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急、慢性神经炎症滤泡T辅助细胞频率的差异

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发表时间:2020-11-25 16:17作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

除了T细胞在自身免疫性神经炎性障碍(MS)发病机制中的主要作用外,最近的研究也强调了B细胞在致病炎症过程中的作用。滤泡性T辅助细胞(Tfh)对于促进B细胞驱动的免疫反应是必不可少的.然而,他们在MS及其小鼠模型--实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中的作用尚未得到充分的研究。要更好地理解Tfh细胞对疾病的贡献,第一步是考虑Tfh细胞的定位与遗传背景和EAE诱导方法的关系。在此,我们研究了三种不同EAE模型在疾病进展过程中Tfh细胞在疾病相关器官中的分布。C57BL/6J EAE高峰时,Tfh频率在中枢神经系统(CNS)增加,与慢性疾病活动平行,而缓解期缓解SJL EAE小鼠Tfh细胞频率增加。此外,转移的Tfh偏斜细胞在体外极化,在B6.Rag1诱导了轻微的临床症状。−/−老鼠。在C57BL/6和SJL/J小鼠中,我们发现硬脑膜中的Tfh细胞明显高于CNS中的Tfh细胞。总之,我们的研究强调了Tfh细胞在自身免疫性神经炎症过程中的多种非静态作用.

导言

多发性硬化症(MS)是一种以中枢神经系统炎症和神经变性为特征的慢性自身免疫性疾病。1...致病性T辅助细胞(Th),尤其是Th1和Th17亚型,在疾病发病过程中起着重要作用。2,3,4。鉴于B细胞靶向治疗的成功,如甲氨蝶呤在临床上的应用5目前,B细胞的作用正在重新评估,关于T和B细胞之间相互作用的中心问题仍不清楚。此外,Ⅱ型MS病变模式表明至少有一组MS患者是由B细胞驱动的病理。6.

在MS患者中,B细胞在脑膜形成滤泡结构,这似乎与皮层灰质损伤有关。7,8,9,10。脑膜被认为是血液循环与中枢神经实质的联系,可以作为神经结构的入口和屏障。11,12。由于其与中枢神经系统的解剖关系,包括蛛网膜和皮下组织在内的软脑膜一直是讨论脑膜在神经炎症中的影响的研究重点。10,13。然而,最新的研究发现,最外层脑膜层、硬脑膜材料及其作为通往边缘的通道的作用引起了人们的极大兴趣。11.

自从小鼠MS模型,即实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE),可以完全由T辅助细胞激发,研究偏重于T细胞依赖性的发病机制。然而,有几种可能的B细胞特异性功能,被认为是促进神经炎症过程,因此可能会影响EAE的进展。B细胞作为抗原提呈细胞(APC),参与维持和加重T细胞依赖的自身免疫反应。14。MCHⅡ依赖性B细胞活性在中枢神经系统自身免疫中起重要作用。15。B细胞产生细胞因子,如IL-616或GM-CSF17,具有促炎作用,而IL-10则可减少炎症过程。18。B细胞在免疫系统中的重要作用之一是抗体的产生,B细胞参与MS的早期标志是MS患者脑脊液中存在寡克隆带。寡克隆带是诊断MS的标准之一,表明中枢神经系统中存在产生抗体的细胞。19。短活血浆B细胞是MS患者参与炎症活动的主要B细胞亚群。20。尽管血浆置换的临床成功提示了自身抗体在MS发病机制中的作用21,到目前为止,自身抗体在MS中的直接致病作用还没有得到令人信服的证实。

滤泡T辅助细胞(Tfh),CXCR 5+在B细胞滤泡周围可发现的T辅助细胞亚群,通过支持增殖、抗体产生、类转换和卵泡生成来促进B细胞的活性。22,23,24。这表明Tfh细胞可能在自身免疫过程中产生影响,例如在MS病理过程中。

值得注意的是,几种以自身免疫为基础的疾病与cxcr 5有关。+辅助性T细胞亚群,如系统性红斑狼疮25,26、风湿性关节炎27和干燥综合征28被认为能促进炎症的地方。

这些发现提示Tfh细胞也可能参与MS的进展。尽管如此,尽管近几年来对EAE中Tfh细胞的研究得到了更多的关注,但对于Tfh细胞在MS病理中的作用仍然没有多少证据。29,30,31,32。虽然研究表明,tfh细胞似乎加重了EAE中持续的炎症过程。29,它们不会自行诱发疾病症状。31。然而,可能的表型变化或可塑性,可能导致任何未知的Tfh相互作用,但尚未在体内进行研究。

此外,与复发缓解疾病相比,tfh细胞在慢性疾病的发展中是否起着独特的作用,目前尚不清楚。要更好地了解Tfh细胞对疾病的贡献,第一步是在EAE中考虑Tfh细胞的定位。

本文分析了EAE过程中Tfh细胞在不同器官的分布情况。我们进一步比较了不同的疾病进展模型:SJL/J模拟复发缓解型MS(RRMS),C57BL/6 EAE模拟慢性病。为了了解Tfh在体内的可塑性,我们使用了B6.Rag1。−/−EAE作为一种被动EAE模型,独立于其他淋巴细胞群体的影响来分析其对疾病的影响。

结果

Tfh细胞存在于C57BL/6 EAE硬脑膜中

尽管有报道称EAE病C57BL/6小鼠急性炎症过程中存在Tfh细胞。29,32在疾病进展过程中,Tfh细胞在中枢神经结构中的分布尚不清楚。自从B细胞滤泡在MS患者和EAE小鼠的脑膜中被描述以来9在我们的分析中,我们区分了脑和脊髓(CNS)和颅骨脑膜的外层(硬脑膜),以检查循环动力学。

我们划分了军事观察组的疾病病程。35-55肽免疫C57BL/6小鼠分为三个不同阶段,视临床评分和免疫后天数(Dpi)而定:发病(平均dpi:10-12;评分范围:0.5~1.25),峰值(平均dpi:12-16;评分范围:2.5~3)和部分缓解(平均dpi:22-24;评分范围:0-1.25)(见图)。1A、B)。由于Tfh细胞是一个新描述的T辅助亚群,它缺乏一个共同的识别模式。如先前报告所述29,33,34以CXCR 5、Pd-1、CD3、CD4为主要的Tfh细胞标记物。更精确地关注CD 45+白细胞及防止任何CD11b污染+单核细胞和粒细胞,我们的目标群体是CD 45.2。+CD11bCD3+CD4+CXCR 5+Pd-1+活淋巴细胞图S1)。我们观察到CNS中Tfh细胞显著增加,在疾病高峰期达到最大值,随后在缓解期下降(图1)。1c)。所鉴定的Tfh细胞在疾病的所有时间点都表达Bcl 6和IL-21(Suppl)。图S2)。重要的是,我们还发现Tfh细胞位于硬脑膜(图)。1D和补编。图S2)。与疾病分期无关,硬脑膜的Tfh频率高于CNS(图1)。1e)。总之,我们的结果表明,Tfh细胞库持续存在于硬脑膜,但Tfh细胞的改变与中枢神经系统的炎症程度密切相关,中枢神经系统是疾病的靶器官。通过对Tfh细胞绝对计数的分析,证实了Tfh细胞在硬脑膜和CNS中与健康对照组相比均有明显的积累(补编)。图S3A)。值得注意的是,Tfh细胞的频率与EAE的疾病评分显著相关(p<0.5)。1(F)硬脑膜无明显相关性(图5)。1g)。这些结果提示Tfh细胞在C57BL/6-EAE中具有促炎作用。最近的研究强调肠道微生物在MS/EAE发病机制中的作用。35,以及肠道Tfh细胞对其他自身炎症疾病的影响。36我们进一步分析了代表小肠次级淋巴组织的Peyer‘s斑块的频率变化。值得注意的是,尽管临床疾病的严重程度有很大的差异(图一)。1A,B),我们没有在Peyer‘s斑块中检测到Tfh细胞频率的任何改变(图1)。1(H),表明微生物群的局部释放因子对Tfh室没有影响。我们还没有在Peyer‘s斑块中检测到Tfh频率与临床严重程度之间的任何相关性(图1)。1i)。

图1

C57BL/6 EAE细胞动力学研究体外诱导C57BL/6小鼠EAE的实验研究35-55肽免疫(二)A)EAE过程模拟慢性疾病的进展,每一阶段都以一只模范小鼠的疾病进展为代表。疾病发作(dpi 10-12)、峰值(dpi 12-16)和部分缓解(dpi 22-24)取决于EAE进程。比较不同疾病期的平均临床评分(B). (CE)Tfh细胞(CXCR 5+Pd-1+)在T细胞中的百分比(CD4)+CD3+CD11bCD45.2+通过流式细胞仪(FACS)比较中枢神经系统(CNS)明确的疾病分期(C)和硬脑膜(D)。此外,还比较了不同时间点(发病、高峰、部分缓解)和硬脑膜的Tfh频率。E)。数据为平均值±扫描电镜(CE). (F, G)Tfh细胞百分率与CNS临床评分的相关性分析(F)和硬脑膜(G). (H,I)高频频率分析(H)和相关分析(I)在Peyer家的补丁里。结果代表了两个独立的实验。采用单因素方差分析和Tukey的多重比较检验(BE, H)或线性回归(F, G, I)。*p<0.001;**p<0.01;*p<0.001;*p<0.0001。发病5例,高峰5例,部分缓解4例。

SJL/J EAE患者CNS中Tfh细胞频率的降低及临床评分的提高

以往对EAE中Tfh细胞的研究主要集中在代表慢性疾病的C57BL/6J小鼠模型上。29,32。然而,RRMS是人类常见的一种疾病。为了了解RRMS过程中Tfh细胞的参与情况,我们用SJL/J小鼠建立了这种疾病的模型。根据该模型的疾病进展情况,分析Tfh在发病时的频率(平均dpi:9-11;评分范围:0.5~1.25)、峰值(平均dpi:11-13;评分范围:2.5~3)、缓解(平均dpi:16-17;评分范围:0-1.25)和复发(平均dpi:34-36,评分范围:1-2)(见图)。2A、B)。

图2

SJL/J EAE细胞动力学研究PLP诱导SJL/J小鼠EAE的研究139-151肽免疫(二)A)EAE过程模拟复发-缓解疾病进展,每一阶段以一只模范小鼠的疾病进展为代表。疾病发作(平均dpi:9-11;评分范围:0.5~1.25)、峰值(dpi平均值:11-13;评分范围:2.5~3)、缓解(平均dpi:16-17;评分范围:0-1.25)和复发(dpi:34-36,评分范围:1-2)取决于EAE过程。比较不同疾病期的平均临床评分(B). (CE)Tfh细胞百分比(CXCR 5)+Pd-1+)T细胞(活的CD4)+CD3+CD11bCD 45+比较不同疾病分期的中枢神经系统(CNS)的淋巴细胞。C)和硬脑膜(D)。此外,比较了不同时间点(发病、高峰、部分缓解和复发)和硬脑膜的Tfh频率。E)。数据为平均值±扫描电镜(CE). (F, G)Tfh细胞百分率与CNS临床评分的相关性分析(F)和硬脑膜(G). (H, I)高频频率分析(H)和相关分析(I)在Peyer家的补丁里。结果代表了两个独立的实验。采用单因素方差分析和Tukey的多重比较检验(BE, H)或线性回归(F, G, I)。*p<0.001;**p<0.01;*p<0.001;*p<0.0001。发病4例,高峰5例,缓解5例,复发5例。

值得注意的是,tfh细胞在CD4中所占的百分比。+与缓解期相比,疾病复发时中枢神经系统中的T细胞在急性炎症期意外下降(图1)。2c)。这种效应也可在硬脑膜中发现,在缓解期,Tfh细胞频率最高(图1)。2d)。再一次,与疾病分期无关,硬脑膜的Tfh频率高于CNS(图1)。2e)。虽然Tfh细胞绝对计数在缓解期有减少的趋势,但无论是在CNS还是在硬脑膜(补编)。图S3B),可与在C57BL/6模型中观察到的情况相媲美(补编)。图S3A),我们确定了tfh细胞在CD4之间的频率。+CNS中的T细胞与疾病严重程度呈显著负相关(图一)。2f、g)。重要的是,这与C57BL/6小鼠慢性疾病过程中的正相关形成鲜明对比,提示Tfh细胞在SJL/J-EAE中具有抗炎作用。这些结果以及急性炎症时SJL/J-CNS结构中Tfh频率的降低,提示Tfh细胞在不同病程中具有相反的作用。然而,在SJL/J模型中,Tfh频率的调节似乎在中枢神经系统中尤为重要。与C57BL/6模型相比,Peyer‘s斑块中未观察到Tfh细胞频率的疾病状态依赖性改变(见图)。2h)。此外,未发现Tfh细胞频率与临床评分之间的相关性(见图)。2i)。

这些结果表明,与慢性C57BL/6 EAE模型相比,Tfh细胞可能在受影响的CNS组织中局部发挥其对EAE疾病进展的作用,其作用与慢性C57BL/6 EAE模型相反。

在IL-21和IL-6存在下,用B细胞共培养获得Tfh倾斜细胞。

为了更准确地了解Tfh细胞的功能和可塑性,我们在体外建立了一种极化的Tfh斜向细胞培养体系。由于这种体外培养的基础是磁分离的幼稚T辅助细胞,体内进行了CD11b的排除。+细胞是不必要的,我们将目标群体定义为CXCR 5。+Pd-1+CD4+T细胞Tfh细胞体外培养条件的比较37,38,或对这些文化进行轻微的修改(图1)。3(A)我们确定了B细胞共培养协议。科伦布兰德等人. 37细胞因子浓度为2 g/ml抗CD3,20 ng/ml IL-6,50 ng/ml IL-21,10 g/ml抗IL-4和10 g/ml抗IFN-γ,与CD 90共培养。-脾细胞代替树突状细胞,对产生CXCR 5+PD1+细胞最为有效。3(A)虽然总体频率仍然很低。在建立的Th1,Th2和Th17细胞体外培养中,我们没有检测到任何向CXCR 5分化的情况。+PD1+细胞确认这是Tfh细胞的唯一属性(如图所示)。3b)。为进一步鉴定,将Tfh-斜交细胞转化到B6.Rag1。−/−老鼠。

图3

体外培养的Tfh细胞转化Rag1细胞的实验研究−/−老鼠。(A)Tfh细胞在不同条件下体外培养:Tfh-B细胞共培养,B细胞-T细胞比例为1:2,CD 90为CD 90。2μg/ml抗CD3,20 ng/ml IL-6,50 ng/ml IL-20,10 g/ml抗IL-4和10μg/ml抗IFN-γ存在下,脾细胞-T细胞比例为1:5。Tfh与T细胞CD 90的两种不同培养方式脾细胞比例为1:1,存在类似的细胞因子组合。在没有IL-6的情况下设置1,在20 ng/ml的IL-6存在时设置2.(B)Tfh细胞的流式细胞分析(CXCR 5)。+Pd-1+CD4+)在Th1、Th2和Th17细胞中,与TfH-B细胞共培养比较。(C)B6.Rag1的EAE病程-/-5×10静脉注射小鼠6在以上所述的体外培养中,每只小鼠Tfh斜交细胞培养(4%Tfh阳性)。(D在dpi 31上对脾脏、中枢神经系统和硬脑膜中的Tfh细胞群进行了流式细胞分析。(CG)细胞因子(IFNγ,IL-17和TNF-α)和CXCR 5的产生分析+Pd-1+CD4表达+移转日Tfh体外培养淋巴细胞E),与淋巴细胞CNS(F)和脾脏(G)(B6.Rag1−/−用dpi 31,n=5进行单因素方差分析,然后用Tukey的多重比较试验进行统计学分析。A, B ,DG)。*p<0.001;**p<0.01;*p<0.001;*p<0.0001。TfH-B细胞共培养n=4,Tfh培养版本1 n=3,Tfh培养版本2 n=3,Th1培养n=3,Th2培养n=3,Th17培养n=3。

转Tfh离体培养可引起B6.Rag1的EAE症状−/−小鼠

虽然在EAE过程中Tfh细胞受到了广泛的关注,但体外分化的Tfh细胞在体内的稳定性尚不清楚。转移B6.2D2后,Tfh-斜培养(图)。3(B)至B6.1−/−小鼠,我们观察到晚起EAE,导致轻微的症状(图一)。3(C),因此,与转移促炎Th17细胞后的过继转移EAE相比,其诱导EAE的能力较低。表1)。因为B6.Rag1−/−小鼠缺乏内源性T细胞和B细胞39排除固有的T细胞活性,Tfh致病性完全通过B细胞活化介导。值得注意的是,免疫后31天所有分析器官的Tfh频率都在1%以下(见图)。3表明Tfh表型在体内不稳定。同样,与注射当天体外培养的细胞因子水平相比较(见图)。3(E)CNS和脾组织中IFNγ、IL-17和TNF-α水平均显著升高(图5)。3F,G),而Tfh频率接近于零。综上所述,这些结果表明,已建立的Tfh细胞体外分化方案产生的Tfh细胞培养物在体内表现出不稳定的表型,因此必须谨慎地得出关于目前可用的体外衍生培养的体内相关性的结论。

讨论

尽管Tfh细胞对自身免疫性疾病过程的影响已被证实,但Tfh对MS和EAE模型的影响近年来得到了越来越多的关注。29,32。在本研究中,我们对Tfh细胞在不同EAE模型中的作用提供了新的见解。我们观察到C57BL/6 JEAE炎症期Tfh细胞浸润CNS的增多。Tfh细胞在B细胞活化中的重要作用22,23,24。重要的是,尽管多发性硬化症通常被认为是T细胞引起的自身免疫性疾病,但有证据表明B细胞在神经炎症中发挥了作用。5,40,41,42。然而,迄今为止,Tfh细胞参与EAE进展的问题仍存在很大争议,缺乏标准化的研究方法和指标,使得功能分析具有挑战性。最初描述为人扁桃体中表达B细胞归巢受体CXCR 5的T辅助亚群22,该群体的进一步特征是pd-1、IL-21和bcl 6的表达。34。由于其他细胞系也能够表达这些特征,因此对目标群体的准确定义是一个关键问题。在这里,我们通过排除CD11b阳性细胞来防止单核细胞的污染,并且只包括CD 45,而将注意力集中在纯T辅助细胞上。+CD3+CD4+细胞进入我们的分析。为了尽可能精确地针对我们的Tfh人群,我们确定他们是Pd-1和CXCR 5双阳性。本文报道的炎症过程中tfh细胞在中枢神经系统中的增加支持了先前的观察。29,32表明Tfh细胞参与炎症机制。

由于硬脑膜的作用很少被纳入炎症性疾病的研究,尽管它的血管和淋巴管含量高,我们决定把重点放在它的分析。它作为周围神经与中枢神经结构之间的桥梁,可作为炎症反应通路进入中枢神经实质。虽然到目前为止,滤泡结构主要是在鳞片中描述的。10,13我们发现在硬脑膜炎症期Tfh频率增加,强调了Tfh在神经炎症中的重要性。

我们还首次在模仿不同类型MS的EAE模型中寻找tfh细胞。43,44。我们的数据表明,与C57BL/6 EAE相比,在SJL/J EAE疾病进展过程中,Tfh细胞的动态变化是相反的。在缓解复发模型中,CNS中Tfh频率最高,在缓解的非炎症期有下降趋势,提示Tfh细胞可能支持疾病的缓解。

SJL/J和C57BL/6 EAE中Tfh细胞作用不同的原因可能是由于小鼠不同品系的免疫变异所致。45。有趣的是,SJL/J小鼠和C57BL/6小鼠B/T细胞比率存在差异。46。B细胞功能在SJL/J小鼠中是否也存在差异,尚不清楚。然而,B细胞在神经炎症的免疫反应中可能具有相互冲突的作用。47,48,49。虽然消耗B细胞的八氯唑抗可使MS症状得到缓解,但由于与对照组相比复发率高,第二阶段的B细胞消耗疗法试验不得不终止。50。虽然恶化的确切原因尚不清楚,但据推测,阿采西普会导致B细胞的不完全减少,从而导致促炎和调节性B细胞(Bregs)的不平等。产生IL-10的Bregs是B细胞的一个亚群,被认为具有抗炎能力,因此在小鼠EAE模型中免疫抑制和恢复是必需的。49,51,52.

我们认为SJL/J EAE小鼠在缓解期Tfh细胞频率的增加表明Tfh细胞介导的抗炎调节B细胞反应的支持,而Tfh细胞与C57BL/6 EAE小鼠CNS的临床评分显著相关,提示C57BL/6 EAE小鼠有促进炎症B细胞活性的作用。因为B细胞的调节功能在缓解过程中是非常重要的53与C57BL/6 EAE相比,SJL/JEAE小鼠Bregs的激活也可能是Bregs在SJL/JEAE中的强缓解机制之一。

重要的是,SJL/J小鼠在缓解期只增加Tfh细胞频率,而不增加绝对Tfh细胞数。因此,较高的Tfh细胞频率与减轻疾病严重程度的相关性表明,与其他辅助T细胞亚型相比,Tfh细胞的相对数量在调节B细胞反应中起着重要的作用。需要进一步的研究来阐明Tfh细胞是如何促进促炎或抗炎B细胞反应的。由于B细胞亚型在不同病程中的不同分布可促进不同的炎症过程,因此有必要分析不同疾病模型中B细胞动力学的差异。明确Tfh细胞与不同B细胞亚型相互作用的确切机制,为新的治疗策略寻找更具体的靶点具有重要意义。此外,重要的是要确定Tfh细胞如何能够影响疾病的进展,独立于B细胞。在这里,我们观察到一个来自CXCR 5的开关。+Pd-1+Tfh-斜交细胞培养成产生CD4的干扰素γ和IL 17+辅助细胞。尽管转移的细胞数量较少,但这种表型足以在B6.Rag1中诱导EAE。-/-老鼠。Tfh细胞可塑性54Tfh细胞在体内可能是一种促炎表型,随着潜在的非极化的幼稚T辅助细胞分化为Th1和Th17样细胞,Tfh细胞也可能导致中枢神经炎症。总之,我们的数据表明,需要改善培养条件,才能使tfh表型更加稳定,从而清楚地解释体外倾斜的tfh细胞对体内的影响。-疾病表型

然而,我们在C57BL/6和SJL EAE中的结果为Tfh细胞在体内神经炎症中的作用和作用提供了新的见解,并为Tfh细胞和B细胞领域的基础研究提供了新的靶点。特别是,与C57BL/6 EAE相比,我们已经发现了SJL/J EAE中Tfh细胞频率的不同动态,提示Tfh细胞在疾病期间可能同时具有有益和有害的作用,可能导致尚未被探索的治疗方法。

材料方法

小鼠

六至八周龄女性C57BL/6J,B6.Rag1−/− 39SJL/J小鼠从Janvier实验室(法国圣伯特文·Cedex)购买,并在特定的无病原体条件下繁殖。小鼠被单独饲养在单独通风的笼子里。所有动物实验都得到了地方当局(Landesuntersuchsamt RyinlandpFalz)的批准,并根据“德国动物保护法”进行。

实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的诱导

C57BL/6J小鼠EAE的实验研究55,皮下四点免疫200克35-55肽,根据制造商的指示或自制的胡克试剂盒EK 2210。另外,在完全弗氏佐剂中加入800 mg H37RA(Difco)乳化剂,然后在免疫时两次在PBS中注射200 ng百日咳毒素。用250μg PLP诱导SJL/J小鼠EAE活性。139-151肽(胡克实验室)而不是军事观察组的肽。被动EAE,5×106B6.2D2 Tfh斜向细胞经静脉注入B6.Rag1−/−老鼠。每天监测EAE的临床症状,并将其转化为临床评分,如前所述。560:未发现EAE征象;0.5:尾无力;1:完全性尾瘫;2:部分后肢麻痹;2.5:单侧完全性后肢麻痹;3:完全性双侧后肢麻痹;3.5:完全性后肢麻痹和部分前肢麻痹;4:前肢和后肢全瘫;5:死亡。

用1.5%氯胺酮溶液麻醉小鼠。灌注前分离脾,置于RPMI介质中。为了清除感兴趣器官中的血细胞,通过切断心房进行灌注,用至少20 ml的PBS冲洗血管循环。在IMDM中分离出脑和脊髓(CNS)。取颅骨上部5 ml PBS加2%FCS。分离小肠,切取Peyer‘s斑块,取5ml冲洗液(RPMI培养基)。

中枢神经系统的细胞分离

用胶原酶IV(Sigma)、DNase I(罗氏酶)和胶原酶/分散酶(Roche)在37℃下消化30 min。单细胞悬液经100 m细胞滤器过滤,再悬浮于5 ml 40%Percoll溶液中。将悬浮液置于70%PBS的Percoll溶液中,在室温750 g、低加减速条件下离心30 min,形成梯度。脂肪层被丢弃,而Percoll和IMDM相之间的细胞层被分离。

Peyer氏斑细胞分离

Peyer氏片经100μm细胞过滤器粉碎后离心(500 g,5 min,4°C)。细胞球团被重新悬浮在溶解缓冲液NH中。4氯(8.29克/升),KHCO3(1克/升),钠2EDTA(37.2mg/l),水洗。

硬脑膜细胞分离

将硬脑膜在显微镜下轻轻拔出颅骨上部,用PBS冲洗,在消化液中消化(胶原酶VIII(Roche),DNase 1(Roche),在PBS中)30 min。该反应用PBS+2%FCS停止,悬浮液经30m滤池均匀化。

细胞染色和流式细胞术

表面染色用单细胞悬液。活-死活染色(碘化丙酸或7-氨基放线菌素7AAD(BioLegend)或固定活性染色450(BD生物科学))染色。在分析小鼠细胞表型时,使用了以下抗体:

抗CD4-V 450(1:400)(克隆:RM4-5,BD生物科学),抗CD4-CD4-PeCy7(1:1000)(克隆:RM4-5,BD生物科学),抗CD4-CD4-AF 700(1:200)(克隆:RM4-5,BD生物科学),抗CD3-aPC(1:200)(克隆:1452-C11,BD生物科学),抗干扰素-干扰素-V 450(1:200)(克隆:XMG1.2,BD生物科学),抗CD45.2-aFluor 700(克隆:1:400)(克隆:104,抗CD 45-BV 605(1:200)(克隆:30-F11,BD生物科学);抗CD11b-Pe/Cy7(1:200)(克隆:M1/70,热费舍尔科学),抗CD11b-PerCP-Cy5.5(1:200)(克隆:M1/70,Biolegend),抗IL-17-APC(1:200)(克隆:eBio17B7,热莫费希尔科学),抗CXCR 5-FITC(1:200)(克隆:L138D7,生物传奇)和抗PD-1-PE(1:200)(克隆:29F.1A12,Legend),Anti-Bcl6-PECy7(1:50)克隆(克隆:7D1,7D1)。抗IL21-APC(1:50)(克隆:FFA 21,热费舍尔科学)。


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