经观察到的mrna纳米粒子诱导的T细胞重新编程的振荡动力学(见图)。4E).

图7:编码前列腺肿瘤特异性CARS的IVT-mRNA纳米载体可以提高已有疾病小鼠的存活率。

a140例前列腺癌转移灶PSCA、PSMA和ROR 1抗原表达热图显示抗原表达的多样性。b流式细胞仪的热图显示LNCaP C42前列腺癌细胞PSCA、PSMA和ROR 1表达的变异性。颜色表示在350个随机选择的细胞中的表达水平。c移植后3周,用体内生物发光成像技术观察LNCaP C42型前列腺肿瘤。右图为前列腺背叶内已建立的肿瘤的典型照片(白色箭头)。d萤火虫荧光素酶表达的LNCaP C 42前列腺癌细胞的序贯生物显像。每组四只有代表性的老鼠(n=8)。e时间线和纳米粒给药方案。f治疗后动物的生存,描述为Kaplan-Meier曲线。每组8只小鼠由三个独立实验组合而成。中位生存期。用对数秩检验对治疗组与对照组进行统计学分析;P < 0.05 was considered significant. N.s. nonsignificant. g多色流式细胞术治疗后11天恢复前列腺肿瘤细胞。通过CD 45阳性标记和受体中的c-myc标记,对过继转移或原位编程的ROR 1、CAR+T细胞进行鉴定。h治疗开始后第4天、第7天和第11天分离到肿瘤的ROR1-CAR+T细胞的绝对数量。活细胞总数(台盼蓝阴性)乘以RO1-car和CD 45阳性细胞的百分比。所示为平均值±SD;两尾未配对学生的t-测试。N=从两个独立实验中收集的8个生物独立样本。i流式细胞术检测CAR-T细胞治疗或ROR 1 4-1BBz CAR NP治疗后LNCaP C42前列腺肿瘤细胞ROR 1抗原的表达。从五个肿瘤中随机选出350个细胞。

为了确定过继转移的T细胞和注入mRNA的纳米载体不能完全清除疾病的原因,我们用流式细胞术对复发的前列腺肿瘤的抗原谱进行了表型分析。癌症中最常见的逃逸策略之一是减少靶抗原的表达,因为CARS会产生选择性的压力。27,28。这一现象在临床前和临床研究中都被认为是失败的原因之一,当时只有单一抗原的过继转移T细胞被用于治疗异质性肿瘤(如转移性前列腺癌)。29,30,31)。我们发现,与在不同水平上表达ROR 1肿瘤抗原的未治疗的LNCaP C42前列腺肿瘤相比,两组治疗组(过继转移的T细胞或纳米粒子程序T细胞)的靶向性肿瘤最终发展出ROR 1低/阴性免疫逃逸变异(图1)。7I).

乙型肝炎病毒特异性T细胞的原位编程

编码cars的IVT基因转移只能将T细胞靶向到位于细胞表面的抗原。32,因此许多细胞内的肿瘤抗原或病毒抗原是这些受体无法获得的。33。我们已经在体外证明,淋巴细胞靶向的IVTmRNA纳米粒子可以在HLA的背景下,用识别细胞内HBV核心抗原(HBcAg)的工程TCRs重新编程T细胞。3F-j)。鉴于全世界有3亿多人长期感染乙肝病毒,其中相当多的患者发展为肝硬化和肝癌。34,为每个病人定制T细胞产品显然是不可行的。作为应用IVTmRNA技术治疗肝癌的第一步,我们建立了HBV诱导的肝细胞癌(HCC)小鼠移植瘤模型。肝内注射HBcAg和荧光素酶稳定转染HepG 2细胞100万只。所有小鼠在7天内可重复发生多灶性病变。8A),此时它们与未受刺激的人10×10重新组合。6CD3+人HLA-A*02:01T细胞,每周两次输注编码HBcore18-27TCR的纳米粒(50μg/剂量),产生肝癌特异性或携带GFP基因的对照颗粒。第三组小鼠单次给药10×10。6CD3 T细胞(HLA-A*02:01)经逆转录病毒载体转染HBcore18-27 TCR,对照组小鼠未接受治疗。第二次纳米粒给药后第4天(第18天),用生物发光成像技术直接测定肝脏的肿瘤负荷,用HBVC18-27 MHC I 5聚体标记单细胞悬液,定量表达HBcore18-27 TCR-T细胞的百分比。我们发现纳米粒子注射有足够的HBcore抗原特异性T细胞来诱导疾病消退,并能达到与体内外工程淋巴细胞相似的治疗效果(分别是未治疗对照组的13倍和18.9倍),如图所示。8B,c)。解剖肝脏的流式细胞术证实,与原位编程纳米粒子相比,体外工程T细胞处理的动物体内HBcore18-27 TCR T细胞密度相等。8D,e).

图8:用负载tcr基因的纳米粒子原位编程乙肝病毒特异性T细胞。

a我们建立了HBV诱导的肝癌小鼠移植瘤模型.将稳定转染HBcAg和荧光素酶的HepG 2细胞移植到重组人T细胞的NSG小鼠肝内。植入后3周,通过体内生物发光成像观察HepG 2肿瘤,并将其分为纳米粒子(每周剂量50μgmrna,编码hbcore18-17tcr)或T细胞治疗(5×10)。6T细胞通过编码HBcore18-17 TCR(HBcore18-17TCR)的慢病毒载体在体内外转导。b, c治疗6周后肝细胞荧光信号定量。所示为平均值±SD;两尾未配对学生的t-测试。N=5个生物独立样本。d多色流式细胞术治疗后第18天开始从肝细胞中恢复。通过CD 45、CD8和MHC五聚体的阳性标记鉴定HBcore18-27 TCR+T细胞。绝对数字显示在e。活细胞总数(台盼蓝阴性)乘以HBcore18-27 TCR+、CD8+和CD 45+的百分率。图为平均值±SD。两组T细胞绝对数的配对差异用两组尾不成对学生进行统计分析t-测试。P < 0.05 was considered significant. N.s. nonsignificant. N=5个生物独立样本。

总之,我们的结果表明,反复输注T细胞靶向聚合物纳米载体可以将肿瘤特异性CARS或病毒特异性tcr基因导入足够数量的宿主T细胞,以类似于体内外工程淋巴细胞的剂量来诱导疾病消退。

T细胞编程纳米粒子具有生物相容性。

作为推进疾病特异性T细胞原位编程用于临床应用的第一步,我们与国家癌症研究所的纳米粒子特性实验室(Ncl)合作。Https://nanolab.cancer.gov/)。全身注射纳米药物有可能引起病人的输液反应,这是一种经常延迟或停止临床转化的不良反应。35。这些反应可以表现为发烧,寒战,僵硬,皮疹,胸部或背部疼痛,或呼吸困难,在罕见的情况下,他们可能是致命的。在药物开发过程的早期发现输液反应的风险,有助于在产品达到临床试验时减轻潜在的安全担忧,从而节省开发人员的时间和金钱,并帮助患者避免潜在的危险并发症。

我们使用NCL开发的AssayCascade协议,可以指示输注反应。具体来说,我们分析了纳米粒子对补体激活的影响(NCL法,ITA-5.2),其溶血性能(ITA-1),以及它们对T细胞氧化应激(ITA-32)的影响。为了研究纳米粒子在临床相关浓度中的作用,我们首先计算了理论血浆浓度(Tpc)。36,这是小鼠的有效剂量(在我们的实验中:50μgmRNA/剂量)与人体等效剂量(=2.03μgmRNA/mL血)的比例;见图。9A)。为了评估T细胞靶向mRNA纳米粒子对红细胞的影响,我们用分光光度法测定了不同浓度颗粒暴露后血红蛋白的释放,进行了溶血试验。溶血试验采用阴性对照组(PBS)和阳性对照组(Triton-X)。结果发现,TPC颗粒溶血率低于2%(平均1.21±0.26%,而PBS对照组为0.7±0.11%)。9B),它被定义为非溶血性的。37。纳米颗粒也没有诱导补体iC3b或BB的激活,而在tpc浓度下C4D略高于2倍测定阈值(平均2.3±0.13%,而pbs对照组为1±0.003%)。9C)。最后,我们测量了线粒体氧化应激作为纳米粒子所致损伤的一个关键决定因素,因为活性氧(Ros)的过量产生会对细胞细胞器和dna造成损害,最终导致细胞死亡。38。此外,过量的ros产生的另一个后果是激活细胞信号通路,刺激促炎细胞因子和纤维细胞因子的表达。39。我们发现T细胞编程纳米粒子只引起氧化应激的轻微增加(平均3.6±0.2倍),与pbs对照组相比(如图所示)。9d).

图9:可能的输注反应的体外分析。

a理论等离子体浓度的计算。bT细胞靶向mRNA纳米粒(NPs)的溶血活性研究。c酶免疫法定量测定补体活化。测定阈值(虚线)为PBS阴性对照的2倍变化。dNP转染后淋巴细胞线粒体氧化应激的研究。在这个数字的所有面板中,N=9份生物无关血样。也显示了平均值±SD。两组间成对差异用两组尾不成对学生进行分析t-测试。

在T细胞编程纳米粒子的体外评估的指导下,我们接下来对啮齿类动物进行了一次全面的毒性评估。大鼠是预测核酸分子疗法对人类健康毒性结果的首选啮齿动物,因为它的代谢生理学(特别是肾脏和肝脏功能)比老鼠的更接近人类。40,41,42。6周龄Sprague Dawley大鼠在体表面积正常化的基础上,注射一剂含100μg mrna的纳米粒,相当于50μg mrna在小鼠体内的作用。43。这些实验是在1928 z汽车纳米粒子的基础上进行的。1928 z Car识别人CD 19,但不与大鼠CD 19发生交叉反应,以确保我们测量的参数的变化可归因于纳米粒子,而不是它们的重新编程活动。对照组要么注射25 mm醋酸钠缓冲液(车辆控制),要么不注射。48 h后处死动物,取血测定临床生化指标,并进行完整的大体尸检。以下组织由董事会认证的病理学家评估:肺、肝、心脏、脑、肾、脾、骨髓和十二指肠。没有可归因于纳米药物治疗的组织学病变(图)。10A)。注意到的少数病变是轻微到轻微的,被认为是偶然的,与研究无关。5只大鼠中有2只肝内有少量炎性浸润。这些微小的浸润被认为是背景性病变,与治疗无关。同样,所有的组都包含了肾盂慢性炎症轻微到轻微的个体。病变的时间不符合急性治疗效果,因此被认为是偶然的。与对照组相比,纳米粒组动物血小板总数略低于对照组(分别为290.4±56.3K/μL和290.4±56.3K/μL);P=0.34,N.S.;图1。10b)。与对照组相比,纳米粒处理的动物也有轻度降血糖作用(分别为45.4±26 mg/dL和78.3±69.8 mg/dL;P=0.42,N.S.;图1)。10C)。纳米粒处理的大鼠血清化学值(包括肝功能和肾功能)均与对照组相当,表明未发生全身毒性。血清白细胞介素-6(IL-6)水平中度升高至平均16.5±5.9pg/mL。10d),根据上一次报告可以认为是安全的。44,45.

图10:纳米载体的注入与急性全身毒性无关。

雌性Sprague Dawley大鼠静脉注射编码1928 z CAR的CD8靶向IVT mRNA,48小时后由董事会认证的病理学家以盲的方式进行完整的组织病理学检查和血清化学分析。a代表不同器官的H&E染色切片,从对照组或纳米粒子处理的动物中分离出来。标尺,400米。b血液计数和c血清化学。dELISA法测定血清肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和IL-6细胞因子.在每个方框图上,中间标记表示中间值,框的底部和顶部边缘表示中间四分位数范围。胡须代表95%的置信区间。两尾未配对学生t-测试。N=5个生物独立动物/组由两个独立实验组合而成。

讨论

虽然CAR和TCR修饰的T细胞已经对少数几种血液癌症进行了转化,但很明显,它们目前的临床应用只是这项技术可能提供的各种可能性中的一小部分。理论上,恶性肿瘤和带有靶向抗原的慢性感染都可以用治疗性T细胞来治疗,如大量临床前报告所示。20,22,46,47,48,49。然而,目前在体外产生疾病特异性T细胞的方法是复杂的,不能支持大量患者群体的治疗,因为必须为每个病人产生一个新的淋巴细胞群。为了使患者更容易获得T细胞产品,该领域已转向异基因技术,以提供更好的规模和更低的成本。50,51,52。一些临床阶段的T细胞公司已经开始测试作为“现成”产品的汽车T细胞,这些产品来自健康的、无关的捐赠者,而不是病人。虽然这种方法允许治疗因患者淋巴细胞数量低或T细胞质量差而无法制造自体T细胞的癌症患者,但它需要几个额外的细胞工程步骤来防止供体细胞攻击宿主,并反过来防止患者自身的T细胞排斥所注入的产品。这通常是使用多重基因编辑来消除T细胞产品中的天然tcr和hla分子。53。但是,这些额外的操作增加了制造过程的复杂性、时间和费用,同时降低了细胞的产量和活力。54。为了避免排斥反应,接受普遍的CAR T细胞的患者首先通过消耗淋巴的化疗受到严重的免疫抑制,这需要时间,并使患者面临额外的毒性。因此,体内外工程异基因细胞产品不太可能显着地增加接受T细胞治疗的患者数量,特别是那些需要迅速干预才能保持内源性免疫系统完整的传染病患者。

我们的小组之前描述了一种可注射的基于dna的纳米试剂,它可以用白血病特异性car转基因来编程循环T细胞。55。为了克服质粒DNA固有的低基因转移,即必须进入细胞核转录成mRNA,我们装载了一个编码CAR的转座子/转座酶系统,该系统随机插入靶细胞基因组中。虽然这项研究提供了概念上的证据,证明使用可注射纳米试剂对CAR T细胞进行原位编程是可能的,但将这种DNA纳米药物转化到临床将面临以下原因的挑战:(I)不可预测的遗传毒性和表达动力学。这些纳米粒子稳定地将治疗性CAR基因整合到靶细胞中,导致多种细胞类型的基因组永久改变和不可预知的遗传毒性。此外,一旦将纳米粒子注入病人体内,医生就无法控制体内CAR表达的动力学;(Ii)每个纳米粒子的相关CAR基因拷贝数较低。我们可以加载到这些DNA纳米颗粒中的car基因的数量受到质粒骨架和启动子序列大小的限制,以及为了稳定整合而共同传递转座酶表达载体的要求。这在很大程度上限制了基因原位转移的效率,特别是当试图传递编码tcrα和β链的大转基因时;和(Iii)需要丰富的肿瘤抗原,才能将原位转染的CAR T细胞的数量扩大到治疗相关的数量。这个扩张期需要时间,对于快速进展的疾病或定义为实性肿瘤的患者来说,这是一个缺点。

在这里,我们探索使用IVTmRNA快速和特异地规划抗原识别能力进入循环T细胞作为治疗癌症和传染病的一种策略。与DNA纳米载体相比,合成的mRNA分子直接翻译成治疗性靶蛋白,不需要进入细胞核,可以保证高的转染率和快速的治疗效果。他们的修剪尺寸(在我们的研究中,实际的汽车编码或TCR编码序列+仅276个碱基为5‘UTR和Polya束)导致一个高拷贝数的纳米粒子。此外,不受控制的插入突变和启动子依赖是避免的,因为交付的mRNA发挥其在细胞质中的功能。我们证明,简单地注射合理设计的mrna纳米载体可以选择性地将ccr基因或tcr基因导入宿主T细胞,并将其编程到足以导致疾病回归的数量,其效果类似于采用的方法。几个正在进行的临床试验正在测试癌症患者体内外工程基因CAR T细胞的重复输注(ClinicalTrials.gov:NCT 01355965,NCT 01897415,NCT 02277522和NCT 02624258),第一个数据表明细胞输注后瞬时的car表达足以引发抗肿瘤反应。56,57,58.

IVTmRNA作为一种新的过继性T细胞治疗工具迅速出现的三个重要原因是其固有的安全性、高效的重组蛋白翻译以及与常规小分子药物相似的控制药物动力学特性的能力。事实上,我们在多次给药后测量到的小鼠体内表达的T细胞的动力学类似于一种有明确定义的半衰期药物的轮廓(图1)。4E)。这与工程T细胞过继转移后相当不可预测的T细胞动力学形成鲜明对比,即细胞浓度在血液中最高,随后在几天至几个月的可变时期内下降。59,60,61,62。虽然原位编程能够控制治疗的药代动力学特性,并定期对宿主淋巴细胞重新编程--因此有可能绕过广泛应用T细胞疗法的一些主要障碍(例如T细胞衰竭和功能障碍,以及长期毒性)--但这项技术仍有一些局限性:(1)它依赖于患者中存在足够数量的功能性T细胞。淋巴减少在晚期癌症患者中很常见,这些患者接受了大量的化疗药物预处理。因此,病人的血液很可能需要在加入我们现成纳米试剂的临床试验之前进行预先筛选。(2)激发免疫应答可减弱药物的疗效。由于T细胞规划纳米粒子被周期性地注射到免疫完整的病人身上,所以可以形成抗药物抗体.对于临床翻译这项技术,重要的是选择完全人源化的CD8靶向配体,交付具有低免疫风险的car/tcr结构,以及用假尿苷合成mrna(或最近描述的n1-甲基假尿苷)。63)和5-甲基胞嘧啶减少先天免疫反应。

为了将循环的T细胞转移到原地的肿瘤细胞,几家生物技术制药商开发出了双特异性抗体,包括咬伤、飞镖和diabody。64,65,66。其中,balatumomab(CD 19特异性咬伤)在血液系统恶性肿瘤患者的临床研究中显示出令人鼓舞的结果。67,68,69。然而,咬伤必须作为持续的输注,这样才能产生全身毒性。67。此外,与传统的单克隆抗体一样,咬伤也不会在输注后进行主动的生物分布或自我放大.相反,这里描述的基于纳米粒子的基因修饰系统可以产生新的肿瘤特异性T细胞,它作为一种“活药物”,能主动定位于靶点,增加数量,并依次摧毁癌细胞。对CAR T细胞治疗的兴趣仍然很大,全世界有300多个正在进行中的汽车T细胞试验。70因此,我们认为现在是时候推出我们的现成纳米试剂作为一种竞争的技术,可以迅速重新编程T细胞,以识别和摧毁肿瘤,而不需要实验室操作。

在对人类进行临床研究之前,我们将扩大与ncl的合作,以确定纳米粒子在大型动物物种中的安全性,并参照fda关于纳米药物的规定。与临床上已经建立的治疗学,如小分子或抗体,汽车编程纳米粒子是多组分的三维结构,需要一个可重复的制造过程,以可靠地实现预期的物理化学特性,生物学行为,和药理学剖面。这些纳米药物的安全性和有效性可能会受到许多参数微小变化的影响,需要仔细监测,特别是在针对非预期地点和潜在毒性的情况下。此外,与传统药物相比,纳米医学还需要更多的发展和监管方面的考虑。目前在美国只有少数几个具备必要程度专家经验的设施在运作。


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