ST3GAL1是SOX2-GLI1转录复合物的靶点，通过Axl促进黑色素瘤转移

了解控制黑色素瘤进展的分子事件对于开发这种毁灭性疾病的替代治疗方案至关重要。在此，我们报告了一种由致癌的SOX2-GLI 1转录复合物通过诱导唾液酸转移酶ST3GAL 1介导黑色素瘤侵袭的机制。通过体外和体内研究，我们发现ST3GAL1能促进黑色素瘤的转移。这种酶的沉默抑制了黑色素瘤的侵袭，并显著降低了侵袭性黑色素瘤细胞进入血液流、定植远端器官、种子和在转移环境中生存的能力。糖基化蛋白分析表明受体酪氨酸激酶Axl是ST3GAL1促侵袭功能的主要效应因子。ST3GAL1诱导Axl二聚和激活，进而促进黑色素瘤的侵袭。我们的数据支持ST3GAL1-Axl轴作为黑色素瘤转移的驱动因素的关键作用，并强调靶向该轴治疗转移性黑色素瘤的治疗潜力。

恶性黑色素瘤是皮肤癌中最具侵袭性和抗药性的一种.它的侵略性是基于黑色素瘤细胞的高转移潜能，甚至在疾病的早期。尽管最近使用靶向治疗和免疫检查点抑制剂的治疗在一小部分晚期黑色素瘤患者中取得了长期存活，但转移性黑色素瘤仍然是一种无法治愈的疾病。1。因此，识别和定位黑色素瘤转移的关键因素是有效控制肿瘤进展的关键步骤。

糖基化异常，特别是唾液酸的增加，是恶性表型的一个重要决定因素，因为它直接影响到支持肿瘤进展和转移的关键过程，包括细胞粘附、运动、侵袭和免疫逃避。2,3,4,5,6,7。提高唾液酸水平增强细胞对凋亡的抵抗力和调节免疫细胞的功能8，以及改变肿瘤细胞与细胞的相互作用，促进细胞从原点脱离。由于唾液酸糖结合物调节粘附和促进运动，它们也可能是重要的定植和转移潜力。尽管糖基化异常与黑色素瘤的进展有关9,10在疾病发病过程中，控制这种翻译后修饰的生物学意义和机制一直是人们所不了解的。

最近我们和其他研究小组的研究表明，转录因子GLI 1，Hedgehog(HH)通路的最终效应因子与多能转录因子SOX 2在包括黑色素瘤在内的多种癌症中相互作用。11,12,13。在这里，我们发现了一组由SOX2-GLI 1共同调控的基因，导致转移性黑色素瘤中的O-糖基化异常。体外和体内试验表明，β-半乳糖苷-α-2，3-唾液酸转移酶-1催化唾液酸从胞苷单鞘酸转移到含半乳糖的底物，是黑色素瘤侵袭转移的关键驱动因子。此外，生化和功能研究表明，受体酪氨酸激酶Axl是ST3GAL1对黑色素瘤的促侵袭作用的主要介质。我们的研究揭示了ST3GAL1-Axl轴驱动黑色素瘤转移的一种功能，并认为抑制这一轴可能成为治疗转移性黑色素瘤的一种很有前途的治疗策略。

O-糖基化是SOX 2和GLI 1的共同调节途径。

为了鉴定SOx 2和GLI 1共同调控的基因，我们对从皮下转移获得的SSM2c细胞进行了全转录组分析。11,14，SOX 2或GLI 1经特异性shRNA沉默后(图1)。1A)。从每个条件产生3对总RNA，用于库的准备和随后的RNA-序列分析(RNA-seq)。所有样本都有超过5000万个读取，超过93%的读取映射到人类基因组(从UCSC基因组浏览器程序集ID：hg 19获得)。采用差异表达分析(折叠变化(FC)>1.5，假发现率(FDR)<0.1为标准剪裁)，我们鉴定了1104个在SOX 2-和GLI 1-敲除细胞中共同改变的实体(如图1所示)。1B和补充数据1)。David函数注释工具揭示的将基因分组为富集簇(Https://david.ncifcrf.gov/)已鉴定出的O-糖基生物合成途径(p在前7位细胞中，SOX 2-和GLI 1缺失的黑色素瘤细胞中均有明显的下调(图一)。1C)。糖基化异常与黑色素瘤的进展和免疫抑制有关。4,9,10,15，我们详细研究了作为O-连接糖基生物合成途径组成部分的基因的表达情况。Rna-seq结果与定量实时PCR(QPCR)验证相结合，确定了6种不同的糖基转移酶在SOX 2-和GLI 1-沉默细胞中均明显下调：N-乙酰半乳糖氨基转移酶GALNT 3, GALNT 6和GALNT 12，唾液酸转移酶ST3GAL1而N-乙酰氨基葡萄糖转移酶GCNT 1和GCNT 2(无花果)1D-f)。来自独立临床队列的转录数据集的数据挖掘显示，与痣和转移病例相比，黑色素瘤中ST3GAL1的水平始终高于原发黑色素瘤(补充图)。1)。WESTERNBLOTTING分析证实SOX 2-和GLI 1缺失的A 375 M6和SSM2c细胞中ST3GAL1蛋白水平均明显降低(图一)。1g)，且ST3GAL1在这些转录因子的异位表达后持续增加(TFs；图1)。)。在此基础上，我们重点研究了唾液酸转移酶ST3GAL1在黑色素瘤转移中的作用。

ST3GAL1表达与黑色素瘤进展的关系

β-半乳糖苷-2，3-唾液酸转移酶-1 st3gal 1催化唾液酸从胞苷单鞘酸转移到含半乳糖的底物上，并与肿瘤进展和耐药性有关。16,17。几种皮肤癌的公开转录数据集的数据挖掘(GSE 7553)18揭示ST3GAL1与基底细胞癌(BCC)或鳞状细胞癌(SCC)相比，恶性黑色素瘤中优先表达。2A)。此外，人类痣、原发黑色素瘤和转移黑色素瘤的转录数据集(GSE 46517)19显示ST3GAL1与黑色素瘤进展密切相关ST3GAL1原发黑色素瘤的mRNA水平与痣相比较，转移性黑色素瘤的mRNA水平与原发性黑色素瘤相比较(图一)。2B)。此外，在硅数据分析显示，ST3GAL1在23%的人黑色素瘤中发生了改变(错义突变、基因扩增或mRNA上调)。2C)。与转录数据一致的是，人黑色素瘤组织微阵列的免疫组化分析显示，与原发黑色素瘤相比，ST3GAL1染色阳性的转移病例所占比例更高。p=0.0198)或痣(p=0.0007；图1。2D，e和补充表1)。黑色素瘤细胞ST3GAL1染色可见于胞浆内，呈核周颗粒型(见图)。二维空间，高放大率)。在人正常皮肤中，ST3GAL1染色仅限于胞浆表达较弱的稀疏细胞(如图所示)。二维空间)。因此，westernblot分析表明，ST3GAL1在转移性黑色素瘤细胞中有不同程度的表达，但在正常人表皮黑素细胞中几乎不表达。2F)。总之，这些数据表明ST3GAL1在人类黑色素瘤中持续表达，并与肿瘤的进展有关。这些结果促使我们研究ST3GAL1在黑色素瘤病理生物学中的作用，并探讨SOX 2和GLI 1对其功能的调节作用。

ST3GAL1调节黑色素瘤侵袭性

为了研究ST3GAL1在黑色素瘤进展中的作用，我们在A 375细胞(A 375 M6)的肺转移克隆中沉默了ST3GAL1。20在SSM2c细胞中使用两个独立的ST3GAL1 shRNAs(LV-shST3GAL1.1和LV-SST3GAL1.2)，它们的目标是3′-UTR或者光盘ST3GAL1区域(图1)。3A)。我们首先通过体外迁移和侵袭试验来评估ST3GAL1是否在黑色素瘤细胞侵袭性中起作用。在划痕实验中，ST3GAL1缺失细胞的运动能力和伤口闭合率随时间的增加而显著降低，LV-shST3GAL1.1和LV-SST3GAL1.2 A375 M6细胞的运动能力和伤口闭合率分别比扰频细胞降低30%~40%(图1)。3B在LV-shST3GAL1.1和LV-SST3GAL1.2 SSM2c细胞中约占80%~90%。3C)。此外，ST3GAL1基因敲除可显著降低A 375 M6细胞的侵袭能力，或几乎完全丧失SSM2c细胞的能力。3D，e)。ST3GAL1耗竭后，EMT标记N-cadherin、Vimentin、SNAI 1(Snail)和SNAI 2(Snig)的表达降低，提示ST3GAL1调节向间充质表型的转变(图1)。3A)。与这些结果一致的是，ST3GAL1在转移细胞株MeWo和患者源性转移细胞M51中的异位表达(如图所示)。3F)，两者都表达低水平的ST3GAL1(如图所示)。2F)，加速伤口闭合和促进体外侵袭(见图)。3G-j)，伴随着EMT标记的表达增加(如图所示)。3F)。ST3GAL1表达上调对黑色素瘤细胞生长无明显影响，但ST3GAL1过表达只使MeWo细胞早期凋亡细胞比例略有降低，而对晚期凋亡无明显影响(附图)。2)。总之，这些结果表明，ST3GAL 1赋予黑色素瘤细胞转移潜能。

体内黑色素瘤转移需要ST3GAL1

我们首先研究了ST3GAL1的缺失如何影响黑色素瘤细胞在转移环境中存活和增殖的能力，这是基于心内灌注黑色素瘤细胞的模型。10。我们注射稳定转染慢病毒颗粒的A 375 M6细胞，该细胞携带两种独立的shRNA之一，分别抗ST3GAL1(LV-shST3GAL1.1或LV-SST3GAL1.2)或LV-shST3GAL1.2和荧光素酶报告载体(见图1)。4A)。QPCR和Westernblotting证实，两种shRNAs均能有效沉默ST3GAL1。4B，c)。我们在裸鼠胸腺裸鼠心内注射A 375 M6，并在注射后第7天和第14天用体内生物发光成像(BLI)评估定植情况。一次成功的心内注射在第1天显示全身生物发光分布在动物身上。注射LV-shST3GAL1.1或LV-SST3GAL1.2的小鼠与在多个器官中注射LV-c的小鼠相比，其播种能力明显降低(如图1所示)。4D-f)。注射表达两种ST3GAL1 shRNAs的A 375 M6细胞的小鼠肺部转移灶较少且小得多(见图)。4G，h).

接下来，我们用异种移植转移模型来确定ST3GAL1的调控是否影响体内转移形成。将稳定转染GFP/荧光素酶报告子的A 375 M6细胞和LV-shST3GAL1.1、LV-ST3GAL1或置乱对照(LV-c)注射到裸鼠胸腺裸鼠的侧翼，监测小鼠的原发肿瘤生长、血液中循环黑色素瘤细胞(CTCs)的存在和转移情况(图一)。5A，b)。我们观察到LV-c、LV-SST3GAL1.1和LV-ST3GAL1对小鼠的肿瘤生长无明显影响，但对经LV-shST3GAL1转导的A 375 M6细胞的肿瘤生长有轻微的延迟(如图1所示)。5C)。当局部肿瘤达到相同的肿瘤体积时(注射后21-24天)，如图所示。5C，d)手术切除原发肿瘤，检测细胞进入血流(CTCS)并产生远处转移的能力。ST3GAL1的沉默大大降低了血液中循环黑色素瘤细胞的频率(如图所示)。5E)并强烈抑制A 375 M6细胞的转移潜能，如肺等器官发光分布减少所示(如图所示)。5F，g)。注射后45天处死小鼠，解剖肺和主要脏器，进行组织学和免疫组化检查。注射LV-shST3GAL1的小鼠与LV-c相比，肺微转移的数量明显减少(如图所示)。5H，i)。与对照组相比，ST3GAL1的异位表达不影响CTCs的数量，也不影响每个肺的微转移灶的数目。5e-i)，虽然小鼠体内注射了LV-ST3GAL1介导的黑色素瘤细胞，但其大转移的数量却较多(补充图1)。3)。这些数据提供了证据，表明ST3GAL1沉默会极大地削弱侵袭性黑色素瘤细胞进入血液流、在远处器官和种子中定居、在转移环境中生存和增殖的能力。

SOX 2和GLI 1共调节ST3GAL1基因转录

SOX 2和GLI 1正向调节ST3GAL1的表达。1)，因此，我们试图研究SOX 2和GLI 1的作用是否是直接转录控制的结果。ST3GAL1。在ST3GAL1调控区(RRS)的硅分析中(从UCSC基因组浏览器组装ID：hg 38获得)，使用TFBIND生物信息学软件(Http://tfbind.hgc.jp)确定了几个可能的SOX 2-和GLI结合位点(BS)，具有报告的一致序列(SOX 2-BS：wwtgnwTw)。21(Gli-BS：GACCACCCA)22,23。SOX 2和GLI 1的染色质免疫共沉淀试验(芯片)和qPCR(QPCR)显示，SOX 2和GLI 1位于ST3GAL1(增强子Ⅱ)转录起始位点(TSS)上游约10 kb的远端增强子元件上，在ST3GAL1信号芯片上有3-8倍的富集，在两种不同类型黑色素瘤细胞(Fig)中均含有非特异性IgG。6A-c)。同时，阴性对照和引物跨越ST3GAL1启动子没有明显的富集(图1)。6B，c)。为了证实SOX 2和GLI 1对ST3GAL1表达的调控能力，我们克隆了ST3GAL1增强子Ⅱ的结构，包括SOX2-BS和GLI-BS(−12,453/−11,457 bp)。6d和补充图。4)构建荧光素酶报告载体，检测SOX 2和GLI 1对SSM2c细胞ST3GAL1转录激活的影响。我们观察到荧光素酶的活性对SOX 2的异位表达有很强的诱导作用，这种作用在GLI 1耗尽后恢复，反之亦然(图1)。6E、f)。AsGLI 1直接调控SOX 2的表达11SOX 2对GLI 1的调节作用如图所示。1g，h)我们观察到ST3GAL1转录的诱导是否依赖于SOX 2在缺失GLI 1细胞中的过度表达，反之亦然。荧光素酶检测显示SOX 2过表达可部分补偿GLI 1的缺失(补充图1)。5A)，类似于GLI 1在SOX 2沉默细胞异位表达后发生的情况(补充图)。5B)，说明ST3GAL1的转录需要这两种转录因子。在mRNA和蛋白质水平上也证实了这一点(见图)。6g和补充图。5C-f)。其次，通过定点诱变，阻断推测的GLI-BS(−12,187/−12,178 bp)或两种可能的SOX 2-BS(SBS1在−12,212/−12,204 bp，SBS 2在−11,944/−11,936 bp处)。6d)进一步证实了我们关于直接转录调控的假说。ST3GAL1通过SOX 2(通过它在SBS 2上的结合)和GLI 1(图1)。六小时)。当GLI 1在消耗SOX 2细胞中过度表达时，GLI 1对ST3GAL1 GBSmut增强子Ⅱ的轻微易化作用完全被抑制(补充图2)。5G)，类似于SOX 2的SBS2mut增强剂II(补充图2)。5H)。然而，尽管SOX 2诱导的ST3GAL1转录激活甚至在没有功能GBS的情况下发生，但SBS 2的断裂似乎降低了GLI 1的反式激活(如图1所示)。六小时)。当GLI 1在SOX 2缺失细胞中过度表达时，这一效应仍被消除(补充图1)。5G)，暗示GLI 1通过SOX 2直接或间接地调控ST3GAL1。为了支持这一规定，SOX 2和ST3GAL1在商业和病人源性黑色素瘤细胞中观察到mRNA(补充图)。6).

接下来，我们询问ST3GAL1能否介导SOX 2和GLI 1诱导的黑色素瘤侵袭性。我们首先沉默了一个375M6细胞中的ST3GAL1，即SOX 2或GLI 1的高表达。我们的结果表明GLI 1和SOX 2都能增加黑色素瘤细胞的侵袭，而ST3GAL1的缺失可以抑制SOX 2和GLI 1的作用。6i-k)。ST3GAL1在SOX 2-或GLI 1缺失的SSM2c细胞中的异位表达能够挽救SOX 2或GLI 1沉默引起的黑色素瘤细胞侵袭减少(补充图1)。5i-k)。总的来说，这些数据显示ST3GAL1是一种关键的下游介质，参与了SOX 2和GLI 1诱导的黑色素瘤细胞的侵袭行为。

Axl介导ST3GAL1对黑色素瘤的促侵袭作用

为了鉴定转移性黑色素瘤细胞中可能的ST3GAL1介导因子，我们对唾液解蛋白进行了蛋白质组学分析。为此，我们用MAL凝集素亲和层析法制备了转染LV-ST3GAL1或LV-SST3GAL1.1的A 375 M6全细胞提取物，并对唾液解蛋白进行了富集。7A)。质谱分析鉴定了300多个蛋白质，其中43个蛋白质的唾液酸水平显著增加(翻倍变化≥1.5，pST3GAL1样品富集分数中的值<0.05(补充数据)2)。在去除污染的非糖基化蛋白(即核糖体蛋白、微管蛋白和热休克蛋白)后，利用David功能注释工具进行基因本体论分析，发现与转移相关的生物学过程丰富，如细胞运动、细胞迁移和运动控制机制。7b)。在补充表中显示了与上述细胞过程有关的与MAL结合的蛋白质。2。为了验证我们的蛋白质组学分析，我们检测了整合素β4(ITGB 4)的sialylated状态，该状态最近被报道为ST3GAL1-sialylated靶标。24，以及与黑色素瘤进展相关的3种受体酪氨酸激酶(Rtk)：Axl受体(也称为UFO)。25，神经生长因子受体(NGFR)(亦称CD 271)26，以及表皮生长因子受体(EGFR)27,28，在不同水平的黑色素瘤细胞中表达(补充图)。7A)。Mal-Ⅱ凝集素免疫共沉淀，特异性识别α2，3连接唾液酸残基，再用westernblot检测ST3GAL 1表达细胞中整合素-β4、AXL、NGFR和EGFR水平。7C与我们的蛋白质组学分析一致)。值得注意的是，ST3GAL1不影响整合素-α5的唾液酸水解，正如已经报道的那样。24，证实了我们的MS结果的可靠性(图)。7C和补充数据2).

接下来，我们询问ST3GAL1所鉴定的RTKs的唾液化增加是否与其在黑色素瘤中的生物激活有关。我们在A 375 M6中用人磷脂-RTK法分析了49种在酪氨酸残基上磷酸化的不同活化跨膜蛋白的相对磷酸化水平，如Axl、EGF和NGF受体家族蛋白。ST3GAL1的异位表达与置乱的LV-c细胞相比，增加了Axl的磷酸化状态，而不改变EGFR或NGFR的磷酸化状态(见图)。7D)。AXL，EGFR或NGFR的免疫共沉淀证实了这一点，然后用抗磷酪氨酸进行免疫印迹。7E)。此外，ST3GAL1在黑色素瘤细胞中的异位表达增强了Axl在Tyr 702残基催化激酶结构域的磷酸化。7F)，由于Axl的激活，它变成了自磷酸化。29表明ST3GAL1介导的AXL的增加可能与其活化有关。

为了进一步了解唾液酸是否能诱导Axl二聚和活化，我们用Gas6刺激血清饥饿的A 375 M6细胞，并对Axl二聚进行了分析。Axl主要以单体形式存在，而Gas6刺激只在内源ST3GAL1存在下诱导其部分二聚。7g)。与二聚结果一致的是，缺失ST3GAL1的A 375 M6细胞对配体刺激在Tyr 702没有出现Axl磷酸化(图1)。7H)。这些数据表明，硅化反应诱导了Axl的二聚和活化，增加了Axl与其配体Gas6的亲和力。

众所周知，Axl受体激酶在几种癌症的细胞增殖、存活、肿瘤干细胞维持和转移中起着至关重要的作用。25，并与黑色素瘤细胞运动、侵袭和耐药有关。30,31,32。因此，它为ST3GAL1的促侵袭作用提供了一个合理的选择。正如预期的那样，ST3GAL1在A 375 M6和MeWo细胞中的异位表达在黑色素瘤细胞侵袭中的表达显著增加。值得注意的是，伴随在这些细胞中的Axl沉默能够完全恢复ST3GAL1介导的促侵袭作用(图1)。8A-d)，如Vimentin和TFs、SNAI 1和SNAI 2的还原所示(图2)。8A)，与NGFR耗竭后的观察结果形成对比(补充图。7b-d)或EGFR(补充图)。7e-g)。此外，在内源性ST3GAL1存在的情况下，Gas6对Axl或其刺激的过度表达增强了侵袭表型(补充图1)。8)，表明唾液酸是这一途径的关键效应。Axl对A 375 M6 ST3GAL1-高表达细胞的迁移能力有影响，但对MeWo细胞的迁移能力没有影响，提示这一过程可能涉及额外的介导因子，可能是NGFR(补充图1)。9)。总之，我们的数据表明，silalyated Axl是ST3GAL1在黑色素瘤中所起的促进转移作用的主要介质。

为了进一步支持SOX 2/GLI1-ST3GAL1-Axl轴与黑色素瘤进展的相关性，我们对黑色素瘤脑转移PDX模型(M12、M15和M27)以及正常黑色素细胞培养物(补充图)进行了单细胞分析。10和11)。这些数据表明ST3GAL1，GLI 1，SOX 2，和阿克塞尔在肿瘤标本(M)和正常人(N)的黑色素瘤细胞中共同表达，但M12除外(图1)。8e-g和补充数据3)。此外，还对原发和转移性黑色素瘤短期培养中GLI 1、SOX 2、ST3GAL1和Axl的蛋白水平进行了分析。Westernblots显示原发黑色素瘤细胞SOX 2、GLI 1、ST3GAL1和Axl表达水平低于转移性黑色素瘤细胞，后者表达SOX 2/GLI1-ST3GAL1-Axl轴的活性较强。8H)。此外，对来自肿瘤基因组图谱(TCGA)的481份人类黑色素瘤样本的分析表明，ST3GAL1BRAF突变型黑色素瘤与野生型黑色素瘤相比有显著增加，阿克塞尔TP 53突变型黑色素瘤增加(附图)。12)。这些数据支持非遗传(GLI1-SOX2转录机制)和控制ST3GAL1-Axl轴的遗传机制的存在。

恶性黑色素瘤是全世界最致命的皮肤癌之一，也是最有可能转移的恶性肿瘤之一。唾液酸是一种从供体底物中添加到糖蛋白和糖类糖基末端的唾液酸，在肿瘤细胞侵袭性和肿瘤的发展过程中起着重要的作用。本研究表明，唾液酸转移酶ST3GAL1在黑色素瘤中受GLI 1和SOX 2的转录调控，是黑色素瘤细胞侵袭性和体内黑色素瘤转移的重要驱动因子。我们的研究表明，受体酪氨酸激酶Axl是ST3GAL1对黑色素瘤的促侵袭作用的主要介质。8I)。我们的研究表明，靶向ST3GAL1连接的过程可能成为未来预防或治疗已建立的黑色素瘤转移的一种有希望的治疗方法。

糖基化异常是肿瘤的标志之一，唾液酸转移酶基因表达的改变标志之一。越来越多的证据表明，唾液酸和唾液酸转移酶活性的改变与肿瘤的侵袭和转移有关。33。ST3GAL1在PyMT小鼠乳腺癌模型中具有促肿瘤作用。34。ST3GAL1是维持胶质母细胞瘤生长的关键，通过调节干细胞性状。16。此外，ST3GAL 1促进细胞迁移和侵袭，并对紫杉醇产生抗药性。17。然而，没有关于ST3GAL1在黑色素瘤中的作用的数据。

我们的研究表明，ST3GAL1的表达水平与黑色素瘤的进展有关。事实上，我们发现ST3GAL1在正常皮肤和痣中的低水平表达，并且在黑色素瘤进展过程中mRNA和蛋白水平的表达增加。基因芯片和免疫组化均显示ST3GAL1在转移性黑色素瘤中的表达明显高于原发黑色素瘤。此外，与其他类型的皮肤癌(如基底细胞癌或鳞状细胞癌)相比，ST3GAL1在人类黑色素瘤中优先表达，这与其他类型皮肤癌更有可能转移黑色素瘤的可能性是一致的。

ST3GAL 1基因沉默可减少黑色素瘤细胞在体外的迁移和侵袭，而ST3GAL 1的过表达则具有相反的作用。重要的是，我们发现ST3GAL1沉默在高侵袭性黑色素瘤细胞系中减少了能够进入血液中的黑色素瘤细胞(循环黑色素瘤细胞)的数量，并大大减少了转移到肺的转移。此外，ST3GAL 1的缺失还能抑制黑色素瘤细胞在多个器官中的播散，说明ST3GAL 1可能是黑色素瘤细胞进入血液、形成转移和在转移环境中生存所必需的。与ST3GAL1在黑色素瘤进展中的作用一致，ST3GAL1在转移瘤中的表达水平高于原发性黑色素瘤。我们的体外和体内数据显示了ST3GAL1在黑色素瘤进展中的几个促进作用，并提供了强有力的证据表明沉默ST3GAL1可以抑制体内的转移过程。这些效应似乎与生长优势无关，因为调节ST3GAL1的表达不会影响皮下黑色素瘤异种移植体的生长。

我们的数据还表明，过表达的ST3GAL1并不赋予黑色素瘤细胞更强的转移能力。这可以用内源ST3GAL1的水平足以解释其功能来解释。然而，我们发现过高表达ST3GAL 1的黑色素瘤细胞与对照组相比会产生更大的转移，提示高表达ST3GAL 1的黑色素瘤细胞可能有更好的机会在“宿主”组织中生存。

在此我们鉴定了转录因子SOX 2和GLI 1是ST3GAL1的阳性调节因子。这与之前的研究表明SOX 2和GLI 1都参与了黑色素瘤的进展是一致的。例如，SOX 2已被证明与黑色素瘤转移有关。35与痣相比在黑色素瘤中高表达36。此外，SOX 2还调节人黑色素瘤细胞的存活、自我更新和致瘤性。11,37并参与黑色素瘤肿瘤细胞的休眠调控38。SOx 2最近与一种具有较强耐药性和转移能力的侵袭性氧化肿瘤表型有关。39。除SOX 2外，GLI转录因子GLI 1和GLI 2可能参与黑色素瘤的进展和转移。40,41,42负责黑色素瘤起始细胞的维持1411。此外，我们的结果表明SOX 2和GLI 1之间存在着相互的转录调控。这一调控环可能进一步促进ST3GAL 1的转录激活。我们的体外数据支持SOX 2和GLI 1调节ST3GAL1的生物学相关性。事实上，ST3GAL1似乎介导SOX 2和GLI 1对黑色素瘤细胞的侵袭作用。此外，ST3GAL 1的异位表达还可挽救SOX 2和/或GLI 1缺失对黑色素瘤细胞侵袭力的影响。有趣的是，O-糖基合成途径的其他成员似乎都受到SOX 2和GLI 1的调控，提示这两种TFs可能通过诱导糖基化异常而促进黑色素瘤的进展。

四加成是一种翻译后修饰，广泛存在于多种蛋白质中，包括细胞表面受体和粘附分子。催化作用可提高蛋白质的稳定性和活性，以及蛋白质的组装。从转移细胞(A 375 M6)获得的黑色素瘤细胞系(A 375 M6)的MS分析确定了几种推测的ST3GAL1底物，其中含有与细胞迁移、运动、运动和粘附有关的蛋白质，所有这些过程都与肿瘤转移有关。这些蛋白包括酪氨酸激酶受体Axl、NGFR、EGFR、整合素β4和β-catenin.然而，只有Axl在其催化结构域被ST3GAL 1强烈激活。43。与此相一致，我们的数据表明Axl是ST3GAL1在人类黑色素瘤亚群中的主要下游介质，因为AXL的基因沉默可以挽救ST3GAL1异位表达引起的侵袭增加。一致地，我们的数据排除了EGFR参与介导ST3GAL1依赖的细胞迁移和侵袭性，缩小了NGFR在ST3GAL1依赖性黑色素瘤细胞迁移中的作用。然而，我们不能排除其他RTK或蛋白质在介导ST3GAL1功能中发挥作用的可能性。

Axl是受体酪氨酸激酶TAM家族的成员。Axl是通过其配体Gas6的结合而特异性激活的，它诱导Axl同聚以及胞质激酶结构域的多个酪氨酸残基的自磷酸化。44。我们的数据表明ST3GAL1是配体依赖的Axl二聚和随后在Tyr 702的自磷酸化所必需的。因此，我们推测唾液酸可能是增加Axl与其配体Gas6的亲和力的原因之一。事实上，在两个ig样结构域中已经发现了几个糖基化位点，用于配体结合。45。临床上，Axl的表达与预后不良有关，并增加了多个肿瘤的转移风险，这些肿瘤与肿瘤的增殖、存活、凋亡逃逸和侵袭以及干细胞表型的获取和耐药性有关。25。越来越多的证据表明，Axl是黑色素瘤侵袭性表型的标志，与缺乏微量邻苯二甲酸相关转录因子(Mitf)和表达emt信号有关。46,47。此外，Axl的表达也与对MAPK通路抑制剂的抗性有关。32,46,48，并已被报道通过阻止p53的激活，使黑色素瘤细胞对化疗失去敏感性。49。然而，axl对黑色素瘤细胞的侵袭有双重调节作用，因为抑制或过表达都能促进内异多巴的形成和活性，这是由于ERBB 3信号通路的代偿机制所致。31.

综上所述，我们的研究揭示了一个功能SOX 2/GLI1-ST3GAL1-Axl轴在黑色素瘤与肿瘤进展有关的亚群中，并突出了靶向ST3GAL1预防或治疗转移性黑色素瘤的治疗潜力。参与糖基化异常的生物合成机制有可能成为抗癌药物开发的一个有前途的靶点。50。然而，很少有这些药物具有转化为临床试验所需的特性。我们的工作为设计针对ST3GAL1的小分子提供了理论基础，并为药物重新定位以确定有效的ST3GAL1抑制剂用于治疗黑色素瘤的子集提供了理论依据。